Name: fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a Molly S.C. Gravett por las útiles discusiones y al personal de las instalaciones de ABSL por su ayuda con la recopilación de datos de crio-EM. David P. Klebl es un estudiante de doctorado en el programa de doctorado de 4 años de Wellcome Trust en The Astbury Centre financiado por la Universidad de Leeds. Los microscopios FEI Titan Krios fueron financiados por la Universidad de Leeds (premio UoL ABSL) y Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Este trabajo fue financiado por una subvención de BBSRC a Stephen P. Muench (BB / P026397 / 1) y apoyado por subvenciones de investigación a Howard D. White de la Asociación Americana del Corazón (AMR21-236078) y Howard D. White y Vitold Galkin de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (171261).

1. Preparación del sistema
Nota : el siguiente protocolo describe cómo preparar cuadrículas de una sola muestra. Por lo general, se preparan un mínimo de 2 rejillas replicadas para cada muestra o condición. Para velocidades de inmersión más rápidas (menos de ~ 20 ms de retraso de tiempo), 3 o 4 rejillas de replicación generalmente están preparadas para tener en cuenta un número reducido de áreas de hielo delgado.
<ol><li>Diluya la muestra de proteína a la concentración objetivo...

<ol>
	<li>Murphy, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotary+substates+of+mitochondrial+ATP+synthase+reveal+the+basis+of+flexible+F1-Fo+coupling.">Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling.</a> Science. 364, (2019).</li><li>Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shake-it-off:+a+simple+ultrasonic+cryo-EM+specimen-preparation+device.">Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).</li><li>M&#228;eots, M. -. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+deposition+onto+cryo-EM+grids:+from+sprays+to+jets+and+back.">Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).</li><li>White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+generation+apparatus+for+time-resolved+electron+cryo-microscopy+using+stepper+motors+and+electrospray.">A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray.</a> Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).</li><li>Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Complex Assembly. , 59-71 (2018).</li><li>Trebbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+liquid+jet+system+with+compatibility+for+atmospheric+and+high-vacuum+conditions.">Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions.</a> Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).</li><li>Klebl, D. 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Los protocolos en este trabajo se pueden utilizar para la preparación rápida de la rejilla mediante pulverización directa y experimentos TrEM. La preparación rápida de la rejilla se puede utilizar para reducir las interacciones de partículas con la interfaz aire-agua5. Las principales limitaciones son la concentración de muestra disponible y el espesor del hielo en la rejilla. Dentro de estos límites y siempre que la calidad de la muestra sea buena, el protocolo produce rejillas adecuadas ...

Fondo Los recientes desarrollos en crio-microscopía electrónica (cryo-EM) han permitido estudios estructurales de sistemas cada vez más complejos a alta resolución. Con pocas excepciones, tales estudios se han limitado a macromoléculas biológicas en equilibrio1 o reacciones relativamente lentas2. Muchos procesos in vivo ocurren en una escala de tiempo más rápida (milisegundos) y existe un creciente interés en la crio-EM resuelta en el tiempo (TrEM) en estas escalas de tiempo3. Sin embargo, la preparación convencional de muestras crio-EM por el método de borrado es demasiado lenta para TrEM de milisegundos.
El método de borrado tiene otras limitaciones además de la mala resolución del tiempo. Las proteínas y los complejos proteicos pueden sufrir desnaturalización u orientación preferida en las cuadrículas4. Se ha demostrado que la reducción del tiempo de exposición a la interfaz aire-agua durante la preparación de la muestra mitiga la orientación preferida y la desnaturalización deproteínas 5,6. Por lo tanto, la rápida preparación de la rejilla no solo permite trEM de milisegundos, sino que también puede mejorar la calidad de la red.
Actualmente, hay tres enfoques diferentes para la preparación automatizada de la red. El primer enfoque utiliza un alfiler o capilar que contiene una pequeña cantidad de muestra. Después de establecer el contacto entre el líquido y la superficie de la rejilla, la muestra se "escribe" en la rejilla7,8. El proceso de aplicación de muestra es relativamente lento y tarda unos segundos. Un enfoque alternativo utiliza la generación controlada de gotas mediante un dispensador piezoeléctrico y rejillas auto-absorbentes9. Esto permite una dispensación más rápida para congelar los tiempos, pero todavía está limitado por la caída y la velocidad de absorción (que actualmente alcanza los 54 ms). El enfoque más rápido hasta ahora es el enfoque de pulverización directa, en el que la muestra se atomiza en una boquilla de pulverización y las gotas pequeñas (~ 10 - 20 μm) y rápidas (> 5 m / s) se extienden al contacto con la rejilla crio-EM. La muestra pulverizada se puede generar a través de diferentes vías como atomizadores airblast, ondas acústicas superficiales o humidificadores ultrasónicos10,11, 12,13. En nuestra experiencia, el espesor del hielo con el enfoque de pulverización directa es mayor, pero la pulverización directa permite que la dispensación congele los tiempos de congelación < 10 ms.
Este protocolo describe paso a paso cómo se puede utilizar un dispositivo EM (TED) con respuesta al tiempo equipado con una boquilla de pulverización microfluídica para preparar rejillas en una escala de tiempo rápida14,15. El dispositivo se ha utilizado para preparar rejillas con un tiempo de retardo mínimo de 6 ms entre la aplicación de la muestra y la congelación y para mezclar y congelar rápidamente dos muestras. El diseño del TED se basa en una versión anterior16 y es similar a otros dispositivos crio-EM resueltos en el tiempo basados en pulverización17.
En primer lugar, se describen las cuatro partes principales de la configuración de TED. El núcleo del TED es la unidad de manejo de líquidos, que es responsable de la aspiración y dispensación de muestras. Un émbolo neumático mueve la rejilla a través del aerosol hacia el etano líquido. La generación del spray se logra con boquillas de pulverización microfluídica y la congelación se realiza en un recipiente de etano líquido, que se describen brevemente. Por último, se destacan las características adicionales para controlar el entorno de la red, especialmente la humedad. Esto es seguido por protocolos detallados para el funcionamiento del dispositivo y para la realización de experimentos TrEM. Se dan resultados representativos para una rápida preparación de la cuadrícula y un simple experimento TrEM.
Configuración experimental
La unidad de manipulación de líquidos El sistema de manipulación de líquidos del TED está formado por tres bombas de accionamiento de jeringas («bombas 1 - 3»), cada una equipada con una válvula rotativa (Figura 1). Una fuente de alimentación proporciona bombas 1 - 3 con 24 V DC. La comunicación con el software de control (escrito en Visual Basic y C++) es a través de una interfaz RS232 para bombear 1. Los comandos se distribuyen a través de los puertos de expansión de E/S serie desde la bomba 1 hasta las bombas 2-3. Las bombas 1-3 están equipadas con jeringas de vidrio ('jeringas 1-3', aquí usamos jeringas de volumen muerto de 250 μL/cero). Cada válvula tiene dos posiciones, 'cargar' y 'dispensar'. La posición de "carga" se utiliza para aspirar la muestra en la jeringa. Una pieza corta (~ 3 - 4 cm) de tubo sin bridas ETFE/ETFE de 1/16" O.D., 0.01′′ I.D. se conecta a través de accesorios sin bridas ETFE/ETFE a la posición de "carga" de las válvulas 1-3. Esta pieza corta de tubo llega al depósito de muestra (generalmente un tubo de plástico de 1.5 ml o 0.5 ml). La posición de "dispensación" conduce a la boquilla de pulverización. La conexión entre la salida de "dispensación" y la boquilla de pulverización se realiza mediante tubos de PE (~ 20-30 cm de longitud, 0.043 "O.D., 0.015" I.D.), con una pieza corta de tubo de manga (~ 0.5 cm) y accesorios sin brida ETFE / ETFE.
El émbolo neumático El TED utiliza un émbolo neumático para acelerar la rejilla y moverla a través del aerosol de muestra hacia el recipiente de etano líquido. Las pinzas de presión negativa sujetan la rejilla, atornilladas en un soporte casero que está montado en un cilindro neumático de doble varilla(Figura 2A).
La presión se suministra desde un gran cilindro de gas nitrógeno (tamaño W), equipado con un regulador multietapa (0 - 10 bar, 'presión principal'). Los tubos flexibles de PVC reforzado (12 mm O.D.) conectan el regulador a un colector de 12 puertos donde se entrega nitrógeno presurizado a la boquilla y al émbolo neumático. El flujo de gas a través de la boquilla es constante, regulado directamente en el cilindro de nitrógeno (presión principal). La conexión a la boquilla se realiza con tubos de PU (4 mm O.D., 2.5 mm I.D.), una pieza corta de tubo de PE (~ 8 cm de longitud, 0.043" O.D., 0.015" I.D.) y conectores apropiados. La presión sobre el émbolo neumático se controla a través de una válvula solenoide. Los tubos de PU (4 mm O.D., 2.5 mm I.D.) conectan la válvula solenoide con un regulador y el émbolo neumático, para permitir una presión de inmersión reducida (≤ presión principal). La válvula solenoide está controlada por computadora. En la figura 2Bse ofrece una descripción general esquemática de la configuración.
Tenga en cuenta que con esta configuración la presión de inmersión es siempre igual o menor que la presión del gas de pulverización (presión principal). Sin embargo, la configuración se puede cambiar fácilmente incorporando un segundo regulador aguas arriba de la boquilla de pulverización para permitir velocidades de inmersión más altas a baja presión de gas de pulverización. Las altas presiones (>> 2 bar) pueden dañar la boquilla de pulverización PDMS.
PRECAUCIÓN: Este es un sistema presurizado y la "presión principal" siempre debe ser de < 7 bar.
Las presiones entre 0,5 y 2 bar se utilizan típicamente para el émbolo neumático y muestran una relación aproximadamente lineal entre la presión y la velocidad (en la posición vertical de la pulverización). Las velocidades de inmersión se miden con un osciloscopio, conectado en línea con un potenciómetro deslizante (10 kΩ) y en paralelo con una resistencia de 2 kΩ(Figura 2C). Una fuente de alimentación proporciona al potenciómetro 9 V DC. Mientras que la velocidad de inmersión aproximada se establece antes del experimento estableciendo la presión de inmersión, el potenciómetro proporciona una lectura precisa de la velocidad después del experimento.
Boquillas de pulverización y recipiente de etano líquido La fabricación y el funcionamiento de boquillas virtuales dinámicas de gas para la entrega de muestras a base de pulverización se ha descrito en otra parte en detalle15. Como se describió anteriormente, las salidas de "dispensación" de las válvulas 1-3 están conectadas a las entradas de líquido de la boquilla(Figura 3A). El gas de pulverización presurizado está conectado a la entrada de gas de la boquilla. Las entradas en las boquillas de pulverización PDMS son tales que los tubos de PE O.D. de 0.043 "se pueden usar directamente sin la necesidad de accesorios. Nuestro diseño de boquilla contiene una geometría 'jet-in-jet' para la mezcla de dos muestras, similar al dispositivo descrito en la ref.18. Un esquema del diseño se muestra en la Figura 3B,una imagen microscópica de una boquilla se muestra en la Figura 3C. El diseño del dispositivo microfluídico requiere el uso de tres jeringas para mezclar dos muestras. La boquilla de pulverización se coloca típicamente a una distancia de 1-1.5 cm de la rejilla (durante la aplicación de la muestra).
Utilizamos etano líquido como criógeno, en un recipiente líquido de etano / nitrógeno como se utiliza para el método de borrado estándar. El posicionamiento vertical de la copa de etano líquido se logra con una plataforma elevadora de laboratorio.
Control del entorno de pulverización y rejilla El émbolo y la boquilla de pulverización están contenidos dentro de una caja de PMMA (vidrio acrílico) hecha a medida con una puerta doble(Figura 4A). La alta humedad relativa dentro de la caja se logra mediante un sistema de humidificación de aire en la parte posterior del TED(Figura 4B). El aire es suministrado por una bomba y alimentado a un primer recipiente de 10"(normalmente utilizado para la purificación de agua debajo del fregadero). El recipiente está lleno de un nivel bajo (~ 5-10 cm) de agua y también alberga una unidad humidificadora. La alimentación de red del humidificador está controlada por un controlador digital de humedad / temperatura y un sensor de humedad / temperatura ubicado dentro de la caja de vidrio acrílico. El controlador está configurado para apagar la bomba cuando la humedad relativa alcanza ≥ 90 %. El aire humidificado del primer recipiente se bombea a través de un difusor, se sumerge en agua en un segundo recipiente de 10"y luego entra en la caja de vidrio acrílico.
PRECAUCIÓN: Debido a que la muestra está aerosolizada en la boquilla de pulverización, las muestras biológicas o químicas peligrosas no son adecuadas como muestras.
La secuencia de ejecución El botón Ejecutar script del software de control inicia la secuencia de ejecución. Esta secuencia de comandos puede ser predefinido en un archivo de script y alterado a través del software. Las variables más importantes se explican aquí:
Velocidad de pulverización: La velocidad de pulverización determina el caudal de líquido utilizado por la bomba de jeringa. El caudal se puede calcular de la siguiente manera: Los motores de la bomba de jeringa utilizados aquí tienen un tamaño de paso fijo. El rango completo de la bomba se divide en 48,000 pasos. El segundo factor importante es el volumen de la jeringa. Normalmente utilizamos jeringas de 250 μL. La velocidad de pulverización en el software de control se establece como número de pasos/segundo. Una velocidad de pulverización de 1000 pasos/segundo corresponde a:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62199/62199eq01.jpg">
Volumen de pulverización: El volumen de pulverización determina el volumen total a rociar. Por lo tanto, también determina la duración del aerosol. El volumen de pulverización en el software de control se establece como una serie de pasos. Un volumen de pulverización de 2000 pasos, a una velocidad de pulverización de 1000 pasos / segundo, conduce a una duración de pulverización de 2 s y un volumen total de 10,4 μL.
Tiempo de pre-pulverización: Esta variable define el tiempo entre el inicio de la pulverización y la inmersión. Es importante elegir el tiempo de retardo de modo que el spray tenga tiempo suficiente para estabilizarse antes de sumergir la rejilla. Por lo general, el aerosol se administra de 1.5 a 4 s para estabilizarse antes de que la rejilla se hunda. El spray se mantiene hasta que la rejilla se ha movido. Por lo general, el flujo de líquido (y por lo tanto el aerosol) se detiene de 0,5 a 1 s después de que la rejilla se ha hundido. Usando una velocidad de pulverización de 1000 pasos / s y un volumen de pulverización de 2000 pasos, un tiempo típico de pre-pulverización es de 1.5 s, por ejemplo.
Una secuencia ejemplar de comandos se muestra en la Figura 5A,la posición de la cuadrícula a lo largo del tiempo se ilustra en la Figura 5B.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Time resolved device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylic glass box</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital humidity/temperature controller</td>
			<td>THE20 digital humidity/temperature controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual rod pneumatic cylinder</td>
			<td>dual rod pneumatic cylinder TN 10x70</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP tubing</td>
			<td>Upchurch Scientific 1/16&#8221; O.D., 0.01&#39;&#39; I.D. FEP tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flangeless fittings</td>
			<td>Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td>12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass syringes</td>
			<td>Kloehn 250 &#181;L zero-dead volume</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidifier pump</td>
			<td>Interpret Aqua Air AP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid ethane container</td>
			<td>from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multistage regulator</td>
			<td>GASARC class 3 multistage regulator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative pressure tweezers</td>
			<td>Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Hantek 6022BE oscilloscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE tubing</td>
			<td>Scientific Commodities Inc. 0.043&#8221; O.D., 0.015&#8221; I.D. PE tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Mean Well GSM160A24-R7B</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Wanptek KPS305D power supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU tubing</td>
			<td>SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulator</td>
			<td>Norgren R72G-2GK-RMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide potentiometer</td>
			<td>PS100 slide potentiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solenoid valve</td>
			<td>SMC NVJ314M solenoid valve</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe drive pumps</td>
			<td>Kloehn V6 48K model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apoferritin from equine spleen</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A3660</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A2383</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-EM grids</td>
			<td>Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich E3889</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-actin</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glow-discharger</td>
			<td>Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, H7006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich, P1190</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M8266</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M1254</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, S9888</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal muscle myosin S1</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 1</td>
			<td>Spudich, J. A. &#38; Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 2</td>
			<td>White, H. &#38; Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy

El campo de la microscopía crio-electrónica (crio-EM) se está desarrollando rápidamente con nuevo hardware y algoritmos de procesamiento, produciendo estructuras de mayor resolución e información sobre sistemas más desafiantes. La preparación de muestras para crio-EM está experimentando una revolución similar con nuevos enfoques que se están desarrollando para reemplazar los sistemas tradicionales de blotting. Estos incluyen el uso de dispensadores piezoeléctricos, impresión de pines y pulverización directa. Como resultado de estos desarrollos, la velocidad de preparación de la red está pasando de segundos a milisegundos, proporcionando nuevas oportunidades, especialmente en el campo de la crio-EM resuelta en el tiempo, donde las proteínas y los sustratos se pueden mezclar rápidamente antes de la congelación por inmersión, atrapando estados intermedios de corta duración. Aquí describimos, en detalle, un protocolo estándar para hacer cuadrículas en nuestro dispositivo EM interno resuelto en el tiempo, tanto para la preparación de la cuadrícula rápida estándar como para experimentos resueltos en el tiempo. El protocolo requiere un mínimo de aproximadamente 50 μL de muestra a concentraciones de ≥ 2 mg / ml para la preparación de 4 rejillas. El retraso entre la aplicación de la muestra y la congelación puede ser tan bajo como 10 ms. Una limitación es el aumento del espesor del hielo a velocidades más rápidas y en comparación con el método de borrado. Esperamos que este protocolo ayude a otros a diseñar sus propios dispositivos de fabricación de redes y a aquellos interesados en diseñar experimentos resueltos en el tiempo.

Preparación rápida de la rejilla con el TED Como muestra de prueba para la preparación rápida de la rejilla, hemos utilizado apoferritina del bazo equino a 20 μM en 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5. Se obtuvo una reconstrucción a una resolución de 3,5 Å a partir de 690 micrografías como se describe en la ref.15 (Figura 7A). Se eligió el rango de desenfoque para que las partículas puedan identificarse fácilmente en las imágenes en bruto...

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Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el uso de un dispositivo de fabricación de cuadrícula rápida tanto para la fabricación rápida de rejillas como para la mezcla y congelación rápidas para realizar experimentos resueltos en el tiempo.

Preparación rápida de la rejilla para la crio-microscopía electrónica resuelta en el tiempo

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Hola, y bienvenidos a este video de JoVE. Queremos presentarle la configuración que tenemos aquí para la creación rápida de cuadrículas, un estudio resuelto en el tiempo que estamos desarrollando en Leeds. Tenga en cuenta que este no es un sistema estándar, pero esperamos que al darle una cuenta detallada de todas las cosas y los parámetros que hacemos, pueda desarrollar sistemas similares en sus propios laboratorios.Una descripción detallada del dispositivo se da en el protocolo de Richmond. Aquí, vamos a dar una guía paso a paso para una preparación rápida de la cuadrícula y em resuelto en el tiempo. En nuestra experiencia, la concentración de proteínas debe ser de dos miligramos por mililitro o más. El protocolo requiere un volumen mínimo de unos 50 microlitros.Encienda el dispositivo. Luego encienda la PC de control e inicie el software de control. Inicialice todas las bombas de jeringa presionando el botón de inicialización en cada bomba de jeringa.Encienda la fuente de alimentación del potenciómetro, configálelo a nueve voltios e inicie el software de control del osciloscopio. Se necesita gas nitrógeno presurizado para generar el aerosol. Abra el cilindro de nitrógeno y ajuste la presión a 2 bar.Asegúrese de que todas las válvulas de la bomba de jeringa estén en posición de carga. Para hacer esto, cambie todas las válvulas para dispensar en el software de control y luego vuelva a cargar. Ajuste todas las jeringas a cero.Cualquier burbuja de aire presente en el sistema debe eliminarse en esta etapa. Para hacer esto, las jeringas pueden tener que ser desenroscados, las burbujas retiradas manualmente, y las jeringas montadas de nuevo cuando no contienen más burbujas. El sistema de manejo de líquidos generalmente se almacena en agua.Antes de cargar la muestra, el sistema se equilibra con el búfer. Esto se hace lavando el tubo con un exceso de tampón. Coloque un tubo que contenga al menos 200 microlitros de tampón sobre la jeringa uno.La parte superior del tubo debe perforarse para unirlo. Aspire una cantidad adecuada de tampón, entre 50 y cien microlitros con jeringa uno utilizando el software de control. Cambie la válvula uno para dispensar.Dispense todo el líquido en la jeringa uno. Devuelva la válvula uno a la posición de carga y presione el botón de inicialización en la jeringa uno para preparar el sistema para el siguiente ciclo de lavado. Estos pasos generalmente se repiten tres veces para garantizar un lavado completo de la tubería.A continuación, se coloca la boquilla de pulverización. Coloque una rejilla EM en el brazo de hundimiento. Coloque la rejilla frente a la boquilla de pulverización.Dispense el búfer utilizando el software de control. Si la boquilla y la rejilla están alineadas, el líquido debe acumularse después de la pulverización durante un período prolongado de tiempo. Si es necesario, ajuste la posición de la boquilla y luego verifique nuevamente dónde se acumula el líquido en la rejilla.A continuación, ajuste la posición de la copa de etano. La punta de las pinzas debe llegar aproximadamente al centro de la copa de etano. Realice una ejecución de prueba para asegurarse de que todas las configuraciones son correctas.Cierre la cámara de humedad. Asegúrese de que el camino del émbolo esté despejado. Aspire el volumen de tampón requerido para una sola carrera en jeringa uno.Cambie la válvula uno para dispensar. Inicie la ejecución presionando run'in en el software de control. Compruebe que la bomba de jeringa uno está en movimiento, dos segundos en este caso, y la rejilla se hunde después de un retraso apropiado, 1,5 segundos aquí.Cuando termine la carrera, ajuste la presión sobre el brazo del émbolo al valor deseado. Presione OK'in en el software de control para liberar la presión del brazo que se hunde. Ahora la taza de etano está fría y llena de etano líquido.Descarga con brillo las rejillas antes de usarlas. Una descarga de resplandor típica es de 90 segundos a 10 miliamperios en aire de 0,1 milibares. El tubo se equilibra con la muestra.Si el volumen de muestra disponible es bajo, el tubo puede equilibrarse con un solo volumen muerto. Muestra aspirada. Por lo general, el volumen muerto es de alrededor de 30 microlitros.Cambie la válvula uno para dispensar. Dispensar la muestra a través de tubos y boquillas. A continuación, aspire la cantidad de muestra requerida para una sola ejecución.Cambie la válvula uno para dispensar. Compruebe que la humedad relativa ha alcanzado el valor deseado. Por lo general, preparamos cuadrículas al 60% o más.Esto puede tardar unos minutos. Coloque las pinzas que sostienen una rejilla descargada por resplandor en el brazo de inmersión. Coloque la corredera del potenciómetro en la posición de inicio, lista para la medición de velocidad.Configure el disparador para la medición de velocidad en el software del osciloscopio. Coloque la taza de etano líquido y cerca de la cámara de humedad. Asegúrese de que el camino del émbolo esté despejado.Inicie la ejecución en el software de control. Cuando termine la ejecución, presione OK'in en el software de control para liberar la presión del brazo que se hunde. Abra la cámara de humedad, afloje la conexión entre el brazo de inmersión y las pinzas.Suba por el brazo de inmersión mientras mantiene la rejilla en etano líquido. Luego transfiera las rejillas al nitrógeno líquido y al almacenamiento. Guarde la medición del osciloscopio.Restablezca manualmente la posición del control deslizante y el émbolo del potenciómetro. Repita el protocolo para preparar cuadrículas de réplica. Los experimentos resueltos en el tiempo se realizan de manera similar.Se necesitan concentraciones de stock más altas para los experimentos resueltos en el tiempo debido a la dilución en la etapa de mezcla. Para un experimento resuelto en el tiempo, use las tres jeringas. El tubo está conectado a las bombas de la jeringa y a la boquilla de pulverización.La boquilla de pulverización microfluídica utilizada aquí también contiene un elemento de mezcla. Tenga en cuenta que los tubos más largos darán un volumen muerto más grande y los pasos de equilibrio de lavado requieren más tampón y muestra. Equilibre todas las jeringas con tampón y muestree por separado.Por lo general, la jeringa uno se usa para la muestra A' y las jeringas dos y tres se usan para la muestra B'Después de equilibrar el tubo, cargue la muestra A en la jeringa uno y la muestra B en las jeringas dos y tres. Luego, cambie las válvulas de una a tres para dispensar. Inicie la ejecución en el software de control.Tenga en cuenta que se necesita un script de ejecución diferente para un experimento resuelto en el tiempo. Se pueden lograr diferentes retrasos de tiempo de dos maneras. Al ajustar la velocidad del émbolo, se puede cambiar el retraso de tiempo desde la mezcla hasta la congelación.Una velocidad de inmersión más rápida conducirá a un retraso de tiempo más corto. Alternativamente, la distancia de etano de pulverización se cambia ajustando la posición vertical de la boquilla de pulverización. Aumentar la distancia resultará en un retraso de tiempo más largo.En el microscopio electrónico a bajo aumento, una cuadrícula típica se ve así. Las áreas de hielo delgado, como se indica, son adecuadas para la adquisición de datos. A aumentos más altos, las partículas deben ser claramente visibles.Con una muestra de prueba como la apoferritina, un conjunto de datos relativamente pequeño de una sola cuadrícula es suficiente para una reconstrucción a una resolución de tres a cuatro angstrom. Para los experimentos resueltos en el tiempo, recopilamos conjuntos de datos de diferentes puntos de tiempo o cuadrículas. Es útil combinar los datos para la clasificación 3D y luego rastrear las partículas hasta sus puntos de tiempo.De esta manera, los datos pueden proporcionar información estructural e información sobre la cinética de reacción. En conclusión, esperamos que os haya gustado el vídeo. Esperamos que con las descripciones detalladas en el documento de JoVE junto con el video, pueda realizar sus propios experimentos a través de la creación rápida de cuadrículas, que se ha demostrado que alivia algunos de los problemas de mutación o ayuda con las interacciones en la interfaz aire-agua, todo lo que necesita para realizar sus propios estudios resueltos en el tiempo para tratar de atrapar algunos de esos estados de no equilibrio.Entonces, feliz fabricación de cuadrículas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigación

Bioquímica

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparación y micromecanizado Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Crio-Tomografía Electrónica

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Microscopía crioelectrónica de partícula única: de la muestra a la estructura

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatronaje Transmisión Microscopía Microscopía Rejillas para Dirigir el Posicionamiento Celular dentro de los Flujos de Trabajo de Tomografía Crioelectrónica de Celda Entera

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Un robusto flujo de trabajo de procesamiento de criomicroscopía electrónica de una sola partícula (cryo-EM) con cryoSPARC, RELION y Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Preparación de partículas de núcleo de nucleosomas complejadas con factores de reparación de ADN para la determinación estructural de la criomicroscopía electrónica

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Extracción de microtúbulos modificados de células de mamíferos para estudiar complejos microtúbulos-proteínas mediante microscopía crioelectrónica

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Aplicación de grafeno monocapa a rejillas de criomicroscopía electrónica para la determinación de estructuras de alta resolución

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...