Name: dynamic imaging of chimeric antigen receptor t cells with [18f]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography
Uploaded: 2022-02-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography at JoVE.com

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال خط أنابيب Mayo Clinic K2R (SSK) ومركز Mayo Clinic للطب الفردي (SSK) ومؤسسة بريدولين (RS). تم إنشاء الأشكال 1 و 2 و 4 باستخدام BioRender.com.

يتبع البروتوكول إرشادات مجلس المراجعة المؤسسية في Mayo Clinic (مايو كلينك)، ولجنة السلامة البيولوجية المؤسسية، واللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في Mayo Clinic.
1. NIS+ BCMA-CAR إنتاج الخلايا التائية
ملاحظة: يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية لمجلس المر?...

تصف هذه الورقة منهجية لدمج NIS في الخلايا التائية CAR وتصوير الخلايا التائية CAR المشبعة في الجسم الحي من خلال [18F]TFB-PET. كدليل على المفهوم ، تم إنشاء الخلايا التائية NIS + BCMA-CAR عبر النقل المزدوج. لقد أبلغنا مؤخرا أن دمج NIS في الخلايا التائية CAR لا يضعف وظائف الخلايا التائية CAR وفعالي...

العلاج بالخلايا بمستقبلات المستضدات الكيميرية T (CAR T) هو نهج سريع الظهور ويحتمل أن يكون علاجيا في الأورام الخبيثة الدموية1،2،3،4،5،6. تم الإبلاغ عن نتائج سريرية غير عادية بعد العلاج بالخلايا التائية CAR T (CART19) الموجه بواسطة CD19 أو مستضد نضج الخلايا البائية (BCMA) 2. أدى ذلك إلى موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) على خلايا CART19 لسرطان الغدد الليمفاوية العدواني للخلايا البائية (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4 ، tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 ، و lisocabtagene maraleucel)7 ، وسرطان الدم الليمفاوي الحاد (Tisa-Cel) 5,8 ، وسرطان الغدد الليمفاوية لخلايا الوشاح (brexucabtagene autoleuce)9 ، وسرطان الغدد الليمفاوية الجريبي (Axi-Cel)10 . في الآونة الأخيرة ، وافقت إدارة الأغذية والعقاقير على العلاج بالخلايا التائية CAR الموجهة من BCMA في المرضى الذين يعانون من الورم النقوي المتعدد (MM) (idecabtagene vicleucel)11. علاوة على ذلك ، فإن العلاج بالخلايا التائية CAR لسرطان الدم اللمفاوي المزمن (CLL) في مرحلة متأخرة من التطور السريري ومن المتوقع أن يحصل على موافقة إدارة الأغذية والعقاقير في غضون السنوات الثلاث المقبلة1.
على الرغم من النتائج غير المسبوقة للعلاج بالخلايا التائية CAR ، فإن استخدامه على نطاق واسع محدود بنسبة 1) عدم كفاية توسع الخلايا التائية CAR في الجسم الحي أو سوء الاتجار إلى مواقع الورم ، مما يؤدي إلى انخفاض معدلات الاستجابة الدائمة12،13 و 2) تطور الأحداث الضائرة التي تهدد الحياة ، بما في ذلك متلازمة إطلاق السيتوكين (CRS)14،15 . السمات المميزة ل CRS لا تشمل فقط تنشيط المناعة مما يؤدي إلى مستويات مرتفعة من السيتوكينات الالتهابية / chemokines ولكن أيضا انتشار الخلايا التائية الضخمة بعد ضخ الخلايا التائية CAR 15,16. وبالتالي ، فإن تطوير استراتيجية معتمدة من الدرجة السريرية لتصوير الخلايا التائية CAR في الجسم الحي سيسمح ل 1) تتبع الخلايا التائية CAR في الوقت الفعلي في الجسم الحي بمراقبة الاتجار بها إلى مواقع الأورام والكشف عن الآليات المحتملة للمقاومة ، و 2) مراقبة توسع الخلايا التائية CAR وربما التنبؤ بسميتها مثل تطور CRS.
السمات السريرية ل CRS الخفيفة هي ارتفاع درجة الحرارة والتعب والصداع والطفح الجلدي والإسهال وألم المفاصل والألم العضلي والشعور بالضيق. في CRS الأكثر شدة ، قد يصاب المرضى بعدم انتظام دقات القلب / انخفاض ضغط الدم ، وتسرب الشعيرات الدموية ، وضعف القلب ، والفشل الكلوي / الكبدي ، والتخثر المنتشر داخل الأوعية الدموية 17،18. بشكل عام ، ثبت أن درجة ارتفاع السيتوكينات ، بما في ذلك الإنترفيرون غاما ، وعامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم ، والإنترلوكين (IL)-10 ، و IL-6 ، ترتبط بشدة الأعراض السريرية17،19. ومع ذلك ، فإن التطبيق المكثف لمراقبة السيتوكين في المصل "في الوقت الفعلي" للتنبؤ ب CRS أمر صعب بسبب التكلفة العالية والتوافر المحدود. لاستغلال الخصائص المفيدة للعلاج بالخلايا التائية CAR ، يمكن استخدام التصوير غير الغازي للخلايا التائية بالتبني للتنبؤ بالفعالية والسمية والانتكاس بعد ضخ الخلايا التائية CAR.
طور العديد من الباحثين استراتيجيات لاستخدام التصوير القائم على النويدات المشعة مع التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) أو التصوير المقطعي المحوسب بانبعاثات فوتون واحد (SPECT) ، والذي يوفر دقة عالية وحساسية عالية20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ل في الجسم الحي تصور ورصد الاتجار بالخلايا التائية CAR. ومن بين استراتيجيات التصوير القائمة على النويدات المشعة، تم تطوير سيمبورتر يوديد الصوديوم (NIS) كطريقة حساسة لتصوير الخلايا والفيروسات باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني 31,32. يعد تصوير الخلايا التائية NIS+CAR باستخدام [18F]TFB-PET تقنية حساسة وفعالة ومريحة لتقييم وتشخيص توسع الخلايا التائية CAR والاتجار بها وسميتها30. يصف هذا البروتوكول 1) تطوير الخلايا التائية NIS + CAR من خلال النقل المزدوج بفعالية عالية و 2) منهجية لتصوير الخلايا التائية NIS + CAR مع [18F] TFB-PET يتم استخدام الخلايا التائية BCMA-CAR ل MM كنموذج إثبات للمفهوم لوصف NIS كمراسل لتصوير الخلايا التائية CAR. ومع ذلك ، يمكن تطبيق هذه المنهجيات على أي علاج آخر بالخلايا التائية CAR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>22 Gauge needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881250206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 gauge insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human (ETNL) NIS</td>
			<td>Imanis</td>
			<td>REA009</td>
			<td>ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>357507</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45, clone HI30, BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304032</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103116</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>F0110</td>
			<td>Secondary antibody for NIS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCMA-CAR construct, second generation</td>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-0037-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX System&#160; B5-R3-V5</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C04652</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Syringes with Luer-Lok Tips</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A13346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human T Cell Isolation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17951</td>
			<td>negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inveon Multiple Modality PET/CT scanner</td>
			<td>Siemens Medical Solutions USA, Inc.</td>
			<td>10506989 VFT 000 03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane liquid</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>66794-017-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina S5 Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS148588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>&#160;124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>450-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>450-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid&#160;Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>05557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM-2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>CRL-3273</td>
			<td>multiple myeloma cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>80389</td>
			<td>lentiviral vector encoding luciferase-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMOD software</td>
			<td>PMOD</td>
			<td>PBAS and P3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human AB Serum Plasma Derived</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IPLA-SERAB-H-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals, Inc.</td>
			<td>0210055210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep-S</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>21000</td>
			<td>Fully Automated Cell Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SepMate-50 (IVD)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85450</td>
			<td>density gradient separation tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrell (isoflurane, USP)</td>
			<td>Piramal Critical Care Inc</td>
			<td>66794-019-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Webcol Alcohol Prep</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic imaging of chimeric antigen receptor t cells with [18f]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography

أظهرت الخلايا التائية المهندسة وراثيا للتعبير عن مستقبلات المستضدات الخيمرية (CAR) نتائج غير مسبوقة في التجارب السريرية المحورية للمرضى الذين يعانون من أورام الخلايا البائية الخبيثة أو الورم النقوي المتعدد (MM). ومع ذلك ، فإن العديد من العقبات تحد من فعالية وتحظر الاستخدام الواسع النطاق لعلاجات الخلايا التائية CAR بسبب سوء الاتجار والتسلل إلى مواقع الأورام وكذلك عدم الثبات في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، فإن السمية التي تهدد الحياة، مثل متلازمة إطلاق السيتوكين أو السمية العصبية، هي الشواغل الرئيسية. يتيح التصوير الفعال والحساس وتتبع الخلايا التائية CAR تقييم الاتجار بالخلايا التائية وتوسيعها وتوصيف الجسم الحي ويسمح بتطوير استراتيجيات للتغلب على القيود الحالية للعلاج بالخلايا التائية CAR. تصف هذه الورقة منهجية دمج سيمبورتر يوديد الصوديوم (NIS) في الخلايا التائية CAR والتصوير بالخلايا التائية CAR باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار [18F] رباعي فلوروبورات البوزيترون ([18F]TFB-PET) في النماذج قبل السريرية. يمكن تطبيق الطرق الموضحة في هذا البروتوكول على تركيبات CAR الأخرى والجينات المستهدفة بالإضافة إلى تلك المستخدمة في هذه الدراسة.

يمثل الشكل 1 خطوات توليد الخلايا التائية NIS+BCMA-CAR. في اليوم 0 ، اعزل PBMCs ثم اعزل الخلايا التائية عن طريق الاختيار السلبي. ثم ، قم بتحفيز الخلايا التائية باستخدام حبات مضادة ل CD3 / CD28. في اليوم 1 ، قم بتحويل الخلايا التائية مع كل من NIS و BCMA-CAR lentiviruses. في الأيام 3 و 4 و 5 ، عد الخلاي...

Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography at JoVE.com

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

يصف هذا البروتوكول منهجية تتبع الخلايا التائية غير الغازية المهندسة وراثيا للتعبير عن مستقبلات المستضدات الخيمرية في الجسم الحي باستخدام منصة متاحة سريريا.

التصوير الديناميكي للخلايا التائية لمستقبلات المستضدات الكيميرية مع [18F] التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني رباعي فلوروبورات / التصوير المقطعي المحوسب

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

لا توجد منصة لتصوير مستقبلات المستضدات الخيمرية تم التحقق منها سريريا حتى الآن. يمثل سيمبورتر يوديد الصوديوم مراسلا حساسا وذا صلة سريريا لتصوير خلايا السيارة التائية بواسطة فحص التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني TLP يسمح للخلايا التائية NIS CAR للمحققين بتتبع الخلايا المشبعة في الجسم الحي بشكل غير جراحي ولديه القدرة على التنبؤ بفعالية وسمية العلاج بالخلايا التائية CAR.يتيح التصوير الفعال للخلايا التائية CAR تقييم الاتجار بالخلايا التائية وتوسيعها ويسمح بتطوير استراتيجيات للتغلب على القيود. الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول بسيطة ويمكن تطبيقها على تركيبات CAR الأخرى بخلاف تلك الموضحة في هذه الدراسة. ابدأ بعزل خلايا الدم الطرفية أحادية النواة أو PBMCs عن عينة الدم باستخدام تقنية تدرج الكثافة القياسية.للقيام بذلك ، أضف بلطف 15 ملليلتر من وسط تدرج الكثافة إلى أنبوب فصل تدرج الكثافة 50 ملليلتر لتجنب تكوين الفقاعة. لتجنب حبس الخلايا ، قم بتخفيف عينة الدم باستخدام PBS التي تحتوي على 2٪ FBS بنسبة حجم واحد إلى واحد ونقل الدم المخفف بلطف فوق وسط تدرج الكثافة دون كسر الواجهة بين الاثنين. ثم الطرد المركزي لأنبوب الفصل في 1،200 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.اجمع السوبرناتانت في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر ، واغسل الخلايا باستخدام PBS الذي يحتوي على 2٪ FBS عن طريق ملء الأنبوب حتى علامة 50 ملليلتر ، والطرد المركزي للأنبوب عند 300 مرة G لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة. شفط supernatant قبل تعليق الخلايا الكروية في 50 ملليلتر من PBS تحتوي على 2٪ FBS. أعد تعليق PBMCs الحبيبية في PBS التي تحتوي على 2٪ FBS إلى تركيز 50 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر.كرر الغسيل في أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر. احسب عدد الخلايا ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 مرة G لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة. لعزل الخلايا التائية، انقل PBMCs المعزولة إلى أنبوب سفلي دائري من البوليسترين سعة 14 ملليلتر.ثم استخدم مجموعة خرزة مغناطيسية ذات اختيار سلبي لإجراء عزل الخلايا التائية عن طريق وضع PBMCs في كوكتيل الأجسام المضادة ذات الاختيار السلبي في فاصل خلايا مؤتمت بالكامل. بعد عزل الخلايا التائية ، عد الخلايا وزرع الخلايا في وسط توسع الخلايا التائية أو TCM بتركيز اثنين من 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر. بعد ذلك ، امزج القارورة التي تحتوي على الخرز المضاد ل CD3 / CD28 عن طريق الدوران وماصة الحجم المطلوب من الخرز في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم 1.5 ملليلتر.للغسيل ، أعد تعليق الخرز في ملليلتر واحد من TCM قبل وضع أنبوب على مغناطيس لمدة دقيقة واحدة وشفط supernatant. بعد إزالة الأنبوب من المغناطيس ، أعد تعليق الخرز المغسول في ملليلتر واحد من TCM وكرر الغسيل مرتين. أعد تعليق الخرز المغسول في ملليلتر واحد من TCM لنقلها إلى مزرعة الخلايا التائية ، ثم قم بتخفيف تعليق حبة الخلايا التائية باستخدام TCM إلى تركيز 1.0 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر قبل نقلها إلى مزرعة أنسجة معالجة بستة أطباق.احتضان صفيحة البئر عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. للتقدم في نقل فيروسات lentivirus ، قم بإذابة فيروسات lentivirus المجمدة في طلاء مستقبلات مستضدات خيمرية أو سيمبورتر يوديد الصوديوم عند أربع درجات مئوية. بعد 24 إلى 48 ساعة من تحفيز الخلايا التائية ، امزج الخلايا التائية لتفتيت المجموعات وإضافة الفيروس اللئيم حديثا إلى الخلايا عند تعدد العدوى من خمسة.احتضان الخلايا التائية المحولة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. في الأيام الثالث والرابع والخامس من الحضانة ، قم بحساب الخلايا التائية المحولة وضبط تركيز الخلية إلى 1.0 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر عن طريق إضافة TCM طازج تم تسخينه مسبقا. بالنسبة للخلايا التائية المحولة من NIS التي تحمل جين مقاومة البيروميسين ، عالج الخلايا بميكروغرام واحد لكل ملليلتر من ثنائي هيدروكلوريد البيروميسين في الأيام الثالث والرابع والخامس.في اليوم السادس ، قم بتفكيك مجموعات الخلايا التائية وإزالة الخرز المضاد ل CD3 / CD28 من الخلايا التائية المحولة عن طريق وضع اللوحة على مغناطيس لمدة دقيقة واحدة. ثم ضع الخلايا التي تم جمعها مرة أخرى في المزرعة بتركيز 1.0 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر. اغسل أليكوت من مزرعة الخلايا التائية التي تحتوي على 50،000 خلية مع مخزن مؤقت للتدفق وأعد تعليق الخلايا مع 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق.للكشف عن تعبير CAR ، قم بتلطيخ الخلايا التائية بميكرولتر واحد من الأجسام المضادة المضادة للماعز المضادة للفئران. لاستبعاد الخلايا الميتة ، أضف 0.3 ميكرولتر من LIVE / DEAD Aqua. احتضان الخلايا الملطخة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.بعد 15 دقيقة ، اغسل الخلايا ب 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق عند 650 مرة G لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية. لإصلاح الخلايا الملطخة واختراقها ، احتضن الخلايا ب 100 ميكرولتر من وسط التثبيت لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل الخلايا مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من مخزن مؤقت يحتوي على عامل نفاذ للخلايا مثل الصابونين وأجهزة الطرد المركزي.بعد الغسيل ، أعد تعليق الخلايا المتخلل في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت المتغلغل. ثم أضف 0.3 نانوغرام من الأجسام المضادة المضادة ل ETNL NIS المضادة للإنسان واحتضنها عند أربع درجات مئوية. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، اغسل الخلايا بإضافة 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح.ثم احتضن الخلايا ب 50 ميكرولتر من مخزن التدفق العازل الذي يحتوي على 2.5 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد غسل الخلايا التائية كما هو موضح ، أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق لإجراء قياس التدفق الخلوي. ثم تحديد كفاءة نقل الخلايا.في اليوم الثامن ، عد الخلايا التائية وقم بتدويرها بسرعة 300 مرة G لمدة ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية قبل إعادة تعليق حبيبات الخلية بوسط تجميد بتركيز 10 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر. انقل ملليلتر واحد من تعليق الخلية إلى كل قارورة تبريد ملصقة لتخزينها في ثلاجة 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 48 ساعة. بعد 48 ساعة ، انقل الخلايا التائية إلى النيتروجين السائل.قم بإعداد الفئران التي تم حقنها بالخلايا التائية BCMA CAR الإيجابية من NIS للتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير المقطعي المحوسب عن طريق وزن الفئران وإزالة علامات الأذن المعدنية. ثم حقن 9.25 ميغابيكريل من رباعي فلوروبورات F18 الطازج في الفأر عن طريق الوريد عن طريق حقن الوريد الذيل. بعد 45 دقيقة من فترة الامتصاص ، تابع للحصول على صور PET ثابتة لفأر مخدر لمدة 15 دقيقة ، تليها الحصول على صورة CT لمدة خمس دقائق مع دوران 360 درجة و 180 إسقاطا.في هذا التحليل التمثيلي، أدى النقل المشترك لفيروسين إلى خلايا T إلى توليد خلايا BCMA CAR T إيجابية ل NIS حيث كان أكثر من 90٪ من الخلايا إيجابية NIS. كشف تحليل حركية نمو الخلايا التائية من صفر إلى ثمانية أيام أن دمج BCMA CAR و NIS لم يؤثر بشكل كبير على توسع الخلايا التائية عند مقارنته بالخلايا غير المحولة. في تحليل التدفق الخلوي ل OPM-2 ، مثلت الخلايا المحولة بفيروس lentivirus تعبير GFP عند العلاج بالبوروميسين.تعرضت الفئران التي تتلقى خلايا OPM-2 إيجابية BCMA لوسيفيراز إيجابية لتصوير التلألؤ الحيوي لتأكيد تطعيم خلايا OPM-2. كشف التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني للفأر الذي يديره رباعي فلوروبورات F18 عن توزيع الخلايا التائية BCMA CAR الإيجابي ل NIS في مختلف الأعضاء ونخاع العظام. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت خلايا نخاع العظم التي تم حصادها من الفأر تطعيم خلايا OPM-2 وتوصيل الخلايا التائية BCMA CAR الإيجابية NIS إلى نخاع العظام.للحصول على تصوير عالي الجودة للخلايا التائية CAR المغروسة ، من المهم اتباع خطوات بروتوكول توليد الخلايا التائية NIS CAR وتأكيد وجود كسور إيجابية مزدوجة NIS و CAR.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

تصوير لايف لدراسة أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي في سرطان الثدي المقاومة للالتاكسين

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

استخدام التصوير PET/CT فدج و 18والأنسجة الكمية لقياس التغيرات الدينامية في استقلاب الجلوكوز في نماذج الماوس من سرطان الرئة

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

الأسفار التصوير المقطعي الجزيئية للتصوير في فيفو لتكثيفها جليوبلاستوما

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

التصوير التصوير المقطعي المتعدد الوسائط طرحه والانبعاثات Positronic التصوير المقطعي/الحسابية للورم النخاعي المتعدد تكثيفها نخاع العظام في الفئران وتد

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

في ريتشالينجي خلية الورم المختبر للتقييم التنبؤي من مستضد تشيميريك مستقبلات خلية تي انتيتومور الدالة

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

تصنيع مستقبلات مستضد تشياريك (CAR) خلايا T للعلاج المناعي بالتبني

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث لتوليد خلايا T الأورام مستضد محدده

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

إدارة التحف الحركة التنفسية في 18F-fluorodeoxyglucose Positron الانبعاثات التصوير المقطعي باستخدام خوارزمية الغاءات التنفسية الأمثل القائم على السعة

Positron emission tomography (PET) combined with X-ray computed tomography (CT) is an important molecular imaging platform that is required for accurate ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

التحليل المرضي لنقائل الرئة بعد الحقن الجانبي الوريد الذيل من الخلايا السرطانية

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Positron Emission Tomography-based Dose Painting Radiation Therapy in a Glioblastoma Rat Model using the Small Animal Radiation Research Platform

العلاج الإشعاعي القائم على التصوير الإشعاعي بجرعة التصوير المقطعي القائم على البوزيترون في نموذج الفئران الورم الأرومي الدبقي باستخدام منصة أبحاث الإشعاع الحيواني الصغير

A rat glioblastoma model to mimic chemo-radiation treatment of human glioblastoma in the clinic was previously established. Similar to the clinical ...