Name: dynamic imaging of chimeric antigen receptor t cells with [18f]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography
Uploaded: 2022-02-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקה באמצעות צינור K2R של מאיו קליניק (SSK), מרכז מרפאת מאיו לרפואה אישית (SSK) וקרן פרדילין (RS). איורים 1, 2 ו- 4 נוצרו עם BioRender.com.

הפרוטוקול פועל בהתאם להנחיות של ועדת הביקורת המוסדית של מאיו קליניק, הוועדה המוסדית לאבטחה ביולוגית והוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של מאיו קליניק.
1. ש"ח+ ייצור תאי BCMA-CAR T
הערה: פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות של ועדת הביקורת המוסדית של מרפאת מאיו (IRB 17-008...

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לשילוב ש"ח בתאי CAR T והדמיה חדורה לתאי CAR T ב-vivo באמצעות [18F]TFB-PET. כהוכחת קונספט, תאי NIS+BCMA-CAR T נוצרו באמצעות טרנסדוקציה כפולה. לאחרונה דיווחנו כי שילוב ש"ח בתאי CAR T אינו פוגע בתפקודי תאי CAR T וביעילותו ב-vivo ומאפשר סחר והרחבה של תאי CAR T30. כמו...

טיפול תאי קולטן אנטיגן כימרי T (CAR T) הוא גישה מתפתחת במהירות ופוטנציאלית מרפאת ממאירות המטולוגית1,2,2,3,4,5,6. תוצאות קליניות יוצאות דופן דווחו לאחר CD19 מכוון CAR T (CART19) או B התבגרות תאים אנטיגן (BCMA) CAR T טיפול בתאים2. זה הוביל לאישור מינהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) של תאי CART19 ללימפומה אגרסיבית של תאי B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3, ו lisocabtagene maraleucel)7, לוקמיה לימפובלסטית חריפה (Tisa-Cel)5,8, לימפומה תאי מעטפת (brexucabtagene autoleuce)9, ולימפומה זקיקית (Axi-Cel)10 . לאחרונה, ה-FDA אישר טיפול בתאי CAR T בהכוונת BCMA בחולים עם מיאלומה נפוצה (MM) (idecabtagene vicleucel)11. יתר על כן, טיפול בתאי CAR T עבור לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) נמצא בפיתוח קליני בשלב מאוחר וצפוי לקבל את אישור ה-FDA בשלוש השנים הקרובות1.
למרות התוצאות חסרות התקדים של טיפול בתאי CAR T, השימוש הנרחב בו מוגבל על ידי 1) לא מספיק בהרחבת תאי vivo CAR T או סחר לקוי לאתרי גידולים, מה שמוביל לשיעורים נמוכים יותר של תגובה עמידה12,13 ו -2) התפתחות של תופעות לוואי מסכנות חיים, כולל תסמונת שחרור ציטוקינים (CRS)14,15 . סימני ההיכר של CRS כוללים לא רק הפעלה חיסונית וכתוצאה מכך רמות גבוהות של ציטוקינים דלקתיים / כימותרפים, אלא גם התפשטות מסיבית של תאי T לאחר עירוי תאי CAR T15,16. לפיכך, פיתוח אסטרטגיה מאומתת ברמה קלינית לתמונה תאי CAR T ב vivo יאפשר 1) מעקב תאי CAR T בזמן אמת ב vivo כדי לפקח על הסחר שלהם לאתרי גידול ולחשוף מנגנונים פוטנציאליים של התנגדות, ו 2) ניטור של התרחבות תאי CAR T ופוטנציאל לחזות את הרעילות שלהם כגון התפתחות CRS.
תכונות קליניות של CRS מתון הן חום גבוה, עייפות, כאב ראש, פריחה, שלשולים, כאבי מפרקים, כאבי שרירים, וחולשה. ב CRS חמור יותר, חולים עלולים לפתח טכיקרדיה/תת לחץ דם, דליפת נימי, תפקוד לקוי של הלב, אי ספיקת כליות/כבד, קרישה תוך וסקולרית מופצת17,18. באופן כללי, מידת הגובה של ציטוקינים, כולל אינטרפרון-גמא, גרנולוציט-מקרופאג' גורם מגרה מושבה, אינטרלוקין (IL)-10, ו IL-6, הוכח בקורלציה עם חומרת הסימפטומים הקליניים17,19. עם זאת, היישום הנרחב של ניטור ציטוקינים בסרום "בזמן אמת" כדי לחזות CRS קשה בשל העלות הגבוהה והזמינות המוגבלת. כדי לנצל את המאפיינים המיטיבים של טיפול בתאי CAR T, הדמיה לא פולשנית של תאי T מאמצים יכולה להיות מנוצלת באופן פוטנציאלי כדי לחזות את היעילות, הרעילות וההישנות לאחר עירוי תא CAR T.
מספר חוקרים פיתחו אסטרטגיות לשימוש בהדמיה מבוססת רדיונוקלידים עם טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) או טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון יחיד (SPECT), המספקת רזולוציה גבוהה ורגישות גבוהה20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 עבור in vivo הדמיה וניטור של סחר בתאי CAR T. בין אסטרטגיות הדמיה מבוססות רדיונוקלידים אלה, סימפורטר הנתרן יוד (NIS) פותח כמודל רגיש לתאי תמונה ווירוסים באמצעות סריקות PET31,32. הדמיית תאים NIS+CAR T עם [18F]TFB-PET היא טכנולוגיה רגישה, יעילה ונוחה להערכה ואבחון של הרחבת תאי CAR T, סחר ורעילות30. פרוטוקול זה מתאר 1) פיתוח של תאי NIS+CAR T באמצעות העברה כפולה עם יעילות גבוהה ו-2) מתודולוגיה להדמיית תאי NIS+CAR T עם [18F]TFB-PET סריקה. תאי BCMA-CAR T עבור MM משמשים כמודל הוכחת קונספט לתיאור NIS ככתב להדמיית תאי CAR T. עם זאת, מתודולוגיות אלה ניתן ליישם על כל טיפול בתאי CAR T אחר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>22 Gauge needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881250206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 gauge insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human (ETNL) NIS</td>
			<td>Imanis</td>
			<td>REA009</td>
			<td>ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>357507</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45, clone HI30, BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304032</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103116</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>F0110</td>
			<td>Secondary antibody for NIS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCMA-CAR construct, second generation</td>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-0037-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX System&#160; B5-R3-V5</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C04652</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Syringes with Luer-Lok Tips</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A13346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human T Cell Isolation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17951</td>
			<td>negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inveon Multiple Modality PET/CT scanner</td>
			<td>Siemens Medical Solutions USA, Inc.</td>
			<td>10506989 VFT 000 03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane liquid</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>66794-017-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina S5 Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS148588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>&#160;124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>450-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>450-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid&#160;Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>05557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM-2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>CRL-3273</td>
			<td>multiple myeloma cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>80389</td>
			<td>lentiviral vector encoding luciferase-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMOD software</td>
			<td>PMOD</td>
			<td>PBAS and P3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human AB Serum Plasma Derived</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IPLA-SERAB-H-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals, Inc.</td>
			<td>0210055210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep-S</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>21000</td>
			<td>Fully Automated Cell Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SepMate-50 (IVD)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85450</td>
			<td>density gradient separation tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrell (isoflurane, USP)</td>
			<td>Piramal Critical Care Inc</td>
			<td>66794-019-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Webcol Alcohol Prep</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic imaging of chimeric antigen receptor t cells with [18f]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography

תאי T מהונדסים גנטית לבטא קולטני אנטיגן כימריים (CAR) הראו תוצאות חסרות תקדים בניסויים קליניים מרכזיים עבור חולים עם ממאירות תאי B או מיאלומה נפוצה (MM). עם זאת, מכשולים רבים מגבילים את היעילות ואוסרים על שימוש נרחב בטיפולים בתאי CAR T עקב סחר לקוי וחדירה לאתרי גידול, כמו גם חוסר התמדה ב- vivo. יתר על כן, רעילות מסכנת חיים, כגון תסמונת שחרור ציטוקינים או רעלנות עצבית, הם חששות עיקריים. הדמיה ומעקב יעילים ורגישים של תאי CAR T מאפשרים הערכה של סחר בתאי T, הרחבה ואפיון in vivo ומאפשרים פיתוח אסטרטגיות להתגבר על המגבלות הנוכחיות של טיפול בתאי CAR T. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לשילוב סימפורטר הנתרן יודיד (ש"ח) בתאי CAR T ולהדמיית תאי CAR T באמצעות [18F]טטרפלואורובוראט-פוזיטרונים טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים ([18F]TFB-PET) במודלים פרה-קליניים. ניתן ליישם את השיטות המתוארות בפרוטוקול זה על מבני CAR אחרים ועל גנים ממוקדים בנוסף לאלה המשמשים למחקר זה.

איור 1 מייצג את השלבים של יצירת תאי NIS+BCMA-CAR T. ביום 0, בודדו את מחשבי ה-PBMCs ולאחר מכן בודדו תאי T לפי בחירה שלילית. לאחר מכן, לעורר תאי T עם חרוזי אנטי CD3 / CD28. ביום הראשון, יש להעביר תאי T עם lentiviruses NIS ו- BCMA-CAR. בימים 3, 4 ו- 5, לספור תאי T ולהאכיל עם מדיה כדי להתאים את הריכוז להיות 1.0 × ...

Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography at JoVE.com

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה למעקב לא פולשני אחר תאי T שהונדסו גנטית כדי לבטא קולטני אנטיגן כימריים ב- vivo עם פלטפורמה זמינה קלינית.

הדמיה דינמית של תאי T קולטן אנטיגן כימרי עם [18F]טטרפלואורובורט טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

אין פלטפורמת הדמיה של קולטן אנטיגן כימי מאומת קלינית עד כה. סימפורטר הנתרן-יוד מייצג כתב רגיש ורלוונטי מבחינה קלינית לתמונה של תאי T לרכב על ידי סריקת PET. הדמיית TLP PET של תא T של NIS CAR מאפשרת לחוקרים לעקוב באופן לא פולשני אחר תאים חדורים ב- vivo ויש לה פוטנציאל לחזות יעילות ורעילות של טיפול בתאי T CAR.הדמיה יעילה של תאי T CAR מאפשרת הערכה של סחר והתרחבות תאי T ומאפשרת פיתוח אסטרטגיות כדי להתגבר על המגבלות. השיטה המתוארת בפרוטוקול זה היא פשוטה וניתן ליישם אותה על מבני CAR אחרים מעבר לאלה המוצגים במחקר זה. התחל עם הבידוד של תאים חד-גרעיניים של דם היקפי או PBMCs מדגימת הדם באמצעות טכניקת שיפוע הצפיפות הסטנדרטית.כדי לעשות זאת, להוסיף בעדינות 15 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות לצינור הפרדה הדרגתי צפיפות 50 מיליליטר הימנעות היווצרות בועות. כדי למנוע השמנת תאים, דלל את דגימת הדם עם PBS המכיל 2%FBS ביחס נפח של אחד לאחד והעבר בעדינות את הדם המדולל על גבי מדיום שיפוע הצפיפות מבלי לשבור את הממשק בין השניים. לאחר מכן צנטריפוגה צינור ההפרדה ב 1, 200 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאסוף את supernatant לתוך צינור חרוטי טרי 50 מיליליטר, לשטוף את התאים עם PBS המכיל 2% FBS על ידי מילוי הצינור עד 50 מיליליטר סימן, צנטריפוגת הצינור ב 300 פעמים G במשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את העל-טבעי לפני שתשתמשו מחדש בתאים שנזרקו ב-50 מיליליטר של PBS המכילים 2%FBS. הגדילו מחדש את מחשבי ה-PBMCs הגלולים ב-PBS המכילים 2%FBS לריכוז של 50 כפול 10 בחזקת תאים שישית למיליליטר.חזור על הכביסה בצינור 50 מיליליטר טרי. לספור את מספר התאים ולאחר מכן צנטריפוגה השעיית התא ב 300 פעמים G במשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר. לבידוד תאי T, העבר מחשבי PBMCs מבודדים לצינור עגול 14 מיליליטר פוליסטירן עגול.לאחר מכן השתמש בערכת חרוזים מגנטיים לבחירה שלילית כדי לבצע בידוד תאי T על-ידי הצבת ה- PBMCs בקוקטייל נוגדנים של בחירה שלילית במפריד תאים אוטומטי לחלוטין. לאחר בידוד תאי T, לספור את התאים ואת התרבות התאים במדיום הרחבת תאי T או TCM בריכוז של פעמיים 10 עד התא השישי למיליליטר. לאחר מכן, לערבב את הבקבוקון המכיל את החרוזים נגד CD3/ CD28 על ידי ערבוב ופיפטה החוצה את הנפח הנדרש של חרוזים לתוך צינור microcentrifuge סטריליטר 1.5 מיליליטר.לכביסה, resuspened החרוזים במיליליטר אחד של TCM לפני הנחת צינור על מגנט במשך דקה אחת לשאוף את supernatant. לאחר הסרת הצינור מן המגנט, resuspend החרוזים שטף במיליליטר אחד של TCM ולחזור על הכביסה פעמיים. resuspend החרוזים שטף במיליליטר אחד של TCM כדי להעביר אותם לתרבות תאי T, ולאחר מכן לדלל את השעיית חרוזים T-cell עם TCM לריכוז של 1.0 כפול 10 לתאים השישיים למיליליטר לפני העברתו לתרבות רקמה מטופלת צלחת שש טוב.לדגור על צלחת הבאר ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% דו תחמוצת הפחמן. כדי להתקדם עם ההמרה של lentiviruses, להפשיר את lentiviruses קפוא בציפוי קולטני אנטיגן כימרי או נתרן-יוד symporter בארבע מעלות צלזיוס. לאחר 24 עד 48 שעות של גירוי תאי T, מערבבים את תאי ה- T כדי לפרק את האשכולות ולהוסיף את lentivirus שהופשר טרי לתאים בריבוי של זיהום של חמישה.לדגור על תאי T המועברים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% דו תחמוצת הפחמן. בימים 3, 4 ו-5 של דגירה, ספרו את תאי ה-T שהועברו והתאמו את ריכוז התאים ל-1.0 כפול 10 ל-6 למיליליטר על ידי הוספת TCM טרי שחומם מראש. עבור תאי T שהועברו בשקלים הנושאים את גן ההתנגדות לפורומיצין, טיפלו בתאים במיקרוגרם אחד למיליליטר של פורומיצין דיהידרוכלוריד בימים 3, 4 ו-5.ביום השישי, לשבור את אשכולות תאי T ולהסיר את החרוזים נגד CD3 / CD28 מתאי T שהועברו על ידי הצבת הצלחת על מגנט במשך דקה אחת. לאחר מכן למקם את התאים שנאספו בחזרה בתרבית בריכוז של 1.0 כפול 10 לתאים השישיים למיליליטר. לשטוף aliquot של תרבית תאי T המכיל 50, 000 תאים עם מאגר זרימה ולהחזיר את התאים עם 50 מיקרוליטרים של מאגר זרימה.לגילוי ביטוי CAR, הכתימו את תאי ה-T במיקרוליטר אחד של נוגדן נגד עכברים עזים. כדי לא לכלול את התאים המתים, הוסיפו 0.3 מיקרוליטרים של LIVE/DEAD Aqua. לדגור על התאים המוכתמים בחושך בטמפרטורת החדר.לאחר 15 דקות, לשטוף את התאים עם 150 microliters של חיץ זרימה ב 650 פעמים G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לתקן ולחדירות את התאים המוכתמים, לדגור על התאים עם 100 מיקרוליטרים של מדיום קיבוע במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם 100 microliters של חיץ המכיל סוכן חדירות תא כגון סאפונין וצנטריפוגה.לאחר הכביסה, תוסיפו מחדש את התאים המחדירים ל-50 מיקרוליטרים של חוצץ מחלחל. לאחר מכן הוסיפו 0.3 ננוגרם של נוגדן ETNL ש"ח אנטי אנושי ודגרו בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שעה אחת של דגירה, לשטוף את התאים על ידי הוספת 150 מיקרוליטרים של חיץ זרימה וצנטריפוגה כפי שהוכח.לאחר מכן לדגור על התאים עם 50 מיקרוליטרים של חיץ זרימה המכיל 2.5 מיקרוליטרים של נוגדן משני נגד ארנב במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת תאי T כפי שהוכח, resuspened התאים ב 200 מיקרוליטרים של מאגר זרימה לבצע cytometry זרימה. לאחר מכן לקבוע את יעילות ההמרה של התאים.ביום השמיני, לספור ולסובב את תאי T ב 300 פעמים G במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס לפני resuspending גלולה התא עם מדיום מקפיא בריכוז של 10 פעמים 10 כדי התא השישי לכל מיליליטר. מעבירים מיליליטר אחד של השעיית התא לכל בקבוקון קריו מסומן לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס מקפיא במשך 48 שעות. לאחר 48 שעות, להעביר את תאי T לחנקן נוזלי.הכינו את העכברים שהוזרקו עם תאי BCMA CAR T חיוביים ל-BCMA CAR להדמיית PET/CT על ידי שקילה של העכברים והסרת תגי אוזן מתכת. ואז להזריק 9.25 מגה-בקרל של F18 טטרפלואורובורט מוכן טרי לתוך העכבר תוך ורידי באמצעות הזרקת וריד הזנב. לאחר 45 דקות של תקופת ספיגה, המשך לרכוש תמונות PET סטטיות של עכבר מורדם במשך 15 דקות, ואחריו רכישת תמונת CT במשך חמש דקות עם סיבוב 360 מעלות ו 180 הקרנות.בניתוח מייצג זה, שיתוף פעולה של שני וירוסים לתאי T יצר תאי T חיוביים BCMA CAR T כאשר מעל 90% מהתאים היו חיוביים ל-NIS. הניתוח של קינטיקת גדילת תאי T מאפס לשמונה ימים גילה כי שילוב של BCMA CAR ו- NIS לא השפיע באופן משמעותי על התרחבות תאי T בהשוואה לתאים שלא הושפעו. בניתוח ציטומטרי הזרימה של OPM-2, תאים שהועברו עם lentivirus ייצגו את הביטוי GFP על טיפול עם puromycin.העכברים שקיבלו BCMA חיובי לוציפראז חיובי OPM-2 תאים היו נתונים הדמיה bioluminescence כדי לאשר את החריטה של תאי OPM-2. הדמיית PET של העכבר המנוהל על ידי F18 tetrafluoroborate חשפה התפלגות תאי T של BCMA CAR חיובית באיברים השונים ובמח העצם. בנוסף, תאי מח העצם שנקטפו מהעכבר הציגו את החריטה של תאי OPM-2 ואת המסירה של תאי ה-BCMA CAR T החיוביים של NISMA למח העצם.להדמיה איכותית של תאי T חדורים לרכב, חשוב לעקוב אחר השלבים של פרוטוקול ייצור תאי T של NIS CAR ולאשר נוכחות של שני שברים חיוביים של ש"ח ו-CAR.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

הדמיה חיה לחקר חוסר יציבות microtubule דינמי סרטן השד עמיד taxane

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

18F-FDG PET/CT הדמיה וחומר היסטולוגיה כמותית למדוד שינויים דינמיים במטבוליזם הגלוקוז במודלים של העכבר של סרטן ריאות

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

קרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית עבור הדמיה In Vivo של גליובלסטומה Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

הדמיה עם מודאלים מרובים זוהרים, פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/חישובית טומוגרפיה של מיאלומה נפוצה מח עצם Xenografts בעכברים ליקר ביצים

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

ב- Rechallenge תא הגידול חוץ גופית להערכה חזוי של Chimeric אנטיגן קולטן תא T פונקציה Antitumor

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

ייצור בצ הקולטן אנטיגן (רכב) T תאים לטיפול חיסוני המאמצת

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

ניהול חפצי תנועה נשימתית ב-18 טומוגרפיהשל פליטת פוזיטרונים F-fluorodeoxyglucose באמצעות אלגוריתם גת נשימתי אופטימלי המבוסס על משרעת

Positron emission tomography (PET) combined with X-ray computed tomography (CT) is an important molecular imaging platform that is required for accurate ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Positron Emission Tomography-based Dose Painting Radiation Therapy in a Glioblastoma Rat Model using the Small Animal Radiation Research Platform

פוזיטרונים פליטת טומוגרפיה מבוסס מינון ציור הקרנות טיפול במודל חולדת Glioblastoma באמצעות פלטפורמת מחקר קרינה בבעלי חיים קטנים

A rat glioblastoma model to mimic chemo-radiation treatment of human glioblastoma in the clinic was previously established. Similar to the clinical ...