Name: fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

हम मौली एस.C Gravett सहायक चर्चा और क्रायो-EM डेटा संग्रह के साथ मदद के लिए ABSL सुविधा कर्मचारियों के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । डेविड पी Klebl लीड्स विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित Astbury केंद्र में वेलकम ट्रस्ट 4 साल के पीएचडी कार्यक्रम पर पीएचडी के छात्र हैं । FEI टाइटन Krios माइक्रोस्कोप लीड्स विश्वविद्यालय (UoL ABSL पुरस्कार) और वेलकम ट्रस्ट (108466/Z/15/Z) द्वारा वित्त पोषित किया गया । इस काम को स्टीफन पी Muench (BB/P026397/1) के लिए एक BBSRC अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (AMR21-236078) और हावर्ड डी व्हाइट और Vitold Galkin से अमेरिका के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (171261) से हावर्ड डी व्हाइट को अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित ।

1. सिस्टम तैयार करना
नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल बताता है कि एक ही नमूने के ग्रिड कैसे तैयार किए जाएं। आमतौर पर, प्रत्येक नमूने या स्थिति के लिए न्यूनतम 2 दोहराने वाले ग्रिड तैयार किए जाते हैं। ते...

<ol>
	<li>Murphy, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotary+substates+of+mitochondrial+ATP+synthase+reveal+the+basis+of+flexible+F1-Fo+coupling.">Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling.</a> Science. 364, (2019).</li><li>Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+transitions+in+influenza+haemagglutinin+at+membrane+fusion+pH.">Structural transitions in influenza haemagglutinin at membrane fusion pH.</a> Nature. , 1-4 (2020).</li><li>Dance, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motion+on+ice.">Molecular motion on ice.</a> Nature Methods. , 1-5 (2020).</li><li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it.">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> Elife. 8, 42747 (2019).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM.">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15, 793-795 (2018).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behaviour+during+cryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behaviour during cryoEM grid preparation at different timescales.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Ravelli, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structures+from+sub-nl+volumes+using+pin-printing+and+jet+vitrification.">Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification.</a> Nature Communications. 11, 1-9 (2020).</li><li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts.">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> Journal of Structural Biology. 197, 220-226 (2017).</li><li>Razinkov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+vitrifying+samples+for+cryoEM.">A new method for vitrifying samples for cryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 195, 190-198 (2016).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+effective+microfluidic+spraying-plunging+method+for+high-resolution+single-particle+cryo-EM.">A fast and effective microfluidic spraying-plunging method for high-resolution single-particle cryo-EM.</a> Structure. 25, 663-670 (2017).</li><li>Ashtiani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+femtolitre+droplets+using+surface+acoustic+wave+based+atomisation+for+cryo-EM+grid+preparation.">Delivery of femtolitre droplets using surface acoustic wave based atomisation for cryo-EM grid preparation.</a> Journal of Structural Biology. 203, 94-101 (2018).</li><li>Rubinstein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shake-it-off:+a+simple+ultrasonic+cryo-EM+specimen-preparation+device.">Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).</li><li>M&#228;eots, M. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microfluidics+enables+kinetic+insight+from+time-resolved+cryo-EM.">Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM.</a> Nature Communications. 11, 1-14 (2020).</li><li>Kontziampasis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-EM+grid+preparation+device+for+time-resolved+structural+studies.">A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies.</a> IUCrJ. 6, (2019).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+deposition+onto+cryo-EM+grids:+from+sprays+to+jets+and+back.">Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).</li><li>White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+generation+apparatus+for+time-resolved+electron+cryo-microscopy+using+stepper+motors+and+electrospray.">A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray.</a> Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).</li><li>Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Complex Assembly. , 59-71 (2018).</li><li>Trebbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+liquid+jet+system+with+compatibility+for+atmospheric+and+high-vacuum+conditions.">Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions.</a> Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).</li><li>Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-grid+and+in-flow+mixing+for+time-resolved+Cryo-EM.">On-grid and in-flow mixing for time-resolved Cryo-EM.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2021).</li><li>He, S., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+reconstruction+in+RELION.">Helical reconstruction in RELION.</a> Journal of Structural Biology. 198, 163-176 (2017).</li><li>Millar, N. C., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limiting+rate+of+the+ATP-mediated+dissociation+of+actin+from+rabbit+skeletal+muscle+myosin+subfragment+1.">The limiting rate of the ATP-mediated dissociation of actin from rabbit skeletal muscle myosin subfragment 1.</a> FEBS Letters. 160, 141-148 (1983).</li><li>Kasas, S., Dumas, G., Dietler, G., Catsicas, S., Adrian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+cryoelectron+microscopy+specimens+revealed+by+high-speed+photographic+imaging.">Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging.</a> Journal of Microscopy. 211, 48-53 (2003).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading.">Defocus-dependent Thon-ring fading.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+flow+kinetics.">A beginner's guide to flow kinetics.</a> The Biochemist. 42, (2020).</li></ol>

इस काम में प्रोटोकॉल का उपयोग सीधे छिड़काव और टीआरईएम प्रयोगों द्वारा तेजी से ग्रिड तैयार करने के लिए किया जा सकता है। फास्ट ग्रिड तैयारी का उपयोग वायु जल इंटरफेस5के साथ कणों की बातचीत को कम क?...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Time resolved device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylic glass box</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital humidity/temperature controller</td>
			<td>THE20 digital humidity/temperature controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual rod pneumatic cylinder</td>
			<td>dual rod pneumatic cylinder TN 10x70</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP tubing</td>
			<td>Upchurch Scientific 1/16&#8221; O.D., 0.01&#39;&#39; I.D. FEP tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flangeless fittings</td>
			<td>Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td>12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass syringes</td>
			<td>Kloehn 250 &#181;L zero-dead volume</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidifier pump</td>
			<td>Interpret Aqua Air AP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid ethane container</td>
			<td>from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multistage regulator</td>
			<td>GASARC class 3 multistage regulator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative pressure tweezers</td>
			<td>Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Hantek 6022BE oscilloscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE tubing</td>
			<td>Scientific Commodities Inc. 0.043&#8221; O.D., 0.015&#8221; I.D. PE tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Mean Well GSM160A24-R7B</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Wanptek KPS305D power supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU tubing</td>
			<td>SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulator</td>
			<td>Norgren R72G-2GK-RMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide potentiometer</td>
			<td>PS100 slide potentiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solenoid valve</td>
			<td>SMC NVJ314M solenoid valve</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe drive pumps</td>
			<td>Kloehn V6 48K model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apoferritin from equine spleen</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A3660</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A2383</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-EM grids</td>
			<td>Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich E3889</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-actin</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glow-discharger</td>
			<td>Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, H7006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich, P1190</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M8266</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M1254</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, S9888</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal muscle myosin S1</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 1</td>
			<td>Spudich, J. A. &#38; Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 2</td>
			<td>White, H. &#38; Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) का क्षेत्र तेजी से नए हार्डवेयर और प्रसंस्करण एल्गोरिदम के साथ विकसित हो रहा है, जो उच्च संकल्प संरचनाओं और अधिक चुनौतीपूर्ण प्रणालियों के बारे में जानकारी का उत्पादन कर रहा है। क्रायो-ईएम के लिए नमूना तैयारी पारंपरिक ब्लॉटिंग सिस्टम को अधिस्थान करने के लिए विकसित किए जा रहे नए दृष्टिकोणों के साथ एक समान क्रांति के दौर से गुजर रही है। इनमें पीजो-इलेक्ट्रिक डिस्पेंसर का उपयोग, पिन प्रिंटिंग और प्रत्यक्ष छिड़काव शामिल हैं। इन घटनाओं के परिणामस्वरूप, ग्रिड तैयार करने की गति सेकंड से मिलीसेकंड तक जा रही है, विशेष रूप से समय-हल किए गए क्रायो-ईएम के क्षेत्र में नए अवसर प्रदान करती है, जहां प्रोटीन और सब्सट्रेट्स को डुबकी ठंड से पहले तेजी से मिलाया जा सकता है, अल्पकालिक मध्यवर्ती राज्यों को फंसाने। यहां हम विस्तार से, हमारे इन-हाउस समय-हल ईएम डिवाइस पर ग्रिड बनाने के लिए मानक फास्ट ग्रिड तैयारी और समय-हल किए गए प्रयोगों के लिए भी एक मानक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल के लिए 4 ग्रिड तैयार करने के लिए ≥ 2 मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता पर न्यूनतम लगभग 50 माइक्रोन नमूना की आवश्यकता होती है। नमूना आवेदन और ठंड के बीच देरी के रूप में 10 एमएस के रूप में कम हो सकता है । एक सीमा तेज गति से बर्फ की मोटाई में वृद्धि हुई है और ब्लॉटिंग विधि की तुलना में । हमें उम्मीद है कि यह प्रोटोकॉल दूसरों को अपने ग्रिड बनाने वाले उपकरणों और समय-हल किए गए प्रयोगों को डिजाइन करने में रुचि रखने वालों को डिजाइन करने में सहायता करेगा।

टेड के साथ फास्ट ग्रिड तैयारी फास्ट ग्रिड तैयारी के लिए एक परीक्षण नमूने के रूप में, हमने 30 एमएम एचईपीई, 150 एमएल एनएसीएल, पीएच 7.5 में 20 माइक्रोन पर घोड़े तिल्ली से एपोफेरिन का उपयोग किया है। 3.5 Å संकल्?...

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Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

यहां, हम तेजी से ग्रिड बनाने दोनों के लिए एक रैपिड ग्रिड बनाने वाले डिवाइस के उपयोग के लिए और समय-हल किए गए प्रयोगों का संचालन करने के लिए तेजी से मिश्रण और ठंड के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

समय-हल क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए फास्ट ग्रिड तैयारी

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

नमस्ते, और इस JoVE "वीडियो में आपका स्वागत है। हम आपको उस सेटअप से परिचित कराना चाहते हैं जो हमें यहां रैपिड ग्रिड बनाने के लिए मिला है, एक समय-हल किया गया अध्ययन जिसे हम लीड्स में विकसित कर रहे हैं। ध्यान रखें कि यह एक मानक प्रणाली नहीं है, लेकिन हम आशा करते हैं कि आपको उन सभी चीजों और मापदंडों का विस्तृत विवरण देकर जो हम करते हैं, आप अपनी प्रयोगशालाओं में समान प्रणालियां विकसित करने में सक्षम होंगे।डिवाइस का एक विस्तृत विवरण रिचमंड प्रोटोकॉल में दिया गया है। यहां, हम तेजी से ग्रिड तैयार करने और समय-हल ईएम के लिए एक कदम-दर-कदम गाइड देने जा रहे हैं। हमारे अनुभव में, प्रोटीन एकाग्रता मिलीलीटर या अधिक प्रति दो मिलीग्राम होनी चाहिए। प्रोटोकॉल के लिए न्यूनतम मात्रा में लगभग 50 माइक्रोलीटर की आवश्यकता होती है।डिवाइस चालू करें। इसके बाद कंट्रोल पीसी चालू करें और कंट्रोल सॉफ्टवेयर शुरू करें। प्रत्येक सिरिंज पंप पर शुरुआती बटन दबाकर सभी सिरिंज पंपों को शुरू करें।शक्तिशाली बिजली की आपूर्ति चालू करें, इसे नौ वोल्ट पर सेट करें, और ऑसिलोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर शुरू करें। स्प्रे उत्पन्न करने के लिए दबाव नाइट्रोजन गैस की आवश्यकता होती है। नाइट्रोजन सिलेंडर खोलें और दबाव को 2 बार सेट करें।सुनिश्चित करें कि सभी सिरिंज पंप वाल्व लोड स्थिति में हैं। ऐसा करने के लिए, नियंत्रण सॉफ्टवेयर में बांटना और फिर लोड करने के लिए वापस करने के लिए सभी वाल्व स्विच। सभी सीरिंज को शून्य पर सेट करें।सिस्टम में मौजूद किसी भी हवा के बुलबुले को इस स्तर पर हटा दिया जाना चाहिए। ऐसा करने के लिए सीरिंज को अनस्क्रूड करना पड़ सकता है, बुलबुले मैन्युअल रूप से हटाए जा सकते हैं, और सीरिंज फिर से घुड़सवार हो सकती है जब कोई और बुलबुले होते हैं। तरल हैंडलिंग प्रणाली आमतौर पर पानी में संग्रहीत की जाती है।नमूना लोड करने से पहले, सिस्टम बफर के साथ समतुल्य है। यह बफर की अधिकता के साथ ट्यूबिंग को धोकर किया जाता है। एक ट्यूब रखें जिसमें एक सिरिंज पर बफर के कम से कम 200 माइक्रोलीटर हों।ट्यूब के शीर्ष को संलग्न करने के लिए छेदा जाना चाहिए। नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सिरिंज के साथ 50 और सौ माइक्रोलीटर के बीच बफर की उपयुक्त मात्रा को एस्पिरेट करें। डिस्पेंस करने के लिए वाल्व एक स्विच करें।सिरिंज एक में तरल के सभी बांटना। लोड की स्थिति में वाल्व एक वापसी, और अगले धोने चक्र के लिए प्रणाली तैयार करने के लिए एक सिरिंज पर शुरुआती बटन दबाएं। ट्यूबिंग की पूरी तरह से धुलाई सुनिश्चित करने के लिए इन कदमों को आमतौर पर तीन बार दोहराया जाता है।इसके बाद, स्प्रे नोजल तैनात है। जल्दी से आगे बढ़नेवाला हाथ में एक ईएम ग्रिड रखें। स्प्रे नोजल के सामने ग्रिड की स्थिति।नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बफर बांटना। यदि नोजल और ग्रिड गठबंधन कर रहे हैं, तरल समय की एक विस्तारित अवधि के लिए छिड़काव के बाद जमा करना चाहिए । यदि आवश्यक हो, तो नोजल स्थिति को समायोजित करें और फिर फिर से जांच करें कि ग्रिड पर तरल कहां जमा होता है।इसके बाद, एथेन कप की स्थिति को समायोजित करें। चिमटी की नोक लगभग एथेन कप के केंद्र तक पहुंचना चाहिए। सभी सेटिंग्स सही हैं सुनिश्चित करने के लिए एक परीक्षण रन प्रदर्शन करें।आर्द्रता कक्ष बंद करें। सुनिश्चित करें कि प्लंजर का रास्ता स्पष्ट है। सिरिंज एक में एक ही रन के लिए आवश्यक बफर की मात्रा को एस्पिरेट करें।डिस्पेंस करने के लिए वाल्व एक स्विच करें। नियंत्रण सॉफ्टवेयर में रन दबाकर रन शुरू करें। जांच करें कि सिरिंज पंप एक चल रहा है, इस मामले में दो सेकंड, और ग्रिड एक उचित देरी के बाद गिर गया है, १.५ सेकंड यहां ।जब रन समाप्त हो जाता है, तो वांछित मूल्य के लिए प्लंजर आर्म पर दबाव निर्धारित करें। जल्दी से आगे बढ़नेवाला हाथ से दबाव जारी करने के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर में OK'in प्रेस करें। अब एथेन कप ठंडा है और तरल इथेन से भरा हुआ है।उपयोग से पहले ग्रिडों को चमक-डिस्चार्ज करें। एक ठेठ चमक-निर्वहन 0.1 मिलीबार हवा में 10 मिलीएम्प्स पर 90 सेकंड है। इसके बाद ट्यूबिंग को सैंपल के साथ बराबरी कर दी जाती है ।यदि उपलब्ध नमूना मात्रा कम है, तो ट्यूबिंग को केवल एक मृत मात्रा के साथ समतुल्य किया जा सकता है। नमूना एएसिरेट करें। आमतौर पर मृत मात्रा लगभग 30 माइक्रोलीटर होती है।डिस्पेंस करने के लिए वाल्व एक स्विच करें। टयूबिंग और नोजल के माध्यम से नमूना वितरित करें। फिर एक ही रन के लिए आवश्यक नमूने की मात्रा को एस्पिरेट करें।डिस्पेंस करने के लिए वाल्व एक स्विच करें। जांच करें कि सापेक्ष आर्द्रता वांछित मूल्य तक पहुंच गई है। हम आम तौर पर 60% या उससे अधिक पर ग्रिड तैयार करते हैं।इसमें कुछ मिनट लग सकते हैं। जल्दी से आगे बढ़नेवाला हाथ में एक चमक-छुट्टी ग्रिड पकड़े चिमटी रखें। गति माप के लिए तैयार, शुरू की स्थिति में शक्तिशाली स्लाइड रखें।ऑसिलोस्कोप सॉफ्टवेयर में गति माप के लिए ट्रिगर सेट करें। तरल इथेन कप रखें, और आर्द्रता कक्ष के करीब रखें। सुनिश्चित करें कि प्लंजर का रास्ता स्पष्ट है।कंट्रोल सॉफ्टवेयर में रन शुरू करें। जब रन समाप्त हो जाता है, तो जल्दी से आगे बढ़नेवाला हाथ से दबाव जारी करने के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर में OK'in दबाएं। आर्द्रता कक्ष खोलें, हाथ और चिमटी के बीच कनेक्शन ढीला करें।ग्रिड को तरल इथेन में रखते हुए जल्दी से आगे बढ़नेवाला हाथ ऊपर ले जाएं। फिर ग्रिड को तरल नाइट्रोजन और भंडारण में स्थानांतरित करें। ऑसिलोस्कोप माप को सहेजें।शक्तिशाली स्लाइडर और प्लंजर की स्थिति को मैन्युअल रूप से रीसेट करें। दोहराने ग्रिड तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल दोहराएं। समय-हल के प्रयोग इसी तरह किए जाते हैं।मिश्रण कदम में कमजोर पड़ने के कारण समय-हल किए गए प्रयोगों के लिए उच्च स्टॉक सांद्रता की आवश्यकता होती है। एक समय हल प्रयोग के लिए, तीनों सीरिंज का उपयोग करें। ट्यूबिंग सिरिंज पंपों और स्प्रे नोजल से जुड़ी हुई है।यहां इस्तेमाल होने वाले माइक्रोफ्लुइडिक स्प्रे नोजल में मिक्सिंग एलिमेंट भी होता है। ध्यान दें कि अब ट्यूब एक बड़ा मृत मात्रा दे देंगे और धोने संतुलन कदम अधिक बफर और नमूना की आवश्यकता होती है । बफर और नमूना के साथ सभी सीरिंज अलग से समतुल्य।आमतौर पर, सिरिंज एक नमूना A'और सीरिंज दो और तीन के लिए प्रयोग किया जाता है नमूना B'के बाद टयूबिंग समतुल्य है, लोड नमूना एक सिरिंज एक में और नमूना बी सीरिंज दो और तीन में । फिर, वाल्व एक से तीन को बांटना स्विच करें। कंट्रोल सॉफ्टवेयर में रन शुरू करें।ध्यान दें कि समय-हल किए गए प्रयोग के लिए एक अलग-अलग रन स्क्रिप्ट की आवश्यकता होती है. अलग-अलग समय की देरी को दो तरह से हासिल किया जा सकता है। प्लंजर गति को समायोजित करके, मिश्रण से ठंड में समय की देरी को बदला जा सकता है।एक तेज डुबकी की गति कम समय में देरी का कारण बन जाएगी। वैकल्पिक रूप से, स्प्रे नोजल की ऊर्ध्वाधर स्थिति को समायोजित करके स्प्रे इथेन दूरी को बदल दिया जाता है। दूरी बढ़ाने से काफी देरी होगी।कम आवर्धन पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में, एक ठेठ ग्रिड इस तरह दिखता है। पतली बर्फ के क्षेत्र, जैसा कि संकेत दिया गया है, डेटा अधिग्रहण के लिए उपयुक्त हैं। उच्च आवर्धन पर, कणों को स्पष्ट रूप से दिखाई देना चाहिए।एपोफेरिन जैसे परीक्षण नमूने के साथ, एक ग्रिड से सेट अपेक्षाकृत छोटा डेटा तीन से चार एंग्स्ट्रॉम संकल्प पर पुनर्निर्माण के लिए पर्याप्त है। समय-हल किए गए प्रयोगों के लिए, हम विभिन्न समय बिंदुओं या ग्रिडों से डेटा सेट एकत्र करते हैं। यह 3 डी वर्गीकरण के लिए डेटा गठबंधन और फिर अपने समय अंक के लिए वापस कणों का पता लगाने के लिए उपयोगी है ।इस तरह डेटा प्रतिक्रिया गतिज के बारे में संरचनात्मक जानकारी और जानकारी प्रदान कर सकता है। अंत में, हमें आशा है कि आप वीडियो का आनंद लिया । हमें उम्मीद है कि वीडियो के साथ जोव पेपर में विस्तृत विवरणों के साथ, आप रैपिड ग्रिड बनाने के माध्यम से अपने स्वयं के प्रयोगों का संचालन करने में सक्षम होंगे, जिसे उत्परिवर्तन से कुछ समस्याओं को कम करने या एयर-वॉटर इंटरफेस पर बातचीत में मदद करने के लिए दिखाया गया है, आपको उन कुछ गैर-संतुलन राज्यों को आजमाने और ट्रैप करने के लिए अपने स्वयं के समय-हल किए गए अध्ययनों को संचालित करने की आवश्यकता है।तो, हैप्पी ग्रिड बनाने।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

मानव लिपिड के प्रति संवेदनशील कटियन चैनल TRPC3 के एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा संरचनात्मक निर्धारण के लिए अभिव्यक्ति और शुद्धि

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए सैकरोमाइसेस सेर्विसिया की तैयारी और क्रायो-एफआईबी माइक्रोमशीनिंग

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी: नमूना से संरचना तक

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पूरे सेल क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी वर्कफ़्लो के भीतर प्रत्यक्ष सेल पोजिशनिंग के लिए

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

एक मजबूत एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) क्रायोस्पार्क, RELION, और Scipion के साथ प्रसंस्करण वर्कफ़्लो

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संरचनात्मक निर्धारण के लिए डीएनए मरम्मत कारकों के साथ जटिल न्यूक्लियोसोम कोर कणों की तैयारी

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सूक्ष्मनलिकाएं-प्रोटीन परिसरों का अध्ययन करने के लिए स्तनधारी कोशिकाओं से संशोधित सूक्ष्मनलिकाएं निकालना

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड के लिए मोनोलेयर ग्राफीन का अनुप्रयोग

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...