Name: fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

Vi vil takke Molly S.C. Gravett for nyttige diskusjoner og ABSL-anleggets ansatte for hjelp med cryo-EM-datainnsamling. David P. Klebl er stipendiat ved Wellcome Trust 4-årig ph.d.-program i Astbury-senteret finansiert av University of Leeds. FEI Titan Krios mikroskoper ble finansiert av University of Leeds (UoL ABSL award) og Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Dette arbeidet ble finansiert av et BBSRC-tilskudd til Stephen P. Muench (BB/P026397/1) og støttet av forskningsstipend til Howard D. White fra American Heart Association (AMR21-236078) og Howard D. White og Vitold Galkin fra U.S. National Institutes of Health (171261).

1. Klargjøring av systemet
MERK: Følgende protokoll beskriver hvordan du klargjør rutenett for en enkelt prøve. Vanligvis forberedes minst 2 replikeringsrutenett for hver prøve eller betingelse. For raskere lave hastigheter (mindre enn ~ 20 ms tidsforsinkelse), er 3 eller 4 replikeringsgitter vanligvis forberedt på å ta hensyn til et redusert antall tynne isområder.
<ol><li>Fortynn proteinprøven til målkonsentrasjonen i ønsket buffer. Vanligvis fungerer endelige konsentrasjoner ?...

<ol>
	<li>Murphy, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotary+substates+of+mitochondrial+ATP+synthase+reveal+the+basis+of+flexible+F1-Fo+coupling.">Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling.</a> Science. 364, (2019).</li><li>Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+transitions+in+influenza+haemagglutinin+at+membrane+fusion+pH.">Structural transitions in influenza haemagglutinin at membrane fusion pH.</a> Nature. , 1-4 (2020).</li><li>Dance, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motion+on+ice.">Molecular motion on ice.</a> Nature Methods. , 1-5 (2020).</li><li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it.">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> Elife. 8, 42747 (2019).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM.">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15, 793-795 (2018).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behaviour+during+cryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behaviour during cryoEM grid preparation at different timescales.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Ravelli, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structures+from+sub-nl+volumes+using+pin-printing+and+jet+vitrification.">Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification.</a> Nature Communications. 11, 1-9 (2020).</li><li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts.">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> Journal of Structural Biology. 197, 220-226 (2017).</li><li>Razinkov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+vitrifying+samples+for+cryoEM.">A new method for vitrifying samples for cryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 195, 190-198 (2016).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+effective+microfluidic+spraying-plunging+method+for+high-resolution+single-particle+cryo-EM.">A fast and effective microfluidic spraying-plunging method for high-resolution single-particle cryo-EM.</a> Structure. 25, 663-670 (2017).</li><li>Ashtiani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+femtolitre+droplets+using+surface+acoustic+wave+based+atomisation+for+cryo-EM+grid+preparation.">Delivery of femtolitre droplets using surface acoustic wave based atomisation for cryo-EM grid preparation.</a> Journal of Structural Biology. 203, 94-101 (2018).</li><li>Rubinstein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shake-it-off:+a+simple+ultrasonic+cryo-EM+specimen-preparation+device.">Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).</li><li>M&#228;eots, M. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microfluidics+enables+kinetic+insight+from+time-resolved+cryo-EM.">Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM.</a> Nature Communications. 11, 1-14 (2020).</li><li>Kontziampasis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-EM+grid+preparation+device+for+time-resolved+structural+studies.">A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies.</a> IUCrJ. 6, (2019).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+deposition+onto+cryo-EM+grids:+from+sprays+to+jets+and+back.">Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).</li><li>White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+generation+apparatus+for+time-resolved+electron+cryo-microscopy+using+stepper+motors+and+electrospray.">A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray.</a> Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).</li><li>Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Complex Assembly. , 59-71 (2018).</li><li>Trebbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+liquid+jet+system+with+compatibility+for+atmospheric+and+high-vacuum+conditions.">Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions.</a> Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).</li><li>Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-grid+and+in-flow+mixing+for+time-resolved+Cryo-EM.">On-grid and in-flow mixing for time-resolved Cryo-EM.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2021).</li><li>He, S., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+reconstruction+in+RELION.">Helical reconstruction in RELION.</a> Journal of Structural Biology. 198, 163-176 (2017).</li><li>Millar, N. C., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limiting+rate+of+the+ATP-mediated+dissociation+of+actin+from+rabbit+skeletal+muscle+myosin+subfragment+1.">The limiting rate of the ATP-mediated dissociation of actin from rabbit skeletal muscle myosin subfragment 1.</a> FEBS Letters. 160, 141-148 (1983).</li><li>Kasas, S., Dumas, G., Dietler, G., Catsicas, S., Adrian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+cryoelectron+microscopy+specimens+revealed+by+high-speed+photographic+imaging.">Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging.</a> Journal of Microscopy. 211, 48-53 (2003).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading.">Defocus-dependent Thon-ring fading.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+flow+kinetics.">A beginner's guide to flow kinetics.</a> The Biochemist. 42, (2020).</li></ol>

Protokollene i dette arbeidet kan brukes til rask nettforberedelse ved direkte sprøyting og TrEM-eksperimenter. Rask nettforberedelse kan brukes til å redusere partikkelinteraksjoner med luftvanngrensesnittet5. Hovedbegrensningene er tilgjengelig prøvekonsentrasjon og istykkelse på rutenettet. Innenfor disse grensene og forutsatt at prøvekvaliteten er god, produserer protokollen rutenett som passer for høyoppløselig kryo-EM.
Feilsøking Flyten...

Bakgrunn Den siste tidens utvikling innen kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) har gjort det mulig å studere stadig mer komplekse systemer med høy oppløsning. Med få unntak har slike studier vært begrenset til biologiske makromolekyler ved likevekt1 eller relativt langsomme reaksjoner2. Mange prosesser in vivo forekommer på en raskere tidsskala (millisekunder), og det er økende interesse for tidsløst kryo-EM (TrEM) på disse tidsskalaene3. Imidlertid er konvensjonell kryo-EM prøvepreparering ved blottingsmetoden for treg for millisekunder TrEM.
Blotting-metoden har andre begrensninger i tillegg til dårlig tidsoppløsning. Proteiner og proteinkomplekser kan lide av denaturering eller foretrukket orientering på rutenett4. Reduksjon av eksponeringstiden for luftvannsgrensesnittet under prøvepreparering har vist seg å redusere foretrukket orientering og protein denaturering5,6. Dermed muliggjør rask nettforberedelse ikke bare millisekunder TrEM, men kan også forbedre rutenettkvaliteten.
For tiden er det tre forskjellige tilnærminger til automatisert nettforberedelse. Den første tilnærmingen bruker en pinne eller kapillær som inneholder en liten mengde prøve. Etter å ha etablert kontakt mellom væsken og rutenettoverflaten, blir prøven "skrevet" på rutenettet7,8. Prøvesøknadsprosessen er relativt langsom og tar noen sekunder. En alternativ tilnærming bruker kontrollert dråpegenerering av en piezo dispenser og selvtransporterende rutenett9. Dette gjør det mulig å fryse raskere til frysetider, men er fortsatt begrenset av dråpe- og fukttransporterende hastighet (når for øyeblikket 54 ms). Den raskeste tilnærmingen så langt er den direkte spraytilnærmingen, der prøven forstøvnes i en sprøytedyse og de små (~ 10 - 20 μm) og raske (> 5 m / s) dråper spredt ved kontakt med kryo-EM-rutenettet. Prøvesprayen kan genereres på forskjellige måter som airblast forstøvere, overflate akustiske bølger eller ultralyd luftfuktere10,11,12,13. Etter vår erfaring er istykkelsen med direkte sprøytingstilnærming større, men direkte sprøyting gjør det mulig å dispensere til frysetider < 10 ms.
Denne protokollen beskriver trinn for trinn hvordan en tidsavklart EM-enhet (TED) utstyrt med en mikrofluidisk sprøytedyse kan brukes til å klargjøre gitter på en rask tidsskala14,15. Enheten har blitt brukt til å klargjøre rutenett med en minimum forsinkelsestid på 6 ms mellom prøveapplikasjon og frysing og for raskt å blande og fryse to prøver. Utformingen av TED er basert på en tidligere versjon16 og ligner på andre spraybaserte tids løste cryo-EM-enheter17.
Først beskrives de fire hoveddelene av TED-oppsettet. Kjernen i TED er væskehåndteringsenheten, som er ansvarlig for prøveaspirasjon og dispensering. Et pneumatisk stempel beveger gitteret gjennom sprayen inn i det flytende etanet. Generering av sprayen oppnås med mikrofluidiske sprøytedyser og frysing gjøres i en flytende etanbeholder, som er beskrevet kort. Til slutt er tilleggsfunksjonene for å kontrollere rutenettmiljøet, spesielt fuktighet, uthevet. Dette etterfølges av detaljerte protokoller for driften av enheten og for å utføre TrEM-eksperimenter. Representative resultater gis for rask nettforberedelse og et enkelt TrEM-eksperiment.
Eksperimentelt oppsett
Væskehåndteringsenheten Væskehåndteringssystemet til TED dannes av tre sprøytedrivpumper ('pumper 1 - 3'), hver utstyrt med en roterende ventil (figur 1). En strømforsyning gir pumper 1 - 3 med 24 V DC. Kommunikasjon med kontrollprogramvaren (skrevet i Visual Basic og C++) skjer via et RS232-grensesnitt for å pumpe 1. Kommandoene fordeles gjennom de serielle I/U-ekspansjonsportene fra pumpe 1 til pumpe 2-3. Pumper 1-3 er utstyrt med glasssprøyter ('sprøyter 1-3', vi bruker 250 μL / null døde volumsprøyter her). Hver ventil har to posisjoner, "last" og "dispenser". "Last"-posisjonen brukes til å aspirere prøven inn i sprøyten. Et kort stykke (~ 3 - 4 cm) av 1/16" O.D., 0.01′′ I.D. FEP-rør er koblet via ETFE/ETFE flensfrie beslag til 'last' posisjon av ventiler 1-3. Dette korte slangestykket når inn i prøvebeholderen (vanligvis et 1,5 ml eller 0,5 ml plastrør). "Dispenser"-posisjonen fører til sprøytedysen. Forbindelsen mellom "dispenser"-uttaket og sprøytedysen er laget av PE-rør (~ 20-30 cm lengde, 0,043" O.D., 0,015" I.D.), med et kort stykke ermerør (~ 0,5 cm) og ETFE/ETFE flensfrie beslag.
Det pneumatiske stempelet TED bruker et pneumatisk stempel for å akselerere rutenettet og flytte det gjennom prøvesprayen inn i den flytende etanbeholderen. Pinsett med negativt trykk holder gitteret, skrudd inn i en hjemmebygd holder som er montert på en tostang pneumatisk sylinder (Figur 2A).
Trykket leveres fra en stor nitrogengassflaske (størrelse W), utstyrt med en flertrinnsregulator (0 - 10 bar, 'hovedtrykk'). Fleksible forsterkede PVC-rør (12 mm O.D.) kobler regulatoren til en 12-porters manifold der trykksatt nitrogen leveres til dysen og det pneumatiske stempelet. Gassstrømmen gjennom dysen er konstant, regulert direkte ved nitrogenflasken (hovedtrykket). Tilkoblingen til munnstykket er laget med PU-rør (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), et kort stykke PE-rør (~ 8 cm lengde, 0,043" O.D., 0,015" I.D.) og passende kontakter. Trykket på det pneumatiske stempelet styres gjennom en magnetventil. PU-slangen (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) kobler magnetventilen til en regulator og det pneumatiske stempelet, slik at det blir redusert dykktrykk (≤ hovedtrykk). Magnetventilen er datastyrt. En skjematisk oversikt over oppsettet er angitt i Figur 2B.
Vær oppmerksom på at med dette oppsettet er stupetrykket alltid like eller mindre enn sprøytegasstrykket (hovedtrykket). Oppsettet kan imidlertid enkelt endres ved å inkorporere en annen regulator oppstrøms spraydysen for å tillate høyere stupehastigheter ved lavt sprøytegasstrykk. Høyt trykk (>> 2 bar) kan skade PDMS-sprøytedysen.
FORSIKTIG: Dette er et trykksystem, og "hovedtrykket" skal alltid være < 7 bar.
Trykk mellom 0,5 og 2 bar brukes vanligvis til det pneumatiske stempelet og viser en omtrent lineær sammenheng mellom trykk og hastighet (i sprayens vertikale posisjon). Dykkhastigheter måles med et oscilloskop, koblet i tråd med et skyv potensiometer (10 kΩ) og parallelt med en 2 kΩ motstand (Figur 2C). En strømforsyning gir potensiometeret 9 V DC. Mens den omtrentlige stupehastigheten stilles inn før eksperimentet ved å stille inn stupetrykket, gir potensiometeret en presis avlesning av hastigheten etter eksperimentet.
Spraydyser og flytende etanbeholder Fabrikasjon og drift av gass-dynamiske virtuelle dyser for spraybasert prøvelevering er beskrevet andre steder i detalj15. Som beskrevet ovenfor er "dispenser"-uttakene til ventilene 1-3 koblet til dysens flytende innløp (figur 3A). Trykkspraygassen er koblet til dysens gassinntak. Innløpene i PDMS-sprøytedysene er slik at 0,043" O.D. PE-rør kan brukes direkte uten behov for beslag. Vår dysedesign inneholder en "jet-in-jet" geometri for blanding av to prøver, som ligner på enheten beskrevet i ref.18. Et skjema av utformingen vises i figur 3B, et mikroskopisk bilde av en dyse vises i figur 3C. Utformingen av den mikrofluidiske enheten krever bruk av tre sprøyter for å blande to prøver. Sprøytemunnstykket er vanligvis plassert i 1-1,5 cm avstand fra gitteret (under prøvebruk).
Vi bruker flytende etan som kryogen, i en flytende etan/nitrogenbeholder som brukes til standard blotting-metoden. Vertikal posisjonering av væske etankoppen oppnås med en laboratorieløfteplattform.
Kontroll av spray- og rutenettmiljøet Stempelet og sprøytemunnstykket finnes i en spesialbygd PMMA-boks (akrylglass) med en dobbel dør (figur 4A). Høy relativ luftfuktighet inne i esken oppnås ved et luftfuktingssystem på baksiden av TED (Figur 4B). Luft leveres av en pumpe og mates inn i en første 10" beholder (vanligvis brukt til rensing av synkevann). Beholderen er fylt med et lavt (~ 5-10 cm) vannnivå og huser også en luftfukterenhet. Nettstrømmen til luftfukteren styres av en digital fuktighets-/temperaturregulator og en fuktighets-/temperatursensor plassert inne i akrylglassboksen. Kontrolleren er satt til å slå av pumpen når den relative luftfuktigheten når ≥ 90 %. Fuktet luft fra den første beholderen pumpes gjennom en diffusor, nedsenket i vann i en annen 10" beholder og går deretter inn i akrylglassboksen.
FORSIKTIG: Fordi prøven er aerosolisert i sprøytedysen, er ikke farlige biologiske eller kjemiske prøver egnet som prøver.
Kjøresekvensen Kjør skript-knappen i kontrollprogramvaren starter kjøresekvensen. Denne sekvensen med kommandoer kan forhåndsdeponeres i en skriptfil og endres gjennom programvaren. De viktigste variablene er forklart her:
Sprayhastighet: Sprayhastigheten bestemmer væskestrømningshastigheten som brukes av sprøytepumpen. Strømningshastigheten kan beregnes på følgende måte: Sprøytepumpemotorene som brukes her har en fast trinnstørrelse. Hele pumpens rekkevidde er delt inn i 48 000 trinn. Den andre viktige faktoren er sprøytevolumet. Vi bruker vanligvis 250 μL sprøyter. Sprayhastigheten i kontrollprogramvaren er angitt som antall trinn / sekund. En sprayhastighet på 1000 trinn/sekund tilsvarer:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62199/62199eq01.jpg">
Sprøytevolum: Sprayvolumet bestemmer det totale volumet som skal sprøytes. Dermed bestemmer det også varigheten av sprayen. Sprayvolumet i kontrollprogramvaren er angitt som en rekke trinn. Et sprøytevolum på 2000 trinn, med en sprayhastighet på 1000 trinn / sekund, fører til en sprayvarighet på 2 s og et totalt volum på 10,4 μL.
Pre-spray tid: Denne variabelen definerer tiden mellom initiering av spray og dykk. Det er viktig å velge forsinkelsestiden slik at sprayen har tilstrekkelig tid til å stabilisere seg før du stuper rutenettet. Vanligvis får sprayen 1,5 - 4 s for å stabilisere seg før gitteret stupes. Sprayen opprettholdes til gitteret har beveget seg gjennom. Vanligvis stoppes væskestrømmen (og derfor sprayen) 0,5 til 1 s etter at gitteret er stupt. Ved hjelp av en sprayhastighet på 1000 trinn / s og et sprøytevolum på 2000 trinn, er en typisk forspraytid for eksempel 1,5 s.
En eksemplarisk sekvens med kommandoer vises i Figur 5A, rutenettposisjonen over tid er illustrert i Figur 5B.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Time resolved device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylic glass box</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital humidity/temperature controller</td>
			<td>THE20 digital humidity/temperature controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual rod pneumatic cylinder</td>
			<td>dual rod pneumatic cylinder TN 10x70</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP tubing</td>
			<td>Upchurch Scientific 1/16&#8221; O.D., 0.01&#39;&#39; I.D. FEP tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flangeless fittings</td>
			<td>Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td>12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass syringes</td>
			<td>Kloehn 250 &#181;L zero-dead volume</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidifier pump</td>
			<td>Interpret Aqua Air AP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid ethane container</td>
			<td>from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multistage regulator</td>
			<td>GASARC class 3 multistage regulator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative pressure tweezers</td>
			<td>Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Hantek 6022BE oscilloscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE tubing</td>
			<td>Scientific Commodities Inc. 0.043&#8221; O.D., 0.015&#8221; I.D. PE tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Mean Well GSM160A24-R7B</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Wanptek KPS305D power supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU tubing</td>
			<td>SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulator</td>
			<td>Norgren R72G-2GK-RMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide potentiometer</td>
			<td>PS100 slide potentiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solenoid valve</td>
			<td>SMC NVJ314M solenoid valve</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe drive pumps</td>
			<td>Kloehn V6 48K model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apoferritin from equine spleen</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A3660</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A2383</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-EM grids</td>
			<td>Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich E3889</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-actin</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glow-discharger</td>
			<td>Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, H7006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich, P1190</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M8266</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M1254</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, S9888</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal muscle myosin S1</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 1</td>
			<td>Spudich, J. A. &#38; Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 2</td>
			<td>White, H. &#38; Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy

Feltet kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) utvikler seg raskt med nye maskinvare- og prosesseringsalgoritmer, og produserer strukturer og informasjon med høyere oppløsning på mer utfordrende systemer. Prøvepreparering for cryo-EM gjennomgår en lignende revolusjon med nye tilnærminger som utvikles for å erstatte de tradisjonelle blottingssystemene. Disse inkluderer bruk av piezo-elektriske dispensere, pintrykk og direkte sprøyting. Som et resultat av denne utviklingen går hastigheten på nettforberedelsene fra sekunder til millisekunder, noe som gir nye muligheter, spesielt innen tidsavsluttet kryo-EM der proteiner og substrater raskt kan blandes før dykkfrysing, fanger kortvarige mellomliggende tilstander. Her beskriver vi i detalj en standardprotokoll for å lage rutenett på vår interne tidsavklarte EM-enhet både for standard rask nettforberedelse og også for tids løste eksperimenter. Protokollen krever minimum ca. 50 μL prøve ved konsentrasjoner på ≥ 2 mg/ml for fremstilling av 4 gitter. Forsinkelsen mellom prøveprogram og frysing kan være så lav som 10 ms. En begrensning er økt istykkelse ved raskere hastigheter og sammenlignet med blottingsmetoden. Vi håper denne protokollen vil hjelpe andre med å designe sine egne grid making enheter og de som er interessert i å designe tidsavklarte eksperimenter.

Rask nettforberedelse med TED Som en testprøve for rask nettforberedelse har vi brukt apoferritin fra heste milt ved 20 μM i 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5. En rekonstruksjon ved 3.5 Å resolusjon ble innhentet fra 690 mikrografer som beskrevet i ref.15 (Figur 7A). Defokusområdet ble valgt slik at partikler lett kan identifiseres i raw-bildene (Figur 7B). Et typisk rutenett utarbeidet med en tidsforsinkelse på 10...

Watch this Scientific Journal Video about Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Her gir vi en detaljert protokoll for bruk av en rask grid-lage enhet for både rask grid-making og for rask blanding og frysing for å gjennomføre tidsavklarte eksperimenter.

Rask nettforberedelse for tidsavklart kryo-elektronmikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Hei, og velkommen til denne JoVE"-videoen. Vi ønsker å introdusere deg for oppsettet som vi har her for rask grid making, en tidsavklart studie som vi utvikler i Leeds. Vær oppmerksom på at dette ikke er et standardsystem, men vi håper at ved å gi deg en detaljert redegjørelse for alle tingene og parametrene vi gjør, vil du kunne utvikle lignende systemer i dine egne laboratorier.En detaljert beskrivelse av enheten er gitt i Richmond-protokollen. Her skal vi gi en trinnvis guide for rask nettforberedelse og tids løst EM. Vår erfaring er at proteinkonsentrasjonen skal være to milligram per milliliter eller høyere. Protokollen krever et minimumsvolum på ca. 50 mikroliter.Slå på enheten. Slå deretter på kontroll-PCen og start kontrollprogramvaren. Initialiser alle sprøytepumper ved å trykke på initialiseringsknappen på hver sprøytepumpe.Slå på potensiometerets strømforsyning, sett den til ni volt, og start oscilloskopkontrollprogramvaren. Trykksatt nitrogengass er nødvendig for å generere sprayen. Åpne nitrogensylinderen og sett trykket til 2 bar.Sørg for at alle sprøytepumpeventiler er i lasteposisjon. For å gjøre dette, bytt alle ventiler for å dispensere i kontrollprogramvaren og deretter tilbake til belastning. Sett alle sprøyter til null.Eventuelle luftbobler som er tilstede i systemet, bør fjernes på dette stadiet. For å gjøre dette må sprøytene kanskje skrus av, bobler fjernes manuelt, og sprøytene monteres igjen når de ikke inneholder flere bobler. Væskehåndteringssystemet lagres vanligvis i vann.Før du laster inn prøven, blir systemet likevektet med bufferen. Dette gjøres ved å vaske slangen med et overskudd av buffer. Plasser et rør som inneholder minst 200 mikroliter buffer på sprøyte 1.Toppen av røret må være gjennomboret for å feste den. Aspirer en passende mengde buffer, mellom 50 og hundre mikroliter med sprøyte en ved hjelp av kontrollprogramvaren. Bytt ventil 1 for å dispensere.Dispenser all væsken i sprøyte 1. Returner ventil 1 til lasteposisjonen, og trykk på initialiseringsknappen på sprøyte 1 for å klargjøre systemet for neste vaskesyklus. Disse trinnene gjentas vanligvis tre ganger for å sikre grundig vasking av slangen.Deretter er sprøytedysen plassert. Plasser et EM-rutenett i den dype armen. Plasser gitteret foran sprøytemunnstykket.Dispenser bufferen ved hjelp av kontrollprogramvaren. Hvis dysen og gitteret er justert, bør væske akkumuleres etter sprøyting i en lengre periode. Juster om nødvendig dyseposisjonen og kontroller deretter igjen hvor væsken akkumuleres på rutenettet.Deretter justerer du posisjonen til etankoppen. Spissen av pinsettene skal nå omtrent til midten av etankoppen. Utfør en testkjøring for å sikre at alle innstillingene er riktige.Lukk fuktighetskammeret. Pass på at stempelets bane er klar. Aspirer volumet av buffer som kreves for en enkelt løpetur i sprøyte 1.Bytt ventil 1 for å dispensere. Start kjøringen ved å trykke på run'in kontrollprogramvaren. Kontroller at sprøytepumpen er i bevegelse, to sekunder i dette tilfellet, og at gitteret stupes etter en passende forsinkelse, 1,5 sekunder her.Når løpet er ferdig, setter du trykket på stempelarmen til ønsket verdi. Trykk ok'i kontrollprogramvaren for å frigjøre trykket fra den stupe armen. Nå er etankoppen kjølig og fylt med flytende etan.Glødeutladning av gitteret før bruk. En typisk glødeutladning er 90 sekunder ved 10 milliampere i 0,1 millibar luft. Slangen blir deretter likevektet med prøve.Hvis det tilgjengelige prøvevolumet er lavt, kan slangen likevektes med bare ett dødvolum. Aspirer prøve. Vanligvis er det døde volumet rundt 30 mikroliter.Bytt ventil 1 for å dispensere. Dispenser prøven gjennom rør og dyse. Aspirer deretter mengden prøve som kreves for en enkelt kjøring.Bytt ventil 1 for å dispensere. Kontroller at den relative luftfuktigheten har nådd ønsket verdi. Vi forbereder vanligvis rutenett på 60% eller høyere.Dette kan ta noen minutter. Plasser pinsettene som holder et glødegitter i den stupende armen. Plasser potensiometerskuffen i startposisjon, klar for hastighetsmåling.Still inn utløseren for hastighetsmålingen i oscilloskopprogramvaren. Plasser den flytende etankoppen, og nær fuktighetskammeret. Pass på at stempelets bane er klar.Start kjøringen i kontrollprogramvaren. Når kjøringen er ferdig, trykker du på OK'in kontrollprogramvaren for å frigjøre trykk fra den stupte armen. Åpne fuktighetskammeret, løsne forbindelsen mellom stupearm og pinsett.Beveg deg oppover den dype armen mens du holder gitteret i flytende etan. Overfør deretter gitteret til flytende nitrogen og til lagring. Lagre oscilloskopmålingen.Tilbakestill posisjonen til potensiometerglidebryteren og stempelet manuelt. Gjenta protokollen for å klargjøre replikeringsrutenett. Tids løst eksperimenter gjøres på en lignende måte.Høyere lagerkonsentrasjoner er nødvendig for tidsavklarte eksperimenter på grunn av fortynning i blandetrinnet. For et tids løst eksperiment, bruk alle tre sprøytene. Slangen er festet til sprøytepumpene og til sprøytedysen.Den mikrofluidiske sprøytedysen som brukes her inneholder også et blandeelement. Vær oppmerksom på at lengre rør vil gi et større dødvolum og vaskelikevektstrinn krever mer buffer og prøve. Likevekt alle sprøyter med buffer og prøve separat.Vanligvis brukes sprøyte en til prøve A'og sprøyter to og tre brukes til prøve B'Etter at slangen er likevektet, last prøve A i sprøyte en og prøve B i sprøyter to og tre. Deretter bytter du ventiler en til tre for å dispensere. Start kjøringen i kontrollprogramvaren.Legg merke til at et annet kjøreskript er nødvendig for et tids løst eksperiment. Ulike tidsforsinkelser kan oppnås på to måter. Ved å justere stempelhastigheten kan tidsforsinkelsen fra blanding til frysing endres.En raskere stupehastighet vil føre til en kortere tidsforsinkelse. Alternativt endres sprayetanavstanden ved å justere den vertikale posisjonen til sprøytedysen. Hvis du øker avstanden, vil det føre til lengre tidsforsinkelse.I elektronmikroskopet ved lav forstørrelse ser et typisk rutenett slik ut. Områder med tynn is, som angitt, er egnet for datainnsamling. Ved høyere forstørrelser bør partikler være tydelig synlige.Med en testprøve som apoferritin er et relativt lite datasett fra et enkelt rutenett tilstrekkelig for en rekonstruksjon med tre til fire angstrom oppløsning. For tids løste eksperimenter samler vi inn datasett fra forskjellige tidspunkter eller rutenett. Det er nyttig å kombinere dataene for 3D-klassifisering og deretter spore partikler tilbake til sine tidspunkter.På denne måten kan dataene gi strukturell informasjon og informasjon om reaksjonskinetikken. Til slutt håper vi at du likte videoen. Vi håper at med de detaljerte beskrivelsene i JoVE-papiret sammen med videoen, vil du kunne utføre dine egne eksperimenter via rask grid making, som har vist seg å lindre noen av problemene fra mutasjon eller for å hjelpe med interaksjoner ved luftvannsgrensesnittet, alt du trenger for å gjennomføre dine egne tidsavklarte studier for å prøve å fange noen av de ikke-likevektstilstandene.Så, glad grid making.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttrykk og rensing av menneskelige Lipid-sensitive kasjon kanal-TRPC3 for strukturelle vilje av Single-partikkel Cryo-elektronmikroskop

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse og Cryo-FIB mikromaskinering av Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikropattering overføring elektronmikroskopinett til direkte celleposisjonering i hele celler Cryo-Electron Tomography Arbeidsflyter

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prosesseringsarbeidsflyt med kryoSPARC, RELION og scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Fremstilling av nukleosomkjernepartikler kompleksert med DNA-reparasjonsfaktorer for kryo-elektronmikroskopi strukturell bestemmelse

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Ekstrahering av modifiserte mikrotubuli fra pattedyrceller for å studere mikrotubuli-proteinkomplekser ved kryo-elektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Anvendelse av monolags grafen til kryo-elektronmikroskopigitter for høyoppløselig strukturbestemmelse

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...