Name: fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Молли С.C. Граветт за полезные обсуждения и персонал absl за помощь в сборе данных крио-ЭМ. Дэвид. Клебл является аспирантом по 4-летней программе PhD Wellcome Trust в Центре Астбери, финансируемом Университетом Лидса. Микроскопы FEI Titan Krios финансировались Университетом Лидса (награда UoL ABSL) и Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Эта работа финансировалась грантом BBSRC Стивену. Мюнху (BB/P026397/1) и поддерживалась исследовательскими грантами Говарду Д. Уайту из Американской кардиологической ассоциации (AMR21-236078) и Говарду Д. Уайту и Витольду Галкину из Национального института здравоохранения США (171261).

1. Подготовка системы
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол описывает, как подготовить сетки из одного образца. Обычно для каждого образца или условия подготавливается не менее 2 реплицированных сеток. Для более высоких скоростей погружения (задержка времени менее ~ 20 мс) 3 или 4 р?...

<ol>
	<li>Murphy, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotary+substates+of+mitochondrial+ATP+synthase+reveal+the+basis+of+flexible+F1-Fo+coupling.">Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling.</a> Science. 364, (2019).</li><li>Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+transitions+in+influenza+haemagglutinin+at+membrane+fusion+pH.">Structural transitions in influenza haemagglutinin at membrane fusion pH.</a> Nature. , 1-4 (2020).</li><li>Dance, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motion+on+ice.">Molecular motion on ice.</a> Nature Methods. , 1-5 (2020).</li><li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it.">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> Elife. 8, 42747 (2019).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM.">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15, 793-795 (2018).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behaviour+during+cryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behaviour during cryoEM grid preparation at different timescales.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Ravelli, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structures+from+sub-nl+volumes+using+pin-printing+and+jet+vitrification.">Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification.</a> Nature Communications. 11, 1-9 (2020).</li><li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts.">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> Journal of Structural Biology. 197, 220-226 (2017).</li><li>Razinkov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+vitrifying+samples+for+cryoEM.">A new method for vitrifying samples for cryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 195, 190-198 (2016).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+effective+microfluidic+spraying-plunging+method+for+high-resolution+single-particle+cryo-EM.">A fast and effective microfluidic spraying-plunging method for high-resolution single-particle cryo-EM.</a> Structure. 25, 663-670 (2017).</li><li>Ashtiani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+femtolitre+droplets+using+surface+acoustic+wave+based+atomisation+for+cryo-EM+grid+preparation.">Delivery of femtolitre droplets using surface acoustic wave based atomisation for cryo-EM grid preparation.</a> Journal of Structural Biology. 203, 94-101 (2018).</li><li>Rubinstein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shake-it-off:+a+simple+ultrasonic+cryo-EM+specimen-preparation+device.">Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).</li><li>M&#228;eots, M. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microfluidics+enables+kinetic+insight+from+time-resolved+cryo-EM.">Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM.</a> Nature Communications. 11, 1-14 (2020).</li><li>Kontziampasis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-EM+grid+preparation+device+for+time-resolved+structural+studies.">A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies.</a> IUCrJ. 6, (2019).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+deposition+onto+cryo-EM+grids:+from+sprays+to+jets+and+back.">Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).</li><li>White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+generation+apparatus+for+time-resolved+electron+cryo-microscopy+using+stepper+motors+and+electrospray.">A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray.</a> Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).</li><li>Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Complex Assembly. , 59-71 (2018).</li><li>Trebbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+liquid+jet+system+with+compatibility+for+atmospheric+and+high-vacuum+conditions.">Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions.</a> Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).</li><li>Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-grid+and+in-flow+mixing+for+time-resolved+Cryo-EM.">On-grid and in-flow mixing for time-resolved Cryo-EM.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2021).</li><li>He, S., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+reconstruction+in+RELION.">Helical reconstruction in RELION.</a> Journal of Structural Biology. 198, 163-176 (2017).</li><li>Millar, N. C., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limiting+rate+of+the+ATP-mediated+dissociation+of+actin+from+rabbit+skeletal+muscle+myosin+subfragment+1.">The limiting rate of the ATP-mediated dissociation of actin from rabbit skeletal muscle myosin subfragment 1.</a> FEBS Letters. 160, 141-148 (1983).</li><li>Kasas, S., Dumas, G., Dietler, G., Catsicas, S., Adrian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+cryoelectron+microscopy+specimens+revealed+by+high-speed+photographic+imaging.">Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging.</a> Journal of Microscopy. 211, 48-53 (2003).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading.">Defocus-dependent Thon-ring fading.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+flow+kinetics.">A beginner's guide to flow kinetics.</a> The Biochemist. 42, (2020).</li></ol>

Протоколы в этой работе могут быть использованы для быстрой подготовки сетки путем прямого распыления и экспериментов TrEM. Быстрая подготовка сетки может быть использована для уменьшения взаимодействия частиц с воздушной водой, границейраздела 5. Основными ограничениями ...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Time resolved device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylic glass box</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital humidity/temperature controller</td>
			<td>THE20 digital humidity/temperature controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual rod pneumatic cylinder</td>
			<td>dual rod pneumatic cylinder TN 10x70</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP tubing</td>
			<td>Upchurch Scientific 1/16&#8221; O.D., 0.01&#39;&#39; I.D. FEP tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flangeless fittings</td>
			<td>Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td>12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass syringes</td>
			<td>Kloehn 250 &#181;L zero-dead volume</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidifier pump</td>
			<td>Interpret Aqua Air AP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid ethane container</td>
			<td>from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multistage regulator</td>
			<td>GASARC class 3 multistage regulator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative pressure tweezers</td>
			<td>Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Hantek 6022BE oscilloscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE tubing</td>
			<td>Scientific Commodities Inc. 0.043&#8221; O.D., 0.015&#8221; I.D. PE tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Mean Well GSM160A24-R7B</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Wanptek KPS305D power supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU tubing</td>
			<td>SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulator</td>
			<td>Norgren R72G-2GK-RMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide potentiometer</td>
			<td>PS100 slide potentiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solenoid valve</td>
			<td>SMC NVJ314M solenoid valve</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe drive pumps</td>
			<td>Kloehn V6 48K model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apoferritin from equine spleen</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A3660</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A2383</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-EM grids</td>
			<td>Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich E3889</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-actin</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glow-discharger</td>
			<td>Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, H7006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich, P1190</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M8266</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M1254</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, S9888</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal muscle myosin S1</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 1</td>
			<td>Spudich, J. A. &#38; Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 2</td>
			<td>White, H. &#38; Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy

Область криоэлектроновой микроскопии (крио-ЭМ) быстро развивается с новым оборудованием и алгоритмами обработки, создавая структуры с более высоким разрешением и информацию о более сложных системах. Подготовка образцов для крио-ЭМ претерпевает аналогичную революцию с новыми подходами, которые разрабатываются для замены традиционных систем блоттинга. К ним относятся использование пьезоэлектрических дозаторов, печати штифтами и прямого распыления. В результате этих разработок скорость подготовки сетки увеличивается от секунд до миллисекунд, предоставляя новые возможности, особенно в области крио-ЭМ с временным разрешением, где белки и субстраты могут быть быстро смешаны перед погружением замораживания, захватывая короткоживущие промежуточные состояния. Здесь мы подробно описываем стандартный протокол для создания сеток на нашем собственном электромагнитном устройстве с временным разрешением как для стандартной быстрой подготовки сети, так и для экспериментов с временным разрешением. Протокол требует минимум около 50 мкл образца в концентрациях ≥ 2 мг/мл для приготовления 4 решеток. Задержка между применением образца и замораживанием может составлять всего 10 мс. Одним из ограничений является увеличение толщины льда на более высоких скоростях и по сравнению с методом блоттинга. Мы надеемся, что этот протокол поможет другим в разработке их собственных устройств для создания сетей и тем, кто заинтересован в разработке экспериментов с временным разрешением.

Быстрая подготовка сетки с помощью TED В качестве тестового образца для быстрой подготовки сетки мы использовали апоферритин из лошадиной селезенки при 20 мкМ в 30 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, рН 7,5. Реконструкция с разрешением 3,5 Å была получена из 690 микроснимков, как описано в ссылке<sup class="xre...

Watch this Scientific Journal Video about Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Здесь мы предоставляем подробный протокол для использования устройства быстрого создания сетки как для быстрого изготовления сетки, так и для быстрого смешивания и замораживания для проведения экспериментов с временным разрешением.

Быстрая подготовка сетки для криоэлектроно-микроскопии с временным разрешением

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Здравствуйте, и добро пожаловать в это видео JoVE. Мы хотим познакомить вас с установкой, которую мы здесь получили для быстрого создания сетки, исследование с временным решением, которое мы разрабатываем в Лидсе. Имейте в виду, что это не стандартная система, но мы надеемся, что, предоставив вам подробный отчет обо всех вещах и параметрах, которые мы делаем, вы сможете разрабатывать подобные системы в своих собственных лабораториях.Подробное описание устройства приведено в Ричмондском протоколе. Здесь мы дадим пошаговое руководство по быстрой подготовке сетки и временным решениям EM. По нашему опыту, концентрация белка должна составлять два миллиграмма на миллилитр или выше. Протокол требует минимального объема около 50 микролитров.Включите устройство. Затем включите контрольный ПК и запустите управляя программное обеспечение. Инициализируйте все шприцевые насосы, нажав кнопку инициализации на каждом шприцевом насосе.Включите блок питания потенциометра, установите его на девять вольт и запустите программное обеспечение для управления осциллографом. Для создания распыления необходим газообразный азот под давлением. Откройте азотный цилиндр и установите давление на 2 бар.Убедитесь, что все клапаны шприцевого насоса находятся в положении нагрузки. Для этого переключите все клапаны на дозирование в управляющий по программе, а затем обратно на загрузку. Установите все шприцы на ноль.Любые пузырьки воздуха, присутствующие в системе, должны быть удалены на этом этапе. Для этого шприцы, возможно, придется открутить, пузырьки удалить вручную, а шприцы снова смонтировать, когда они больше не содержат пузырьков. Система обработки жидкостей обычно хранится в воде.Перед загрузкой образца система уравновешивается буфером. Это делается путем промывки трубки с избытком буфера. Поместите на шприц-один пробирку, содержащую, по меньшей мере, 200 микролитров буфера.Верхнюю часть трубки необходимо проткнуть, чтобы прикрепить ее. Аспирируйте подходящее количество буфера, от 50 до ста микролитров со шприцем один с помощью программного обеспечения управления. Переключать клапан один для дозирования.Дозировать всю жидкость в шприц-один. Верните клапан один в положение нагрузки и нажмите кнопку инициализации на шприце, чтобы подготовить систему к следующему циклу промывки. Эти шаги обычно повторяют три раза, чтобы обеспечить тщательную промывку трубки.Далее позиционируется распылительная насадка. Поместите ЭМ-сетку в погружающую руку. Расположите сетку перед распылительным соплом.Дозируйте буфер с помощью управляющего программного обеспечения. Если насадка и сетка выровнены, жидкость должна накапливаться после распыления в течение длительного периода времени. При необходимости отрегулируйте положение сопла, а затем еще раз проверьте, где жидкость скапливается на сетке.Затем отрегулируйте положение этановой чашки. Кончик пинцетом должен доходить примерно до центра этановой чашечки. Выполните тестовый запуск, чтобы убедиться в правильной правильной настройке.Закройте камеру влажности. Убедитесь, что путь плунжера ясен. Аспирировать объем буфера, необходимый для одного запуска в шприц.Переключать клапан один для дозирования. Запустите запуск, нажав run'in управляя программным обеспечением. Проверьте, что шприц-насос один движется, две секунды в этом случае, а сетка погружается после соответствующей задержки, здесь 1,5 секунды.Когда пробег будет завершен, установите давление на плечи плунжера до нужного значения. Нажмите OK'in управляющее программное обеспечение, чтобы снять давление с погружающегося рычага. Теперь этановая чашка остыла и заполнена жидким этаном.Тлеющий разряд сетки перед использованием. Типичный тлеющий разряд составляет 90 секунд при 10 миллиампер в воздухе 0,1 миллибара. Затем трубка уравновешивается образцом.Если доступный объем пробы низкий, трубка может быть уравновешивается только одним мертвым объемом. Образец аспирата. Обычно мертвый объем составляет около 30 микролитров.Переключать клапан один для дозирования. Дозирование образца через трубку и сопло. Затем аспирировать количество образца, необходимое для одного прогока.Переключать клапан один для дозирования. Убедитесь, что относительная влажность достигла нужного значения. Обычно мы готовим сетки на 60% и выше.Это может занять несколько минут. Поместите пинцет, держащий светящуюся сетку, в погружающую руку. Поместите слайд потенциометра в начальное положение, готовое к измерению скорости.Установите триггер для измерения скорости в программном обеспечении осциллографа. Поместите чашку с жидким этаном и близко к камере влажности. Убедитесь, что путь плунжера ясен.Запустите запуск в управляемом программном обеспечении. Когда запуск будет завершен, нажмите OK'in управляющее программное обеспечение, чтобы снять давление с погружающегося рычага. Откройте камеру влажности, ослабьте соединение между погружающим рычагом и пинцетем.Подойдите вверх по погружающей руке, сохраняя сетку в жидком этане. Затем переведите сетки в жидкий азот и в хранилище. Сохраните измерение осциллографа.Вручную сбросьте положение ползунка потенциометра и плунжера. Повторите протокол для подготовки реплицированных сеток. Эксперименты с временным разрешением проводятся аналогичным образом.Более высокие концентрации запасов необходимы для экспериментов с временным разрешением из-за разбавления на этапе смешивания. Для эксперимента с временным разрешением используйте все три шприца. Трубка крепится к шприцевым насосам и к распылительной форсурке.Микрофлюидная распылительная форсунок, используемая здесь, также содержит смесительный элемент. Обратите внимание, что более длинные трубки дадут больший мертвый объем, а этапы уравновешивания промывки требуют большего буфера и образца. Уравновесьте все шприцы буфером и образцом отдельно.Как правило, шприц один используется для образца А, а шприцы два и три используются для образца B'После того, как трубка уравновешена, загрузите образец A в шприц один и образец B в шприцы два и три. Затем переключите клапаны от одного до трех для дозирования. Запустите запуск в управляемом программном обеспечении.Обратите внимание, что для эксперимента с временным разрешением требуется другой сценарий выполнения. Различные временные задержки могут быть достигнуты двумя способами. Регулируя скорость плунжера, можно изменить временную задержку от перемешивания до замерзания.Более высокая скорость погружения приведет к более короткой временной задержке. В качестве альтернативы, расстояние распыления этана изменяется путем регулировки вертикального положения распылительного сопла. Увеличение расстояния приведет к более длительной временной задержке.В электронном микроскопе при низком увеличении типичная сетка выглядит так. Участки тонкого льда, как указано, подходят для сбора данных. При более высоких увеличениях частицы должны быть хорошо видны.С тестовым образцом, таким как апоферритин, относительно небольшого набора данных из одной сетки достаточно для реконструкции с разрешением от трех до четырех ангстрем. Для экспериментов с временным разрешением мы собираем наборы данных из разных временных точек или сеток. Полезно объединить данные для 3D-классификации, а затем проследить частицы до их временных точек.Таким образом, данные могут предоставить структурную информацию и информацию о кинетике реакции. В заключение, мы надеемся, что вам понравилось видео. Мы надеемся, что с подробными описаниями в статье JoVE вместе с видео вы сможете проводить свои собственные эксперименты с помощью быстрого создания сетки, которая, как было показано, облегчает некоторые проблемы от мутации или помогает с взаимодействиями на границе раздела воздух-вода, все, что вам нужно для проведения ваших собственных исследований с временным разрешением, чтобы попытаться поймать некоторые из этих неравновесных состояний.Итак, счастливого создания сетки.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Выражение и очищение человека липидов чувствительных катионного канала TRPC3 структурные определения по одной частицы крио электронная микроскопия

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Подготовка и крио-FIB микрообработка Saccharomyces cerevisiae для криоэлектронной томографии

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Криоэлектронная микроскопия с одной частицей: от образца к структуре

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Микроструктурирование просвечивающих электронных микроскопических сеток для прямого позиционирования клеток в рабочих процессах криоэлектронной томографии цельноклеточной криоэлектронной томографии

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Надежный рабочий процесс обработки криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) с криоСПАРК, RELION и Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Получение частиц ядра нуклеосом в комплексе с факторами репарации ДНК для определения структуры криоэлектронной микроскопии

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Извлечение модифицированных микротрубочек из клеток млекопитающих для изучения микротрубочек-белковых комплексов методом криоэлектронной микроскопии

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Применение монослойного графена в решетках криоэлектронной микроскопии для определения структуры с высоким разрешением

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...