Name: dynamic imaging of chimeric antigen receptor t cells with [18f]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography
Uploaded: 2022-02-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography at JoVE.com

Diese Arbeit wurde teilweise durch die Mayo Clinic K2R-Pipeline (SSK), das Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) und die Predolin Foundation (RS) unterstützt. Die Abbildungen 1, 2 und 4 wurden mit BioRender.com erstellt.

Das Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Review Board der Imsengco Clinic, des Institutional Biosafety Committee und des Institutional Animal Care and Use Committee der Imsengco Clinic.
1. NIS+ BCMA-CAR T-Zell-Produktion
HINWEIS: Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Review Board (IRB 17-008762) und des Institutional Biosafety Committee (IBC Bios00000006.04) der Mayo Clinic.
<ol><li>Produktion von BCMA-CAR, NIS und Lucife...

Dieses Papier beschreibt eine Methodik für die Integration von NIS in CAR-T-Zellen und die Bildgebung von infundierten CAR-T-Zellen in vivo durch [18F]TFB-PET. Als Proof of Concept wurden NIS+BCMA-CAR T-Zellen mittels dualer Transduktion erzeugt. Wir haben kürzlich berichtet, dass die Integration von NIS in CAR-T-Zellen die Funktionen und die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen in vivo nicht beeinträchtigt und den Transport und die Expansion von CAR-T-Zellen ermöglic...

Die Chimeric Antigen Receptor T (CAR T) Zelltherapie ist ein sich schnell entwickelnder und potenziell heilender Ansatz bei hämatologischen Malignomen1,2,3,4,5,6. Außergewöhnliche klinische Ergebnisse wurden nach CD19-gerichteter CAR T (CART19) oder B-Zellreifungsantigen (BCMA) CAR T-Zelltherapie2 berichtet. Dies führte zur Zulassung von CART19-Zellen für aggressive B-Zell-Lymphome (Axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, Tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 und Lisocabtagene maraleucel)7, akute lymphatische Leukämie (Tisa-Cel)5,8, Mantelzelllymphom (brexucabtagene autoleuce)9 und follikuläres Lymphom (Axi-Cel)10 . Zuletzt genehmigte die FDA die BCMA-gerichtete CAR-T-Zelltherapie bei Patienten mit multiplem Myelom (MM) (Idecabtagen-Vikleucel)11. Darüber hinaus befindet sich die CAR-T-Zelltherapie bei chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) in der späten klinischen Entwicklung und wird voraussichtlich innerhalb der nächsten drei Jahre die FDA-Zulassung erhalten1.
Trotz der beispiellosen Ergebnisse der CAR-T-Zelltherapie ist ihre weit verbreitete Anwendung begrenzt durch 1) unzureichende In-vivo-CAR-T-Zellexpansion oder schlechten Transport zu Tumorstellen, was zu niedrigeren Raten dauerhafter Reaktion führt12,13 und 2) die Entwicklung lebensbedrohlicher unerwünschter Ereignisse, einschließlich des Zytokinfreisetzungssyndroms (CRS)14,15 . Zu den Kennzeichen von CRS gehören nicht nur die Immunaktivierung, die zu erhöhten Spiegeln von entzündlichen Zytokinen / Chemokinen führt, sondern auch eine massive T-Zell-Proliferation nach CAR-T-Zell-Infusion15,16. Daher würde die Entwicklung einer validierten, klinischen Strategie zur Abbildung von CAR-T-Zellen in vivo 1) CAR-T-Zell-Tracking in Echtzeit in vivo ermöglichen , um ihren Transport zu Tumorstellen zu überwachen und potenzielle Resistenzmechanismen aufzudecken, und 2) die Überwachung der CAR-T-Zellexpansion und möglicherweise die Vorhersage ihrer Toxizitäten wie die Entwicklung von CRS.
Klinische Merkmale von leichtem CRS sind hohes Fieber, Müdigkeit, Kopfschmerzen, Hautausschlag, Durchfall, Arthralgie, Myalgie und Unwohlsein. Bei schwererem CRS können Patienten Tachykardie/Hypotonie, Kapillarleck, Herzfunktionsstörungen, Nieren- / Leberversagen und eine disseminierte intravaskuläre Koagulation entwickeln17,18. Im Allgemeinen wurde gezeigt, dass der Grad der Erhöhung von Zytokinen, einschließlich Interferon-gamma, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor, Interleukin (IL)-10 und IL-6, mit der Schwere der klinischen Symptome korreliert17,19. Die umfangreiche Anwendung der "Echtzeit" -Serumzytokinüberwachung zur Vorhersage von CRS ist jedoch aufgrund der hohen Kosten und der begrenzten Verfügbarkeit schwierig. Um die vorteilhaften Eigenschaften der CAR-T-Zelltherapie zu nutzen, kann die nicht-invasive Bildgebung von adoptiven T-Zellen potenziell verwendet werden, um die Wirksamkeit, Toxizität und den Rückfall nach der CAR-T-Zellinfusion vorherzusagen.
Mehrere Forscher haben Strategien entwickelt, um radionuklidbasierte Bildgebung mit Positronen-Emissions-Tomographie (PET) oder Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) zu verwenden, die eine hohe Auflösung und hohe Empfindlichkeit bietet20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 für die In-vivo-Visualisierung und Monitoring des CAR-T-Zell-Handels. Unter diesen Radionuklid-basierten Bildgebungsstrategien wurde der Natriumiodid-Symporter (NIS) als empfindliche Modalität zur Abbildung von Zellen und Viren mithilfe von PET-Scans entwickelt31,32. Die NIS+CAR-T-Zellbildgebung mit [18F]TFB-PET ist eine empfindliche, effiziente und praktische Technologie zur Beurteilung und Diagnose der Ausdehnung, des Handels und der Toxizität von CAR-T-Zellen30. Dieses Protokoll beschreibt 1) die Entwicklung von NIS+CAR T-Zellen durch duale Transduktion mit hoher Wirksamkeit und 2) eine Methodik zur Bildgebung von NIS+CAR T-Zellen mit [18F]TFB-PET-Scan. BCMA-CAR-T-Zellen für MM werden als Proof-of-Concept-Modell verwendet, um NIS als Reporter für CAR-T-Zell-Imaging zu beschreiben. Diese Methoden können jedoch auf jede andere CAR-T-Zelltherapie angewendet werden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>22 Gauge needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881250206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 gauge insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human (ETNL) NIS</td>
			<td>Imanis</td>
			<td>REA009</td>
			<td>ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>357507</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45, clone HI30, BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304032</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103116</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>F0110</td>
			<td>Secondary antibody for NIS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCMA-CAR construct, second generation</td>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-0037-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX System&#160; B5-R3-V5</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C04652</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Syringes with Luer-Lok Tips</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A13346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human T Cell Isolation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17951</td>
			<td>negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inveon Multiple Modality PET/CT scanner</td>
			<td>Siemens Medical Solutions USA, Inc.</td>
			<td>10506989 VFT 000 03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane liquid</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>66794-017-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina S5 Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS148588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>&#160;124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>450-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>450-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid&#160;Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>05557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM-2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>CRL-3273</td>
			<td>multiple myeloma cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>80389</td>
			<td>lentiviral vector encoding luciferase-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMOD software</td>
			<td>PMOD</td>
			<td>PBAS and P3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human AB Serum Plasma Derived</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IPLA-SERAB-H-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals, Inc.</td>
			<td>0210055210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep-S</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>21000</td>
			<td>Fully Automated Cell Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SepMate-50 (IVD)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85450</td>
			<td>density gradient separation tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrell (isoflurane, USP)</td>
			<td>Piramal Critical Care Inc</td>
			<td>66794-019-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Webcol Alcohol Prep</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic imaging of chimeric antigen receptor t cells with [18f]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography

T-Zellen, die gentechnisch verändert wurden, um chimäre Antigenrezeptoren (CAR) zu exprimieren, haben in zulassungsrelevanten klinischen Studien für Patienten mit B-Zell-Malignomen oder multiplem Myelom (MM) beispiellose Ergebnisse gezeigt. Zahlreiche Hindernisse schränken jedoch die Wirksamkeit ein und verbieten den weit verbreiteten Einsatz von CAR-T-Zelltherapien aufgrund des schlechten Handels und der Infiltration in Tumorstellen sowie der mangelnden Persistenz in vivo. Darüber hinaus sind lebensbedrohliche Toxizitäten wie das Zytokinfreisetzungssyndrom oder die Neurotoxizität ein großes Problem. Effiziente und empfindliche Bildgebung und Verfolgung von CAR-T-Zellen ermöglicht die Bewertung des Transports, der Expansion und der In-vivo-Charakterisierung von T-Zellen und ermöglicht die Entwicklung von Strategien zur Überwindung der derzeitigen Einschränkungen der CAR-T-Zelltherapie. Dieses Papier beschreibt die Methodik für den Einbau des Natriumiodid-Symporters (NIS) in CAR-T-Zellen und für die CAR-T-Zellbildgebung mittels [18F]tetrafluoroborat-Positronen-Emissionstomographie ([18F]TFB-PET) in präklinischen Modellen. Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden können zusätzlich zu den für diese Studie verwendeten auf andere CAR-Konstrukte und Zielgene angewendet werden.

Abbildung 1 zeigt die Schritte zum Generieren von NIS+BCMA-CAR-T-Zellen. Isolieren Sie am Tag 0 PBMCs und dann T-Zellen durch negative Selektion. Dann stimulieren Sie T-Zellen mit Anti-CD3 / CD28-Perlen. Transduzieren Sie an Tag 1 T-Zellen sowohl mit NIS- als auch mit BCMA-CAR-Lentiviren. Zählen Sie an den Tagen 3, 4 und 5 T-Zellen und füttern Sie sie mit Medien, um die Konzentration auf 1,0 × 106/ml einzustellen. Für NIS-transduzierte T-Zellen fügen Sie 1 μg/ml P...

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Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur nicht-invasiven Verfolgung von T-Zellen, die genetisch so verändert wurden, dass sie chimäre Antigenrezeptoren in vivo mit einer klinisch verfügbaren Plattform exprimieren.

Dynamische Bildgebung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen mit [18F]Tetrafluoroborat-Positronen-Emissions-Tomographie/Computertomographie

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Es gibt bisher keine klinisch validierte chimäre Antigenrezeptor-T-Zell-Bildgebungsplattform. Der Natrium-Jodid-Symporter stellt einen sensitiven und klinisch relevanten Reporter dar, um Car-T-Zellen per PET-Scan abzubilden. TLP-PET-Bildgebung von NIS-CAR-T-Zellen ermöglicht es Forschern, infundierte Zellen in vivo nicht-invasiv zu verfolgen und hat das Potenzial, die Wirksamkeit und Toxizität der CAR-T-Zell-Therapie vorherzusagen.Die effiziente Bildgebung von CAR-T-Zellen ermöglicht die Bewertung von T-Zell-Transport und -Expansion und ermöglicht die Entwicklung von Strategien zur Überwindung der Einschränkungen. Die in diesem Protokoll beschriebene Methode ist einfach und kann auf andere CAR-Konstrukte angewendet werden, die über die in dieser Studie gezeigten hinausgehen. Beginnen Sie mit der Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen oder PBMCs aus der Blutprobe unter Verwendung der Standard-Dichtegradiententechnik.Dazu fügen Sie vorsichtig 15 Milliliter Dichtegradientenmedium zu einem 50-Milliliter-Dichtegradiententrennrohr hinzu, um Blasenbildung zu vermeiden. Um Zellfallen zu vermeiden, verdünnen Sie die Blutprobe mit PBS, das 2% FBS enthält, bei einem Volumenverhältnis von eins zu eins und übertragen Sie das verdünnte Blut vorsichtig auf das Dichtegradientenmedium, ohne die Grenzfläche zwischen den beiden zu unterbrechen. Dann zentrifugieren Sie das Trennröhrchen bei 1.200 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Sammeln Sie den Überstand in einem frischen 50-Milliliter-konischen Röhrchen, waschen Sie die Zellen mit PBS, das 2% FBS enthält, indem Sie das Röhrchen bis zu 50-Milliliter-Marke füllen und das Röhrchen bei Raumtemperatur acht Minuten lang mit 300 x G zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand ab, bevor Sie die pelletierten Zellen in 50 Milliliter PBS mit 2% FBS resuspendieren. Resuspendieren Sie die pelletierten PBMCs in PBS, die 2% FBS enthalten, auf eine Konzentration von 50 mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter.Wiederholen Sie die Wäsche in einem frischen 50-Milliliter-Röhrchen. Zählen Sie die Anzahl der Zellen und zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension bei 300 mal G für acht Minuten bei Raumtemperatur. Zur T-Zell-Isolierung werden isolierte PBMCs auf ein 14-Milliliter-Polystyrol-Rundbodenrohr übertragen.Verwenden Sie dann ein Magnetperlen-Kit mit negativer Selektion, um eine T-Zell-Isolierung durchzuführen, indem Sie die PBMCs in einem Antikörpercocktail mit negativer Selektion in einem vollautomatischen Zellseparator platzieren. Nach der T-Zell-Isolierung die Zellen zählen und die Zellen in T-Zell-Expansionsmedium oder TCM in einer Konzentration von zwei mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter kultivieren. Als nächstes mischen Sie die Durchstechflasche mit den Anti-CD3 / CD28-Perlen durch Schwenken und pipettieren Sie das erforderliche Volumen der Perlen in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Zum Waschen die Perlen in einem Milliliter TCM aufhängen, bevor Sie eine Minute lang einen Schlauch auf einen Magneten legen und den Überstand absaugen. Nachdem Sie den Schlauch vom Magneten entfernt haben, suspendieren Sie die gewaschenen Perlen in einem Milliliter TCM und wiederholen Sie die Wäsche zweimal. Suspendieren Sie die gewaschenen Perlen in einem Milliliter TCM, um sie in die T-Zellkultur zu übertragen, verdünnen Sie dann die T-Zell-Perlensuspension mit TCM auf eine Konzentration von 1,0 mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter, bevor Sie sie auf eine mit Gewebekultur behandelte Sechs-Well-Platte übertragen.Inkubieren Sie die Bohrlochplatte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Um mit der Transduktion von Lentiviren fortzufahren, tauen Sie die gefrorenen Lentiviren in Beschichtung von chimären Antigenrezeptoren oder Natrium-Jodid-Symporter bei vier Grad Celsius auf. Nach 24 bis 48 Stunden T-Zell-Stimulation mischen Sie die T-Zellen, um die Cluster aufzubrechen, und fügen Sie das frisch aufgetaute Lentivirus den Zellen bei einer Vielzahl von Infektionen von fünf hinzu.Inkubieren Sie die transduzierten T-Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Zählen Sie an den Tagen drei, vier und fünf der Inkubation die transduzierten T-Zellen und passen Sie die Zellkonzentration auf 1,0 mal 10 bis sechste Zellen pro Milliliter an, indem Sie frisches vorgewärmtes TCM hinzufügen. Für NIS-transduzierte T-Zellen, die das Puromycin-Resistenzgen tragen, behandeln Sie die Zellen an den Tagen drei, vier und fünf mit einem Mikrogramm pro Milliliter Puromycindihydrochlorid.Brechen Sie am sechsten Tag die T-Zell-Cluster auf und entfernen Sie die Anti-CD3 / CD28-Perlen von den transduzierten T-Zellen, indem Sie die Platte für eine Minute auf einen Magneten legen. Anschließend die gesammelten Zellen in einer Konzentration von 1,0 mal 10 bis sechsten Zellen pro Milliliter wieder in die Kultur geben. Waschen Sie ein Aliquot der T-Zellkultur mit 50.000 Zellen mit Flusspuffer und resuspendieren Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern Flusspuffer.Um die CAR-Expression zu erkennen, färben Sie die T-Zellen mit einem Mikroliter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper. Um die toten Zellen auszuschließen, fügen Sie 0,3 Mikroliter LIVE/DEAD Aqua hinzu. Inkubieren Sie die gefärbten Zellen im Dunkeln bei Raumtemperatur.Nach 15 Minuten die Zellen mit 150 Mikrolitern Durchflusspuffer bei 650 mal G drei Minuten bei vier Grad Celsius waschen. Um die gefärbten Zellen zu fixieren und zu permeabilisieren, inkubieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern Fixationsmedium für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Dann waschen Sie die Zellen zweimal mit 100 Mikrolitern eines Puffers, der ein Zellpermeabilisionsmittel wie Saponin und Zentrifuge enthält.Nach dem Waschen resuspendieren Sie die permeabilisierten Zellen in 50 Mikrolitern eines permeabilisierenden Puffers. Dann fügen Sie 0,3 Nanogramm antihumanen ETNL-NIS-Antikörper hinzu und inkubieren Sie bei vier Grad Celsius. Nach einer Stunde Inkubation waschen Sie die Zellen, indem Sie 150 Mikroliter Flusspuffer und Zentrifuge hinzufügen, wie gezeigt.Dann inkubieren Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern Flusspuffer, der 2,5 Mikroliter Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper enthält, für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Waschen der T-Zellen, wie gezeigt, suspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern Flusspuffer, um eine Durchflusszytometrie durchzuführen. Bestimmen Sie dann die Transduktionseffizienz der Zellen.Zählen und drehen Sie am achten Tag die T-Zellen bei 300 mal G acht Minuten lang bei vier Grad Celsius ab, bevor Sie das Zellpellet mit einem gefrierenden Medium in einer Konzentration von 10 mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter wieder auffüllen. Übertragen Sie einen Milliliter der Zellsuspension auf jede gekennzeichnete Kryo-Durchstechflasche, um sie 48 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank zu lagern. Nach 48 Stunden die T-Zellen in flüssigen Stickstoff überführen.Bereiten Sie die Mäuse, denen NIS-positive BCMA-CAR-T-Zellen injiziert wurden, für die PET/CT-Bildgebung vor, indem Sie die Mäuse wiegen und Metallohrmarken entfernen. Dann werden 9,25 Megabecquerel frisch zubereitetes F18-Tetrafluoroborat intravenös durch Schwanzveneninjektion in die Maus injiziert. Nach 45 Minuten Aufnahmezeit nehmen Sie statische PET-Bilder einer betäubten Maus für 15 Minuten auf, gefolgt von einer CT-Bildaufnahme für fünf Minuten mit 360-Grad-Drehung und 180 Projektionen.In dieser repräsentativen Analyse erzeugte die gemeinsame Transduktion von zwei Viren in T-Zellen NIS-positive BCMA-CAR-T-Zellen, wobei über 90% der Zellen NIS-positiv waren. Die Analyse der Kinetik des T-Zell-Wachstums von null auf acht Tage ergab, dass der Einbau von BCMA CAR und NIS die T-Zell-Expansion im Vergleich zu den nicht transduzierten Zellen nicht signifikant beeinflusste. In der durchflusszytometrischen Analyse von OPM-2 stellten Zellen, die mit Lentivirus transduziert wurden, die GFP-Expression bei der Behandlung mit Puromycin dar.Die Mäuse, die BCMA-positive Luciferase-positive OPM-2-Zellen erhielten, wurden einer Biolumineszenzbildgebung unterzogen, um die Transplantation von OPM-2-Zellen zu bestätigen. Die PET-Bildgebung der F18-Tetrafluoroborat-verabreichten Maus zeigte eine NIS-positive BCMA-CAR-T-Zell-Verteilung in den verschiedenen Organen und im Knochenmark. Zusätzlich zeigten die von der Maus entnommenen Knochenmarkzellen die Transplantation von OPM-2-Zellen und die Abgabe der NIS-positiven BCMA-CAR-T-Zellen an das Knochenmark.Für eine qualitativ hochwertige Bildgebung von infundierten CAR-T-Zellen ist es wichtig, die Schritte des NIS-CAR-T-Zell-Generierungsprotokolls zu befolgen und das Vorhandensein von dualen NIS- und CAR-positiven Fraktionen zu bestätigen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Live-Imaging zur Untersuchung Mikrotubuli dynamische Instabilität in Taxan-resistenten Mammakarzinome

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Forschung

Krebsforschung

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Nutzung von 18F-FDG-PET/CT-Bildgebung und quantitativer Histologie, dynamische Veränderungen in der Glukose-Stoffwechsel in Mausmodellen von Lungenkrebs zu messen

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für die In-Vivo Bildgebung des Glioblastoms Xenotransplantate

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Multimodale Biolumineszenz und Positronic-Emissions-Tomographie/Computational Tomographie Bildgebung des multiplen Myeloms Knochenmark Xenotransplantate NOG Mäuse

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor Zelle Rechallenge für vorausschauende Bewertung der Chimeric Antigen-Rezeptor-T-Zell-Antitumor-Funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Herstellung von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen T-Zellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

Management von Atembewegungsartefakten in 18F-Fluorodeoxyglucose Positronen-Emissionstomographie mit einem Amplituden-basierten optimalen Respiratory Gating-Algorithmus

Positron emission tomography (PET) combined with X-ray computed tomography (CT) is an important molecular imaging platform that is required for accurate ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Positron Emission Tomography-based Dose Painting Radiation Therapy in a Glioblastoma Rat Model using the Small Animal Radiation Research Platform

Positronen-Emissions-Tomographie-basierte Dosismalerei-Strahlentherapie in einem Glioblastom-Rattenmodell unter Verwendung der Small Animal Radiation Research Platform

A rat glioblastoma model to mimic chemo-radiation treatment of human glioblastoma in the clinic was previously established. Similar to the clinical ...