Name: fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Molly S.C. Gravett per le discussioni utili e lo staff della struttura ABSL per l'aiuto con la raccolta dei dati crio-EM. David P. Klebl è uno studente di dottorato del programma di dottorato di 4 anni Wellcome Trust presso l'Astbury Centre finanziato dall'Università di Leeds. I microscopi FEI Titan Krios sono stati finanziati dall'Università di Leeds (premio UoL ABSL) e wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione BBSRC a Stephen P. Muench (BB / P026397 / 1) e supportato da sovvenzioni di ricerca a Howard D. White dell'American Heart Association (AMR21-236078) e Howard D. White e Vitold Galkin del National Institutes of Health degli Stati Uniti (171261).

1. Preparazione del sistema
Nota : il protocollo seguente descrive come preparare le griglie di un singolo campione. Di solito, vengono preparate almeno 2 griglie di replica per ogni campione o condizione. Per velocità di immersione più elevate (meno di ~ 20 ms di ritardo), 3 o 4 griglie di replica sono in genere preparate per tenere conto di un numero ridotto di aree di ghiaccio sottile.
<ol><li>Diluire il campione proteico alla concentrazione target nel tampone desiderato. Tipicamente, l...

<ol>
	<li>Murphy, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotary+substates+of+mitochondrial+ATP+synthase+reveal+the+basis+of+flexible+F1-Fo+coupling.">Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling.</a> Science. 364, (2019).</li><li>Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+transitions+in+influenza+haemagglutinin+at+membrane+fusion+pH.">Structural transitions in influenza haemagglutinin at membrane fusion pH.</a> Nature. , 1-4 (2020).</li><li>Dance, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motion+on+ice.">Molecular motion on ice.</a> Nature Methods. , 1-5 (2020).</li><li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it.">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> Elife. 8, 42747 (2019).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM.">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15, 793-795 (2018).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behaviour+during+cryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behaviour during cryoEM grid preparation at different timescales.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Ravelli, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structures+from+sub-nl+volumes+using+pin-printing+and+jet+vitrification.">Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification.</a> Nature Communications. 11, 1-9 (2020).</li><li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts.">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> Journal of Structural Biology. 197, 220-226 (2017).</li><li>Razinkov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+vitrifying+samples+for+cryoEM.">A new method for vitrifying samples for cryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 195, 190-198 (2016).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+effective+microfluidic+spraying-plunging+method+for+high-resolution+single-particle+cryo-EM.">A fast and effective microfluidic spraying-plunging method for high-resolution single-particle cryo-EM.</a> Structure. 25, 663-670 (2017).</li><li>Ashtiani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+femtolitre+droplets+using+surface+acoustic+wave+based+atomisation+for+cryo-EM+grid+preparation.">Delivery of femtolitre droplets using surface acoustic wave based atomisation for cryo-EM grid preparation.</a> Journal of Structural Biology. 203, 94-101 (2018).</li><li>Rubinstein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shake-it-off:+a+simple+ultrasonic+cryo-EM+specimen-preparation+device.">Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).</li><li>M&#228;eots, M. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microfluidics+enables+kinetic+insight+from+time-resolved+cryo-EM.">Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM.</a> Nature Communications. 11, 1-14 (2020).</li><li>Kontziampasis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-EM+grid+preparation+device+for+time-resolved+structural+studies.">A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies.</a> IUCrJ. 6, (2019).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+deposition+onto+cryo-EM+grids:+from+sprays+to+jets+and+back.">Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).</li><li>White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+generation+apparatus+for+time-resolved+electron+cryo-microscopy+using+stepper+motors+and+electrospray.">A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray.</a> Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).</li><li>Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Complex Assembly. , 59-71 (2018).</li><li>Trebbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+liquid+jet+system+with+compatibility+for+atmospheric+and+high-vacuum+conditions.">Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions.</a> Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).</li><li>Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-grid+and+in-flow+mixing+for+time-resolved+Cryo-EM.">On-grid and in-flow mixing for time-resolved Cryo-EM.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2021).</li><li>He, S., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+reconstruction+in+RELION.">Helical reconstruction in RELION.</a> Journal of Structural Biology. 198, 163-176 (2017).</li><li>Millar, N. C., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limiting+rate+of+the+ATP-mediated+dissociation+of+actin+from+rabbit+skeletal+muscle+myosin+subfragment+1.">The limiting rate of the ATP-mediated dissociation of actin from rabbit skeletal muscle myosin subfragment 1.</a> FEBS Letters. 160, 141-148 (1983).</li><li>Kasas, S., Dumas, G., Dietler, G., Catsicas, S., Adrian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+cryoelectron+microscopy+specimens+revealed+by+high-speed+photographic+imaging.">Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging.</a> Journal of Microscopy. 211, 48-53 (2003).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading.">Defocus-dependent Thon-ring fading.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+flow+kinetics.">A beginner's guide to flow kinetics.</a> The Biochemist. 42, (2020).</li></ol>

I protocolli in questo lavoro possono essere utilizzati per la preparazione rapida della griglia mediante spruzzatura diretta ed esperimenti TrEM. La preparazione rapida della griglia può essere utilizzata per ridurre le interazioni delle particelle con l'interfaccia aria-acqua5. Le principali limitazioni sono la concentrazione del campione disponibile e lo spessore del ghiaccio sulla griglia. Entro questi limiti e a condizione che la qualità del campione sia buona, il protocollo produce griglie...

Sfondo I recenti sviluppi della microscopia crioeletletnica (cryo-EM) hanno permesso studi strutturali di sistemi sempre più complessi ad alta risoluzione. Con poche eccezioni, tali studi sono stati limitati a macromolecole biologiche all'equilibrio1 o reazioni relativamente lente2. Molti processi in vivo avvengono su una scala temporale più veloce (millisecondi) e c'è un crescente interesse per la crio-EM risolta nel tempo (TrEM) su queste scale temporali3. Tuttavia, la preparazione convenzionale del campione crio-EM con il metodo di blotting è troppo lenta per il millisecondo TrEM.
Il metodo di blotting ha altre limitazioni oltre alla scarsa risoluzione temporale. Le proteine e i complessi proteici possono soffrire di denaturazione o orientamento preferito sulle griglie4. La riduzione del tempo di esposizione all'interfaccia aria-acqua durante la preparazione del campione ha dimostrato di mitigare l'orientamento preferito e la denaturazione delle proteine5,6. Pertanto, la preparazione rapida della griglia non solo consente un trEM al millisecondo, ma può anche migliorare la qualità della griglia.
Attualmente, ci sono tre diversi approcci alla preparazione automatizzata della rete. Il primo approccio utilizza un perno o capillare che contiene una piccola quantità di campione. Dopo aver stabilito il contatto tra il liquido e la superficie della griglia, il campione viene "scritto" sulla griglia7,8. Il processo di applicazione di esempio è relativamente lento e richiede alcuni secondi. Un approccio alternativo utilizza la generazione controllata di goccioline da un distributore piezoelettrico e griglie autoaspiranti9. Ciò consente tempi di erogazione più rapidi per congelare, ma è ancora limitato dalla velocità delle goccioline e dell'assorbimento (attualmente raggiunge i 54 ms). L'approccio più veloce finora è l'approccio a spruzzo diretto, in cui il campione viene atomizzato in un ugello spray e le goccioline piccole (~ 10 - 20 μm) e veloci (> 5 m / s) si diffondono a contatto con la griglia crio-EM. Lo spray campione può essere generato attraverso diversi modi come atomizzatori di sabbiatura ad aria, onde acustiche di superficie o umidificatori ad ultrasuoni10,11,12,13. Nella nostra esperienza, lo spessore del ghiaccio con l'approccio a spruzzo diretto è maggiore, ma la spruzzatura diretta consente di congelare i tempi di erogazione < 10 ms.
Questo protocollo descrive passo dopo passo come un dispositivo EM a risoluzione temporale (TED) dotato di un ugello a spruzzo microfluidico può essere utilizzato per preparare le griglie su una scala temporale rapida14,15. Il dispositivo è stato utilizzato per preparare griglie con un tempo di ritardo minimo di 6 ms tra l'applicazione del campione e il congelamento e per miscelare e congelare rapidamente due campioni. Il design del TED si basa su una versione precedente16 ed è simile ad altri dispositivi cryo-EM risolti nel tempo basati su spray17.
Innanzitutto, vengono descritte le quattro parti principali della configurazione TED. Il cuore del TED è l'unità di gestione dei liquidi, che è responsabile dell'aspirazione e dell'erogazione dei campioni. Uno stantuffo pneumatico sposta la griglia attraverso lo spruzzo nell'etano liquido. La generazione dello spray si ottiene con ugelli di spruzzatura microfluidici e il congelamento viene effettuato in un contenitore di etano liquido, che viene descritto brevemente. Infine, vengono evidenziate le funzionalità aggiuntive per controllare l'ambiente della griglia, in particolare l'umidità. Questo è seguito da protocolli dettagliati per il funzionamento del dispositivo e per la conduzione di esperimenti TrEM. Vengono forniti risultati rappresentativi per una rapida preparazione della griglia e un semplice esperimento TrEM.
Configurazione sperimentale
L'unità di trattamento dei liquidi Il sistema di trattamento dei liquidi del TED è formato da tre pompe di azionamento a siringa ("pompe 1 - 3", ciascuna dotata di una valvola rotativa (Figura 1). Un alimentatore fornisce pompe 1 - 3 con 24 V DC. La comunicazione con il software di controllo (scritto in Visual Basic e C++) avviene tramite un'interfaccia RS232 per pompare 1. I comandi sono distribuiti attraverso le porte di espansione I/O seriali dalla pompa 1 alle pompe 2-3. Le pompe 1-3 sono dotate di siringhe di vetro ('siringhe 1-3', qui usiamo siringhe da 250 μL/zero volume morto). Ogni valvola ha due posizioni, 'load' e 'dispense'. La posizione di "carico" viene utilizzata per aspirare il campione nella siringa. Un pezzo corto (~ 3 - 4 cm) di tubi in Flangia IN F.D. da 1/16" O.D., 0,01′′ I.D. FEP è collegato tramite raccordi senza flangia ETFE/ETFE alla posizione di "carico" delle valvole 1-3. Questo breve pezzo di tubo raggiunge il serbatoio del campione (in genere un tubo di plastica da 1,5 ml o 0,5 ml). La posizione "dispense" porta all'ugello di spruzzatura. Il collegamento tra l'uscita 'dispense' e l'ugello spray è costituito da tubi in PE (~ 20-30 cm di lunghezza, 0,043" O.D., 0,015" I.D.), con un breve pezzo di tubo manicotto (~ 0,5 cm) e raccordi senza flangia ETFE/ETFE.
Lo stantuffo pneumatico Il TED utilizza uno stantuffo pneumatico per accelerare la griglia e spostarla attraverso lo spray campione nel contenitore di etano liquido. Le pinzette a pressione negativa tengono la griglia, avvitata in un supporto costruito in casa che è montato su un cilindro pneumatico a doppia asta (Figura 2A).
La pressione viene fornita da una grande bombola di azoto gassoso (taglia W), dotata di un regolatore multistadio (0 - 10 bar, "pressione principale"). Il tubo flessibile in PVC rinforzato (12 mm O.D.) collega il regolatore a un collettore a 12 porte in cui l'azoto pressurizzato viene erogato all'ugello e allo stantuffo pneumatico. Il flusso di gas attraverso l'ugello è costante, regolato direttamente sul cilindro di azoto (pressione principale). Il collegamento all'ugello è realizzato con tubo in PU (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), un breve pezzo di tubo in PE (~ 8 cm di lunghezza, 0,043" O.D., 0,015" I.D.) e appositi connettori. La pressione sullo stantuffo pneumatico è controllata attraverso un'elettrovalvola. Il tubo in PU (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) collega l'elettrovalvola con un regolatore e lo stantuffo pneumatico, per consentire una ridotta pressione di immersione (≤ pressione principale). L'elettrovalvola è controllata da computer. Una panoramica schematica dell'installazione è fornita nella Figura 2B.
Si noti che con questa configurazione la pressione di immersione è sempre uguale o inferiore alla pressione del gas spray (pressione principale). Tuttavia, la configurazione può essere facilmente modificata incorporando un secondo regolatore a monte dell'ugello di spruzzatura per consentire velocità di immersione più elevate a bassa pressione del gas di spruzzatura. Alte pressioni (>> 2 bar) possono danneggiare l'ugello di spruzzatura PDMS.
ATTENZIONE: Questo è un sistema pressurizzato e la "pressione principale" deve essere sempre < 7 bar.
Le pressioni comprese tra 0,5 e 2 bar sono tipicamente utilizzate per lo stantuffo pneumatico e mostrano una relazione approssimativamente lineare tra pressione e velocità (nella posizione verticale dello spruzzo). Le velocità di immersione sono misurate con un oscilloscopio, collegato in linea con un potenziometro a scorrimento (10 kΩ) e in parallelo con un resistore da 2 kΩ (Figura 2C). Un alimentatore fornisce il potenziometro con 9 V DC. Mentre la velocità approssimativa del tuffo viene impostata prima dell'esperimento impostando la pressione del tuffo, il potenziometro fornisce una lettura precisa della velocità dopo l'esperimento.
Ugelli spray e contenitore di etano liquido La fabbricazione e il funzionamento di ugelli virtuali gasdinamici per la consegna di campioni a spruzzo sono stati descritti altrove in dettaglio15. Come descritto sopra, le uscite "erogate" delle valvole 1-3 sono collegate alle prese liquide dell'ugello (Figura 3A). Il gas spray pressurizzato è collegato all'ingresso del gas dell'ugello. Gli assi di aspirazione negli ugelli di spruzzatura PDMS sono tali che i tubi in PE O.D. da 0,043" possono essere utilizzati direttamente senza la necessità di raccordi. Il nostro design dell'ugello contiene una geometria "jet-in-jet" per la miscelazione di due campioni, simile al dispositivo descritto nel rif.18. Uno schema del progetto è mostrato in Figura 3B, un'immagine microscopica di un ugello è mostrata in Figura 3C. Il layout del dispositivo microfluidico richiede l'uso di tre siringhe per mescolare due campioni. L'ugello di spruzzatura è in genere posizionato a una distanza di 1-1,5 cm dalla griglia (durante l'applicazione del campione).
Usiamo l'etano liquido come criogeno, in un contenitore liquido di etano / azoto come utilizzato per il metodo di blotting standard. Il posizionamento verticale della tazza di etano liquido si ottiene con una piattaforma elevata da laboratorio.
Controllo dell'ambiente di spruzzatura e griglia Lo stantuffo e l'ugello di spruzzatura sono contenuti all'interno di una scatola in PMMA (vetro acrilico) costruita su misura con una doppia porta(Figura 4A). L'elevata umidità relativa all'interno della scatola è ottenuta da un sistema di umidificazione dell'aria sul retro del TED (Figura 4B). L'aria viene fornita da una pompa e immessa in un primo contenitore da 10 "(tipicamente utilizzato per la purificazione dell'acqua sotto il lavandino). Il contenitore è riempito con un basso (~ 5-10 cm) livello di acqua e ospita anche un'unità umidificatore. L'alimentazione di rete dell'umidificatore è controllata da un regolatore digitale di umidità/temperatura e da un sensore di umidità/temperatura situato all'interno della scatola di vetro acrilico. Il controller è impostato per spegnere la pompa quando l'umidità relativa raggiunge ≥ 90 %. L'aria umidificata dal primo contenitore viene pompata attraverso un diffusore, immersa in acqua in un secondo contenitore da 10 "e quindi entra nella scatola di vetro acrilico.
ATTENZIONE: Poiché il campione è aerosolizzato nell'ugello spray, i campioni biologici o chimici pericolosi non sono adatti come campioni.
La sequenza di esecuzione Il pulsante Esegui script nel software di controllo avvia la sequenza di esecuzione. Questa sequenza di comandi può essere predefinita in un file di script e modificata tramite il software. Le variabili più importanti sono spiegate qui:
Velocità di spruzzatura: la velocità di spruzzatura determina la portata del liquido utilizzata dalla pompa della siringa. La portata può essere calcolata come segue: I motori della pompa a siringa utilizzati qui hanno una dimensione del gradino fissa. L'intera gamma della pompa è suddivisa in 48.000 gradini. Il secondo fattore importante è il volume della siringa. In genere utilizziamo siringhe da 250 μL. La velocità di spruzzatura nel software di controllo è impostata come numero di passi/secondo. Una velocità di spruzzatura di 1000 passi/secondo corrisponde a:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62199/62199eq01.jpg">
Volume di spruzzo: il volume di spruzzo determina il volume totale da spruzzare. Pertanto, determina anche la durata dello spray. Il volume di spruzzo nel software di controllo è impostato su una serie di passaggi. Un volume di spruzzo di 2000 passi, ad una velocità di spruzzo di 1000 passi/secondo, porta ad una durata di spruzzo di 2 s e un volume totale di 10,4 μL.
Tempo di pre-spruzzatura: questa variabile definisce il tempo che tra l'inizio dello spruzzo e l'immersione. È importante scegliere il tempo di ritardo in modo tale che lo spray abbia il tempo sufficiente per stabilizzarsi prima di immergere la griglia. Di solito, lo spray viene somministrato 1,5 - 4 s per stabilizzarsi prima che la griglia venga immersa. Lo spray viene mantenuto fino a quando la griglia non si è spostata. Di solito, il flusso di liquido (e quindi lo spray) viene interrotto da 0,5 a 1 s dopo che la griglia è stata immersa. Utilizzando una velocità di spruzzatura di 1000 passi / s e un volume di spruzzo di 2000 passi, un tempo tipico di pre-spruzzatura è di 1,5 s, ad esempio.
Una sequenza esemplare di comandi è mostrata nella Figura 5A, la posizione della griglia nel tempo è illustrata nella Figura 5B.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Time resolved device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylic glass box</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital humidity/temperature controller</td>
			<td>THE20 digital humidity/temperature controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual rod pneumatic cylinder</td>
			<td>dual rod pneumatic cylinder TN 10x70</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP tubing</td>
			<td>Upchurch Scientific 1/16&#8221; O.D., 0.01&#39;&#39; I.D. FEP tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flangeless fittings</td>
			<td>Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td>12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass syringes</td>
			<td>Kloehn 250 &#181;L zero-dead volume</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidifier pump</td>
			<td>Interpret Aqua Air AP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid ethane container</td>
			<td>from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multistage regulator</td>
			<td>GASARC class 3 multistage regulator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative pressure tweezers</td>
			<td>Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Hantek 6022BE oscilloscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE tubing</td>
			<td>Scientific Commodities Inc. 0.043&#8221; O.D., 0.015&#8221; I.D. PE tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Mean Well GSM160A24-R7B</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Wanptek KPS305D power supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU tubing</td>
			<td>SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulator</td>
			<td>Norgren R72G-2GK-RMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide potentiometer</td>
			<td>PS100 slide potentiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solenoid valve</td>
			<td>SMC NVJ314M solenoid valve</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe drive pumps</td>
			<td>Kloehn V6 48K model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apoferritin from equine spleen</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A3660</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A2383</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-EM grids</td>
			<td>Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich E3889</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-actin</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glow-discharger</td>
			<td>Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, H7006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich, P1190</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M8266</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M1254</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, S9888</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal muscle myosin S1</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 1</td>
			<td>Spudich, J. A. &#38; Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 2</td>
			<td>White, H. &#38; Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy

Il campo della microscopia crioeletletnica (cryo-EM) si sta rapidamente sviluppando con nuovi hardware e algoritmi di elaborazione, producendo strutture a risoluzione più elevata e informazioni su sistemi più impegnativi. La preparazione dei campioni per la crio-EM sta subendo una rivoluzione simile con nuovi approcci in fase di sviluppo per sostituire i tradizionali sistemi di blotting. Questi includono l'uso di distributori piezoelettrici, la stampa a spillo e la spruzzatura diretta. Come risultato di questi sviluppi, la velocità di preparazione della griglia sta passando da secondi a millisecondi, offrendo nuove opportunità, specialmente nel campo della crio-EM risolta nel tempo in cui proteine e substrati possono essere rapidamente miscelati prima del congelamento a immersione, intrappolando stati intermedi di breve durata. Qui descriviamo, in dettaglio, un protocollo standard per la realizzazione di griglie sul nostro dispositivo EM interno con risoluzione temporale sia per la preparazione della griglia veloce standard che per gli esperimenti risolti nel tempo. Il protocollo richiede un minimo di circa 50 μL di campione a concentrazioni di ≥ 2 mg/mL per la preparazione di 4 griglie. Il ritardo tra l'applicazione del campione e il congelamento può essere di appena 10 ms. Una limitazione è l'aumento dello spessore del ghiaccio a velocità più elevate e rispetto al metodo di blotting. Speriamo che questo protocollo aiuti gli altri a progettare i propri dispositivi per la creazione di griglie e coloro che sono interessati a progettare esperimenti risolti nel tempo.

Preparazione rapida della griglia con il TED Come campione di prova per la preparazione rapida della griglia, abbiamo utilizzato apofertitina dalla milza equina a 20 μM in 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5. Una ricostruzione con risoluzione di 3,5 Å è stata ottenuta da 690 micrografie come descritto nel rif.15 (Figura 7A). La gamma di sfocatura è stata scelta in modo che le particelle possano essere facilmente identificate nelle immagini grezze ...

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Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'uso di un dispositivo di creazione rapida della griglia sia per la creazione rapida della griglia che per la miscelazione e il congelamento rapidi per condurre esperimenti risolti nel tempo.

Preparazione rapida della griglia per la microscopia crioeletletnica risolta nel tempo

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Ciao, e benvenuto in questo video di JoVE. Vogliamo presentarvi la configurazione che abbiamo qui per la creazione rapida della griglia, uno studio risolto nel tempo che stiamo sviluppando a Leeds. Tieni presente che questo non è un sistema standard, ma speriamo che dandoti un resoconto dettagliato di tutte le cose e dei parametri che facciamo, sarai in grado di sviluppare sistemi simili nei tuoi laboratori.Una descrizione dettagliata del dispositivo è fornita nel protocollo Richmond. Qui, forniremo una guida passo-passo per la preparazione rapida della griglia e l'EM risolta nel tempo. Nella nostra esperienza, la concentrazione di proteine dovrebbe essere di due milligrammi per millilitro o superiore. Il protocollo richiede un volume minimo di circa 50 microlitri.Accendi il dispositivo. Quindi accendere il PC di controllo e avviare il software di controllo. Inizializzare tutte le pompe a siringa premendo il pulsante di inizializzazione su ciascuna pompa a siringa.Accendere l'alimentatore del potenziometro, impostarlo su nove volt e avviare il software di controllo dell'oscilloscopio. Il gas azoto pressurizzato è necessario per generare lo spray. Aprire il cilindro di azoto e impostare la pressione su 2 bar.Assicurarsi che tutte le valvole della pompa a siringa siano in posizione di carico. Per fare ciò, commutare tutte le valvole per erogare nel software di controllo e quindi tornare a caricare. Impostare tutte le siringhe a zero.Eventuali bolle d'aria presenti nel sistema devono essere rimosse in questa fase. Per fare ciò le siringhe potrebbero dover essere svitate, le bolle rimosse manualmente e le siringhe montate di nuovo quando non contengono più bolle. Il sistema di gestione dei liquidi viene solitamente immagazzinato in acqua.Prima di caricare il campione, il sistema viene bilanciato con il buffer. Questo viene fatto lavando il tubo con un eccesso di buffer. Posizionare un tubo contenente almeno 200 microlitri di tampone su una siringa.La parte superiore del tubo deve essere forata per fissarlo. Aspirare una quantità adeguata di tampone, tra 50 e un centinaio di microlitri con siringa uno utilizzando il software di controllo. Interruttore valvola uno per erogare.Erogare tutto il liquido in una siringa uno. Riportare la valvola uno alla posizione di carico e premere il pulsante di inizializzazione sulla siringa uno per preparare il sistema per il ciclo di lavaggio successivo. Questi passaggi vengono solitamente ripetuti tre volte per garantire un lavaggio accurato del tubo.Successivamente, viene posizionato l'ugello di spruzzatura. Posizionare una griglia EM nel braccio di immersione. Posizionare la griglia davanti all'ugello di spruzzatura.Erogare il buffer utilizzando il software di controllo. Se l'ugello e la griglia sono allineati, il liquido dovrebbe accumularsi dopo la spruzzatura per un lungo periodo di tempo. Se necessario, regolare la posizione dell'ugello e quindi controllare nuovamente dove il liquido si accumula sulla griglia.Quindi, regolare la posizione della tazza di etano. La punta delle pinzette dovrebbe raggiungere approssimativamente il centro della tazza di etano. Eseguire un'esecuzione di test per assicurarsi che tutte le impostazioni siano corrette.Chiudere la camera di umidità. Assicurarsi che il percorso dello stantuffo sia chiaro. Aspirare il volume di tampone necessario per una singola corsa in una siringa.Interruttore valvola uno per erogare. Avviare la corsa premendo run'in nel software di controllo. Controllare che la pompa della siringa uno si muova, due secondi in questo caso, e che la griglia sia immersa dopo un ritardo appropriato, 1,5 secondi qui.Al termine della corsa, impostare la pressione sul braccio dello stantuffo sul valore desiderato. Premere OK'in nel software di controllo per rilasciare la pressione dal braccio di immersione. Ora la tazza di etano è fresca e piena di etano liquido.Glow-scarica le griglie prima dell'uso. Una tipica scarica di bagliore è di 90 secondi a 10 milliampere in 0,1 millibar di aria. Il tubo viene quindi bilanciato con il campione.Se il volume del campione disponibile è basso, il tubo può essere bilanciato con un solo volume morto. Aspirare il campione. In genere il volume morto è di circa 30 microlitri.Interruttore valvola uno per erogare. Erogare il campione attraverso tubi e ugelli. Quindi aspirare la quantità di campione necessaria per una singola esecuzione.Interruttore valvola uno per erogare. Verificare che l'umidità relativa abbia raggiunto il valore desiderato. In genere prepariamo le griglie al 60% o superiore.Questa lattina può richiedere alcuni minuti. Posizionare le pinzette tenendo una griglia a scarica luminosa nel braccio di immersione. Posizionare la slitta del potenziometro nella posizione di partenza, pronta per la misurazione della velocità.Impostare il trigger per la misurazione della velocità nel software dell'oscilloscopio. Posizionare la tazza di etano liquido e vicino alla camera di umidità. Assicurarsi che il percorso dello stantuffo sia chiaro.Avviare l'esecuzione nel software di controllo. Al termine della corsa, premere OK'in nel software di controllo per rilasciare la pressione dal braccio di immersione. Aprire la camera di umidità, allentare la connessione tra braccio tuffante e pinzette.Spostare verso l'alto il braccio di immersione mantenendo la griglia in etano liquido. Quindi trasferire le griglie all'azoto liquido e allo stoccaggio. Salvare la misurazione dell'oscilloscopio.Reimpostare manualmente la posizione del cursore del potenziometro e dello stantuffo. Ripetere il protocollo per preparare le griglie di replica. Gli esperimenti risolti nel tempo vengono eseguiti in modo simile.Sono necessarie concentrazioni di stock più elevate per gli esperimenti risolti nel tempo a causa della diluizione nella fase di miscelazione. Per un esperimento risolto nel tempo, utilizzare tutte e tre le siringhe. Il tubo è fissato alle pompe a siringa e all'ugello di spruzzatura.L'ugello di spruzzatura microfluidica utilizzato qui contiene anche un elemento di miscelazione. Si noti che i tubi più lunghi daranno un volume morto maggiore e le fasi di bilanciamento del lavaggio richiedono più tampone e campione. Equilibrare tutte le siringhe con tampone e campione separatamente.Tipicamente, la siringa uno viene utilizzata per il campione A e le siringhe due e tre vengono utilizzate per il campione B'Dopo che il tubo è stato equilibrato, caricare il campione A nella siringa uno e il campione B nelle siringhe due e tre. Quindi, passare le valvole da una a tre per erogare. Avviare l'esecuzione nel software di controllo.Si noti che è necessario uno script di esecuzione diverso per un esperimento risolto nel tempo. Ritardi diversi possono essere raggiunti in due modi. Regolando la velocità dello stantuffo, è possibile modificare il ritardo temporale dalla miscelazione al congelamento.Una maggiore velocità di immersione porterà a un ritardo temporale più breve. In alternativa, la distanza dell'etano di spruzzatura viene modificata regolando la posizione verticale dell'ugello di spruzzatura. L'aumento della distanza comporterà un ritardo temporale più lungo.Nel microscopio elettronico a basso ingrandimento, una griglia tipica assomiglia a questa. Le aree di ghiaccio sottile, come indicato, sono adatte per l'acquisizione dei dati. A ingrandimenti più elevati, le particelle dovrebbero essere chiaramente visibili.Con un campione di prova come l'apoferrittina, un set di dati relativamente piccolo da una singola griglia è sufficiente per una ricostruzione con una risoluzione di tre o quattro angstrom. Per gli esperimenti risolti nel tempo, raccogliamo set di dati da diversi punti temporali o griglie. È utile combinare i dati per la classificazione 3D e quindi tracciare le particelle fino ai loro punti temporali.In questo modo i dati possono fornire informazioni strutturali e informazioni sulla cinetica di reazione. In conclusione, speriamo che il video ti sia piaciuto. Speriamo che con le descrizioni dettagliate nel documento JoVE insieme al video, sarai in grado di condurre i tuoi esperimenti tramite la creazione rapida della griglia, che ha dimostrato di alleviare alcuni dei problemi derivanti dalla mutazione o di aiutare con le interazioni all'interfaccia aria-acqua, tutto ciò di cui hai bisogno per condurre i tuoi studi risolti nel tempo per cercare di intrappolare alcuni di quegli stati di non equilibrio.Quindi, felice creazione della griglia.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Ricerca

Biochimica

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Espressione e purificazione di TRPC3 la scanalatura del catione del lipido sensibili umani per determinazione strutturale di singola particella cRIO-microscopia elettronica

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparazione e microlavorazione Cryo-FIB di Saccharomyces cerevisiae per Tomografia Crioeletnico

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Microscopia crioelettronica a particella singola: dal campione alla struttura

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Griglie per dirigere il posizionamento delle cellule all'interno dei flussi di lavoro della tomografia crioelettronica a cellule intere

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Un robusto flusso di lavoro di elaborazione crioelettronica a particella singola (cryo-EM) con crioSPARC, RELION e Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Preparazione di particelle nucleosomiche complessate con fattori di riparazione del DNA per la determinazione strutturale della microscopia crioelettronica

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Estrazione di microtubuli modificati da cellule di mammifero per studiare complessi microtubulo-proteine mediante microscopia crioelettronica

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Applicazione del grafene monostrato alle griglie di microscopia crioelettronica per la determinazione della struttura ad alta risoluzione

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...