Name: fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

Vi vill tacka Molly S.C. Gravett för hjälpsamma diskussioner och ABSL:s anläggningspersonal för hjälp med kryo-EM-datainsamling. David P. Klebl är doktorand på Wellcome Trusts 4-åriga doktorandprogram i The Astbury Centre finansierat av University of Leeds. FEI Titan Krios mikroskop finansierades av University of Leeds (UoL ABSL award) och Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Detta arbete finansierades av ett BBSRC-anslag till Stephen P. Muench (BB/P026397/1) och stöddes av forskningsanslag till Howard D. White från American Heart Association (AMR21-236078) och Howard D. White och Vitold Galkin från U.S. National Institutes of Health (171261).

1. Förbereda systemet
I följande protokoll beskrivs hur du förbereder rutnät för ett enda prov. Vanligtvis förbereds minst 2 replikatrutnät för varje prov eller tillstånd. För snabbare avsvalkningshastigheter (mindre än ~ 20 ms tidsfördröjning) är 3 eller 4 replikatnät vanligtvis beredda att ta hänsyn till ett minskat antal tunna isområden.
<ol><li>Späd proteinprovet till målkoncentrationen i önskad buffert. Vanligtvis fungerar slutliga koncentrationer ≥ 2 mg/ml bra fö...

<ol>
	<li>Murphy, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotary+substates+of+mitochondrial+ATP+synthase+reveal+the+basis+of+flexible+F1-Fo+coupling.">Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling.</a> Science. 364, (2019).</li><li>Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+transitions+in+influenza+haemagglutinin+at+membrane+fusion+pH.">Structural transitions in influenza haemagglutinin at membrane fusion pH.</a> Nature. , 1-4 (2020).</li><li>Dance, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motion+on+ice.">Molecular motion on ice.</a> Nature Methods. , 1-5 (2020).</li><li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it.">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> Elife. 8, 42747 (2019).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM.">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15, 793-795 (2018).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behaviour+during+cryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behaviour during cryoEM grid preparation at different timescales.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Ravelli, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structures+from+sub-nl+volumes+using+pin-printing+and+jet+vitrification.">Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification.</a> Nature Communications. 11, 1-9 (2020).</li><li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts.">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> Journal of Structural Biology. 197, 220-226 (2017).</li><li>Razinkov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+vitrifying+samples+for+cryoEM.">A new method for vitrifying samples for cryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 195, 190-198 (2016).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+effective+microfluidic+spraying-plunging+method+for+high-resolution+single-particle+cryo-EM.">A fast and effective microfluidic spraying-plunging method for high-resolution single-particle cryo-EM.</a> Structure. 25, 663-670 (2017).</li><li>Ashtiani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+femtolitre+droplets+using+surface+acoustic+wave+based+atomisation+for+cryo-EM+grid+preparation.">Delivery of femtolitre droplets using surface acoustic wave based atomisation for cryo-EM grid preparation.</a> Journal of Structural Biology. 203, 94-101 (2018).</li><li>Rubinstein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shake-it-off:+a+simple+ultrasonic+cryo-EM+specimen-preparation+device.">Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).</li><li>M&#228;eots, M. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microfluidics+enables+kinetic+insight+from+time-resolved+cryo-EM.">Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM.</a> Nature Communications. 11, 1-14 (2020).</li><li>Kontziampasis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-EM+grid+preparation+device+for+time-resolved+structural+studies.">A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies.</a> IUCrJ. 6, (2019).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+deposition+onto+cryo-EM+grids:+from+sprays+to+jets+and+back.">Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).</li><li>White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+generation+apparatus+for+time-resolved+electron+cryo-microscopy+using+stepper+motors+and+electrospray.">A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray.</a> Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).</li><li>Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Complex Assembly. , 59-71 (2018).</li><li>Trebbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+liquid+jet+system+with+compatibility+for+atmospheric+and+high-vacuum+conditions.">Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions.</a> Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).</li><li>Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-grid+and+in-flow+mixing+for+time-resolved+Cryo-EM.">On-grid and in-flow mixing for time-resolved Cryo-EM.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2021).</li><li>He, S., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+reconstruction+in+RELION.">Helical reconstruction in RELION.</a> Journal of Structural Biology. 198, 163-176 (2017).</li><li>Millar, N. C., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limiting+rate+of+the+ATP-mediated+dissociation+of+actin+from+rabbit+skeletal+muscle+myosin+subfragment+1.">The limiting rate of the ATP-mediated dissociation of actin from rabbit skeletal muscle myosin subfragment 1.</a> FEBS Letters. 160, 141-148 (1983).</li><li>Kasas, S., Dumas, G., Dietler, G., Catsicas, S., Adrian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+cryoelectron+microscopy+specimens+revealed+by+high-speed+photographic+imaging.">Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging.</a> Journal of Microscopy. 211, 48-53 (2003).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading.">Defocus-dependent Thon-ring fading.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+flow+kinetics.">A beginner's guide to flow kinetics.</a> The Biochemist. 42, (2020).</li></ol>

Protokollen i detta arbete kan användas för snabb nätberedning genom direkt sprutning och TrEM-experiment. Snabb nätberedning kan användas för att minska partikelinteraktioner med luftvattengränssnittet5. De viktigaste begränsningarna är den tillgängliga provkoncentrationen och istjockleken på nätet. Inom dessa gränser och förutsatt att provkvaliteten är god, producerar protokollet galler som är lämpliga för högupplöst cryo-EM.
Felsökning</s...

Bakgrund Den senaste utvecklingen inom kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) har möjliggjort strukturella studier av alltmer komplexa system med hög upplösning. Med få undantag har sådana studier begränsats till biologiska makromolekyler vid jämvikt1 eller relativt långsamma reaktioner2. Många processer in vivo sker i en snabbare tidsskala (millisekunder) och det finns ett ökande intresse för tidsupp lös cryo-EM (TrEM) på dessa tidsskalor3. Konventionell cryo-EM provberedning med blotting-metoden är dock för långsam för millisekskond TrEM.
Blotting-metoden har andra begränsningar än dålig tidsupplösning. Proteiner och proteinkomplex kan drabbas av denaturering eller föredragen orientering på galler4. Att minska exponeringstiden för luft-vatten-gränssnittet under provberedningen har visat sig mildra önskad orientering och proteindenaturering5,6. Således möjliggör snabb nätberedning inte bara millisekekunder trEM utan kan också förbättra nätkvaliteten.
För närvarande finns det tre olika metoder för automatiserad nät förberedelse. Den första metoden använder en stift eller kapillär som rymmer en liten mängd prov. När provet har etablerat kontakt mellan vätskan och gallrets yta "skrivs" det pårutnätet 7,8. Exempel program processen är relativt långsam och tar några sekunder. Ett alternativt tillvägagångssätt använder kontrollerad droppgenerering av en piezo dispenser och självtransporterande galler9. Detta gör det möjligt för snabbare dispens att frysa tider, men begränsas fortfarande av droppe och wicking hastighet (för närvarande når 54 ms). Det snabbaste tillvägagångssättet hittills är den direkta spraymetoden, där provet finfördelas i ett sprutmunstycke och de små (~ 10 - 20 μm) och snabba (> 5 m/s) dropparna sprids vid kontakt med cryo-EM-nätet. Provsprayen kan genereras på olika sätt som luftblästringsatomer, akustiska ytvågor eller ultraljudsfuktare10,11,12,13. Enligt vår erfarenhet är istjockleken med direkt sprutning större men direkt sprutning gör det möjligt att frysa < 10 ms.
Detta protokoll beskriver steg för steg hur en tidsupp lös EM-enhet (TED) utrustad med ett mikrofluidiskt sprutmunstycke kan användas för att förbereda galler på en snabb tidsskala14,15. Enheten har använts för att förbereda galler med en minsta fördröjningstid på 6 ms mellan provapplicering och frysning och för att snabbt blanda och frysa två prover. Utformningen av TED är baserad på en tidigare version16 och liknar andra spraybaserade tidsbefriade cryo-EM-enheter17.
Först beskrivs de fyra huvuddelarna i TED-installationen. Kärnan i TED är vätskehanteringsenheten, som ansvarar för provambition och dispensering. En pneumatisk kolv flyttar gallret genom sprayen till den flytande etanen. Generering av sprayen uppnås med mikrofluidiska sprutmunstycken och frysning sker i en flytande etanbehållare, som beskrivs kortfattat. Slutligen markeras de ytterligare funktionerna för att styra nätmiljön, särskilt fuktighet. Detta följs av detaljerade protokoll för driften av enheten och för att utföra TrEM-experiment. Representativa resultat ges för snabb nätberedning och ett enkelt TrEM-experiment.
Experimentell installation
Vätskehanteringsenheten TED:s vätskehanteringssystem bildas av tre sprutpumpar ("pumparna 1 - 3"), var och en utrustad med en roterande ventil (figur 1). En strömförsörjning ger pumpar 1 - 3 med 24 V DC. Kommunikationen med styrprogramvaran (skriven i Visual Basic och C++) sker via ett RS232-gränssnitt för att pumpa 1. Kommandona distribueras via de seriella I/O-expansionsportarna från pump 1 till pumparna 2-3. Pumparna 1-3 är utrustade med glassprutor ("sprutor 1-3", vi använder 250 μL/noll döda volymsprutor här). Varje ventil har två lägen, "last" och "dispense". Lastläget används för att aspirera prov i sprutan. En kort bit (~ 3 - 4 cm) av 1/16" O.D., 0.01′′ I.D. FEP-slangar ansluts via ETFE / ETFE flänslösa beslag till "belastnings" -positionen för ventiler 1-3. Denna korta rörbit når in i provbehållaren (vanligtvis ett plaströr på 1,5 ml eller 0,5 ml). Dispenseringsläget leder till sprutmunstycket. Anslutningen mellan "dispense"-uttaget och sprutmunstycket görs genom PE-slangar (~ 20-30 cm längd, 0,043" O.D., 0,015" ID), med en kort bit ärmrör (~ 0,5 cm) och ETFE / ETFE flänslösa beslag.
Den pneumatiska kolven TED använder en pneumatisk kolv för att accelerera gallret och flytta det genom provsprayen till den flytande etanbehållaren. Pincett med undertryck håller gallret, skruvat i en hembyggd hållare som är monterad på en pneumatisk cylinder med dubbla stångar (figur 2A).
Trycket levereras från en stor kvävegascylinder (storlek W), utrustad med en multistageregulator (0- 10 bar, "huvudtryck"). Flexibla förstärkta PVC-slangar (12 mm O.D.) förbinder regulatorn med ett grenrör med 12 portar där trycksatt kväve levereras till munstycket och den pneumatiska kolven. Gasflödet genom munstycket är konstant, reglerat direkt vid kvävecylindern (huvudtrycket). Anslutningen till munstycket är gjord med PU-slangar (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), en kort bit PE-slang (~ 8 cm längd, 0,043" O.D., 0,015" I.D.) och lämpliga kontakter. Trycket på den pneumatiska kolven styrs genom en magnetventil. PU-slangar (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) förbinder magnetventilen med en regulator och den pneumatiska kolven för att möjliggöra ett reducerat avsvalkningstryck (≤ huvudtryck). Magnetventilen är datorstyrd. En schematisk översikt över installationen ges i figur 2B.
Observera att med denna inställning är avsvalkningstrycket alltid lika med eller mindre än sprutgastrycket (huvudtrycket). Installationen kan dock enkelt ändras genom att en andra regulator införlivas uppströms sprutmunstycket för att möjliggöra högre avsvalkningshastigheter vid lågt sprutgastryck. Högt tryck (>> 2 bar) kan skada PDMS spraymunstycke.
VARNING: Detta är ett trycksystem och "huvudtrycket" ska alltid vara < 7 bar.
Tryck mellan 0,5 och 2 bar används vanligtvis för den pneumatiska kolven och visar ett ungefär linjärt förhållande mellan tryck och hastighet (i sprayens vertikala läge). Avsvalkningshastigheter mäts med ett oscilloskop, anslutet i linje med en glidpotentiometer (10 kΩ) och parallellt med ett 2 kΩ-motstånd (Figur 2C). En strömförsörjning ger potentiometern 9 V LIKSTRÖM. Medan den ungefärliga avsvalkningshastigheten ställs in före experimentet genom att ställa in avsvalkningstrycket, ger potentiometern en exakt avläsning av hastigheten efter experimentet.
Sprutmunstycken och flytande etanbehållare Tillverkning och drift av gasdynamiska virtuella munstycken för spraybaserad provleverans har beskrivits någon annanstans i detalj15. Som beskrivits ovan är ventilernas "dispense"-utlopp 1-3 anslutna till munstyckets vätskeinlopp(figur 3A). Den trycksatta spraygasen ansluts till munstyckets gasinlopp. Inloppen i PDMS-sprutmunstyckena är sådana att 0,043" O.D. PE-slangar kan användas direkt utan behov av beslag. Vår munstycksdesign innehåller en "jet-in-jet"-geometri för blandning av två prover, liknande den anordning som beskrivs i ref.18. Ett ritningsschema för konstruktionen visas i figur 3B, en mikroskopisk bild av ett munstycke visas i figur 3C. Utformningen av den mikrofluidiska enheten kräver användning av tre sprutor för att blanda två prover. Sprutmunstycket är vanligtvis placerat på 1-1,5 cm avstånd från gallret (under provapplicering).
Vi använder flytande etan som kryogen, i en flytande etan/ kvävebehållare som används för standard blotting-metoden. Vertikal positionering av vätskeetankoppen uppnås med en laboratorielyftplattform.
Kontroll av sprut- och nätmiljön Kolven och sprutmunstycket finns i en specialbyggd PMMA-låda (akrylglas) med dubbeldörr (Figur 4A). Hög relativ luftfuktighet inuti lådan uppnås genom ett luftfuktningssystem på baksidan av TED(figur 4B). Luft levereras av en pump och matas in i en första 10" behållare (vanligtvis används för vattenrening under diskbänk). Behållaren är fylld med en låg (~ 5-10 cm) vattennivå och rymmer även en luftfuktare. Nätström till luftfuktaren styrs av en digital fukt-/temperaturregulator och en fukt-/temperatursensor som finns inuti akrylglaslådan. Styrenheten är inställd på att stänga av pumpen när den relativa luftfuktigheten når ≥ 90 %. Fuktad luft från den första behållaren pumpas genom en diffusor, nedsänkt i vatten i en andra 10"-behållare och går sedan in i akrylglaslådan.
VARNING: Eftersom provet aerosoliseras i sprutmunstycket är farligt biologiskt eller kemiskt prov inte lämpligt som prover.
Körsekvensen Knappen Kör skript i kontrollprogramvaran initierar körningssekvensen. Den här kommandosekvensen kan fördefinieras i en skriptfil och ändras via programvaran. De viktigaste variablerna förklaras här:
Sprayhastighet: Sprayhastigheten bestämmer det vätskeflöde som används av sprutpumpen. Flödeshastigheten kan beräknas enligt följande: De sprutpumpsmotorer som används här har en fast stegstorlek. Pumpens hela räckvidd är uppdelad i 48 000 steg. Den andra viktiga faktorn är sprutvolymen. Vi använder vanligtvis 250 μL sprutor. Spruthastigheten i styrprogramvaran är inställd som antal steg/sekund. En spruthastighet på 1000 steg/sekund motsvarar:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62199/62199eq01.jpg">
Sprayvolym: Sprayvolymen bestämmer den totala volymen som ska sprutas. Således bestämmer det också sprayens varaktighet. Sprayvolymen i styrprogramvaran är inställd som ett antal steg. En sprayvolym på 2000 steg, med en sprayhastighet på 1000 steg/sekund, leder till en spraylängd på 2 s och en total volym på 10,4 μL.
Pre-spray tid: Denna variabel definierar tiden mellan initiering av sprayen och dopp. Det är viktigt att välja fördröjningstiden så att sprayen har tillräckligt med tid att stabilisera innan du fäller gallret. Vanligtvis ges sprayen 1,5 - 4 s för att stabiliseras innan gallret kastas. Sprayen bibehålls tills gallret har gått igenom. Vanligtvis stoppas vätskeflödet (och därmed sprayen) 0,5 till 1 s efter att gallret har kastats. Med en sprayhastighet på 1000 steg/s och en sprayvolym på 2000 steg är en typisk pre-spraytid till exempel 1,5 s.
En exemplarisk sekvens av kommandon visas i figur 5A, rutnätets position över tiden illustreras i figur 5B.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Time resolved device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylic glass box</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital humidity/temperature controller</td>
			<td>THE20 digital humidity/temperature controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual rod pneumatic cylinder</td>
			<td>dual rod pneumatic cylinder TN 10x70</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP tubing</td>
			<td>Upchurch Scientific 1/16&#8221; O.D., 0.01&#39;&#39; I.D. FEP tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flangeless fittings</td>
			<td>Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td>12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass syringes</td>
			<td>Kloehn 250 &#181;L zero-dead volume</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidifier pump</td>
			<td>Interpret Aqua Air AP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid ethane container</td>
			<td>from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multistage regulator</td>
			<td>GASARC class 3 multistage regulator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative pressure tweezers</td>
			<td>Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Hantek 6022BE oscilloscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE tubing</td>
			<td>Scientific Commodities Inc. 0.043&#8221; O.D., 0.015&#8221; I.D. PE tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Mean Well GSM160A24-R7B</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Wanptek KPS305D power supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU tubing</td>
			<td>SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulator</td>
			<td>Norgren R72G-2GK-RMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide potentiometer</td>
			<td>PS100 slide potentiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solenoid valve</td>
			<td>SMC NVJ314M solenoid valve</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe drive pumps</td>
			<td>Kloehn V6 48K model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apoferritin from equine spleen</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A3660</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A2383</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-EM grids</td>
			<td>Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich E3889</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-actin</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glow-discharger</td>
			<td>Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, H7006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich, P1190</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M8266</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M1254</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, S9888</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal muscle myosin S1</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 1</td>
			<td>Spudich, J. A. &#38; Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 2</td>
			<td>White, H. &#38; Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy

Området kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) utvecklas snabbt med nya hårdvaru- och bearbetningsalgoritmer, vilket ger strukturer med högre upplösning och information om mer utmanande system. Provberedningen för cryo-EM genomgår en liknande revolution med nya metoder som utvecklas för att ersatt de traditionella blotting-systemen. Dessa inkluderar användning av piezo-elektriska dispensrar, stiftutskrift och direkt sprutning. Som ett resultat av denna utveckling går nätberedningens hastighet från sekunder till millisekunder, vilket ger nya möjligheter, särskilt när det gäller tidsuppfrista cryo-EM där proteiner och substrat snabbt kan blandas före dykfrysning och fånga kortlivade mellanliggande tillstånd. Här beskriver vi i detalj ett standardprotokoll för att göra rutnät på vår interna tids lösta EM-enhet både för standard snabb nätförberedelse och även för tids lösta experiment. Protokollet kräver minst ca 50 μL prov vid koncentrationer av ≥ 2 mg/ml för beredning av 4 rutnät. Fördröjningen mellan provprogram och frysning kan vara så låg som 10 ms. En begränsning är ökad istjocklek vid snabbare hastigheter och jämfört med blottingmetoden. Vi hoppas att detta protokoll kommer att hjälpa andra att utforma sina egna nättillverkningsanordningar och de som är intresserade av att utforma tids lösta experiment.

Snabb nätförberedelse med TED Som ett testprov för snabb gallerberedning har vi använt apoferritin från häst mjälte vid 20 μM i 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5. En rekonstruktion klockan 3.5 Å-upplösning erhölls från 690 mikrografer enligt beskrivningen i ref.15 (Figur 7A). Defokusområdet valdes så att partiklar lätt kan identifieras i de råa bilderna (Figur 7B). Ett typiskt rutnät som förberetts med...

Watch this Scientific Journal Video about Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för användning av en snabb nättillverkningsenhet för både snabb nättillverkning och för snabb blandning och frysning för att utföra tidsbefriade experiment.

Snabb gallerförberedelse för tidsupp lös Cryo-Electron mikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Hej, och välkommen till denna JoVE"-video. Vi vill presentera dig för upplägget som vi har här för snabb nättillverkning, en tidsuppfrid studie som vi utvecklar i Leeds. Var medveten om att detta inte är ett standardsystem, men vi hoppas att genom att ge dig en detaljerad redogörelse för alla saker och parametrar som vi gör, kommer du att kunna utveckla liknande system i dina egna laboratorier.En detaljerad beskrivning av enheten ges i Richmond-protokollet. Här kommer vi att ge en steg-för-steg-guide för snabb nätförberedelse och tids löst EM. Enligt vår erfarenhet bör proteinkoncentrationen vara två milligram per milliliter eller högre. Protokollet kräver en minsta volym på cirka 50 mikroliter.Slå på enheten. Slå sedan på kontrolldatorn och starta kontrollprogramvaran. Initiera alla sprutpumpar genom att trycka på initieringsknappen på varje sprutpump.Slå på potentiometerns strömförsörjning, ställ in den på nio volt och starta oscilloskopkontrollprogramvaran. Trycksatt kvävegas behövs för att generera sprayen. Öppna kvävecylindern och ställ in trycket på 2 bar.Se till att alla sprutpumpventiler är i lastläge. För att göra detta, byt alla ventiler för att dispensera i styrprogramvaran och sedan tillbaka för att ladda. Ställ in alla sprutor på noll.Eventuella luftbubblor som finns i systemet bör tas bort i detta skede. För att göra detta kan sprutorna behöva skruvas loss, bubblor avlägsnas manuellt och sprutorna monteras igen när de inte innehåller några fler bubblor. Vätskehanteringssystemet lagras vanligtvis i vatten.Innan provet läses in jämviktas systemet med buffert. Detta görs genom att tvätta slangen med ett överskott av buffert. Placera ett rör som innehåller minst 200 mikroliter buffert på spruta ett.Toppen av röret måste genomborras för att fästa det. Aspirera en lämplig mängd buffert, mellan 50 och hundra mikroliter med spruta ett med hjälp av kontrollprogramvaran. Byt ventil ett för dispens.Dispensera all vätska i spruta ett. Sätt tillbaka ventil ett i lastläge och tryck på initieringsknappen på spruta ett för att förbereda systemet för nästa tvättcykel. Dessa steg upprepas vanligtvis tre gånger för att säkerställa noggrann tvättning av slangen.Därefter är sprutmunstycket placerat. Placera ett EM-galler i den fallande armen. Placera gallret framför sprutmunstycket.Dispensera bufferten med hjälp av kontrollprogramvaran. Om munstycket och gallret är i linje ska vätska ackumuleras efter sprutning under en längre tid. Vid behov justera munstyckets läge och kontrollera sedan igen var vätskan ackumuleras på gallret.Justera sedan etankoppens position. Pincettens spets bör nå ungefär till mitten av etankoppen. Utför en testkörning för att säkerställa att alla inställningar är korrekta.Stäng fuktighetskammaren. Se till att kolvens bana är tydlig. Aspirera den buffertvolym som krävs för en enda körning i spruta ett.Byt ventil ett för dispens. Starta körningen genom att trycka på run'in kontrollprogramvaran. Kontrollera att sprutpumpen en rör sig, två sekunder i det här fallet, och gallret kastas efter en lämplig fördröjning, 1,5 sekunder här.När körningen är klar ställer du trycket på kolvens arm till önskat värde. Tryck på OK'in kontrollprogramvaran för att frigöra trycket från den fallande armen. Nu är etankoppen sval och fylld med flytande etan.Lys ut gallret före användning. En typisk självurladdning är 90 sekunder vid 10 milliamps i 0,1 millibar luft. Slangen jämviktas sedan med prov.Om den tillgängliga provvolymen är låg kan slangen balanseras med endast en död volym. Aspiratprov. Vanligtvis är den döda volymen cirka 30 mikroliter.Byt ventil ett för dispens. Dispensera provet genom slangar och munstycke. Aspirera sedan den mängd prov som krävs för en enda körning.Byt ventil ett för dispens. Kontrollera att den relativa luftfuktigheten har nått önskat värde. Vi förbereder vanligtvis rutnät på 60% eller högre.Det kan ta några minuter. Placera pincetterna som håller ett glödutloppat galler i den fallande armen. Placera potentiometerrutschbanan i startläge, redo för hastighetsmätning.Ställ in utlösaren för hastighetsmätningen i oscilloskopprogramvaran. Placera den flytande etankoppen och nära fuktighetskammaren. Se till att kolvens bana är tydlig.Starta körningen i kontrollprogramvaran. När körningen är klar trycker du på OK'in kontrollprogramvaran för att frigöra tryck från den fallande armen. Öppna fuktighetskammaren, lossa anslutningen mellan fallande arm och pincett.Flytta upp den fallande armen samtidigt som du håller gallret i flytande etan. Överför sedan näten till flytande kväve och till lagring. Spara oscilloskopmätningen.Återställ potentiometerreglagets och kolvens läge manuellt. Upprepa protokollet för att förbereda replikerade rutnät. Tids lösta experiment görs på ett liknande sätt.Högre lagerkoncentrationer behövs för tidsbefriade experiment på grund av utspädning i blandningssteget. För ett tidsbefriat experiment, använd alla tre sprutorna. Slangen är fastsatt på sprutpumparna och sprutmunstycket.Det mikrofluidiska sprutmunstycket som används här innehåller också ett blandningselement. Observera att längre rör ger en större död volym och tvättbalanseringssteg kräver mer buffert och prov. Balansera alla sprutor med buffert och prov separat.Vanligtvis används spruta ett för prov A' och sprutor två och tre används för prov B'Efter att slangen är jämvikt, ladda prov A i spruta ett och prov B i sprutor två och tre. Byt sedan ventiler ett till tre för att dispensera. Starta körningen i kontrollprogramvaran.Observera att ett annat körningsskript behövs för ett tids löst experiment. Olika tidsfördröjningar kan uppnås på två sätt. Genom att justera kolvens hastighet kan tidsfördröjningen från blandning till frysning ändras.En snabbare dykhastighet leder till en kortare tidsfördröjning. Alternativt ändras sprayetanavståndet genom att justera sprutmunstyckets vertikala läge. Om avståndet ökar blir det en längre tidsfördröjning.I elektronmikroskopet vid låg förstoring ser ett typiskt rutnät ut så här. Områden med tunn is, som anges, är lämpliga för datainsamling. Vid högre förstoringar bör partiklar vara tydligt synliga.Med ett testprov som apoferritin är en relativt liten datauppsättning från ett enda rutnät tillräcklig för en rekonstruktion vid tre till fyra angstromupplösning. För tids lösta experiment samlar vi in datauppsättningar från olika tidpunkter eller rutnät. Det är användbart att kombinera data för 3D-klassificering och sedan spåra partiklar tillbaka till sina tids punkter.På så sätt kan data ge strukturell information och information om reaktionskinetiken. Sammanfattningsvis hoppas vi att du gillade videon. Vi hoppas att med de detaljerade beskrivningarna i JoVE-papperet tillsammans med videon kommer du att kunna utföra dina egna experiment via snabb nättillverkning, vilket har visat sig lindra några av problemen från mutation eller hjälpa till med interaktioner vid luftvattengränssnittet, allt du behöver för att genomföra dina egna tidsavlösta studier för att försöka fånga några av dessa icke-jämviktsstater.Så, glad nättillverkning.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttryck och rening av den mänskliga Lipid-känsliga ering kanal TRPC3 för strukturella bestämning genom Single-particle kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Förberedelse och Kryo-FIB mikromachining av Saccharomyces cerevisiae för Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Mikroskopi: Från prov till struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikropapper transmission elektronmikroskopinät till direkt cellpositionering inom arbetsflöden för hela cell cryo-elektrontomografi

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ett robust arbetsflöde för bearbetning av kryo-elektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) med kryoSPARC, RELION och Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Beredning av nukleosomkärnpartiklar komplexerade med DNA-reparationsfaktorer för kryoelektronmikroskopi Strukturell bestämning

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Extrahera modifierade mikrotubuli från däggdjursceller för att studera mikrotubuli-proteinkomplex med kryoelektronmikroskopi

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Tillämpning av monolagergrafen på kryoelektronmikroskopinät för högupplöst strukturbestämning

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...