Name: dynamic imaging of chimeric antigen receptor t cells with [18f]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography
Uploaded: 2022-02-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography at JoVE.com

Questo lavoro è stato in parte supportato attraverso la pipeline Mayo Clinic K2R (SSK), il Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) e la Predolin Foundation (RS). Le figure 1, 2 e 4 sono state create con BioRender.com.

Il protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board della Mayo Clinic, del Comitato istituzionale per la biosicurezza e del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Mayo Clinic.
1. Produzione di cellule T NIS+ BCMA-CAR
NOTA: Questo protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board della Mayo Clinic (IRB 17-008762) e dell'Institutional Biosafety Committee (IBC Bios00000006.04).
<ol><li>Produzione di BCMA...

Questo documento descrive una metodologia per incorporare NIS nelle cellule T CAR e l'imaging infuso di cellule T CAR in vivo attraverso [18F] TFB-PET. Come prova di concetto, le cellule T NIS + BCMA-CAR sono state generate tramite doppia trasduzione. Abbiamo recentemente riferito che l'incorporazione di NIS nelle cellule T CAR non compromette le funzioni e l'efficacia delle cellule T CAR in vivo e consente il traffico e l'espansione delle cellule T CAR30. P...

La terapia cellulare del recettore dell'antigene chimerico T (CAR T) è un approccio rapidamente emergente e potenzialmente curativo nelle neoplasie ematologiche1,2,3,4,5,6. Risultati clinici straordinari sono stati riportati dopo la terapia con cellule T CAR T (CART19) o CON l'antigene di maturazione delle cellule B (BCMA) CAR T2. Ciò ha portato all'approvazione da parte della Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti delle cellule CART19 per il linfoma aggressivo a cellule B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 e lisocabtagene maraleucel)7, leucemia linfoblastica acuta (Tisa-Cel)5,8, linfoma a cellule del mantello (brexucabtagene autoleuce)9 e linfoma follicolare (Axi-Cel)10 . Più recentemente, la FDA ha approvato la terapia con cellule T CAR diretta da BCMA in pazienti con mieloma multiplo (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Inoltre, la terapia con cellule T CAR per la leucemia linfocitica cronica (LLC) è in fase avanzata di sviluppo clinico e dovrebbe ricevere l'approvazione della FDA entro i prossimi tre anni1.
Nonostante i risultati senza precedenti della terapia con cellule T CAR, il suo uso diffuso è limitato da 1) insufficiente espansione in vivo delle cellule T CAR o scarso traffico verso i siti tumorali, che porta a tassi più bassi di risposta duratura12,13 e 2) lo sviluppo di eventi avversi potenzialmente letali, tra cui la sindrome da rilascio di citochine (CRS)14,15 . I segni distintivi della CRS includono non solo l'attivazione immunitaria con conseguente livelli elevati di citochine/chemochine infiammatorie, ma anche la massiccia proliferazione delle cellule T dopo infusione di cellule T CAR15,16. Pertanto, lo sviluppo di una strategia convalidata di livello clinico per l'immagine delle cellule T CAR in vivo consentirebbe 1) il tracciamento delle cellule T CAR in tempo reale in vivo per monitorare il loro traffico verso i siti tumorali e scoprire potenziali meccanismi di resistenza e 2) il monitoraggio dell'espansione delle cellule T CAR e potenzialmente prevedere le loro tossicità come lo sviluppo di CRS.
Le caratteristiche cliniche della CRS lieve sono febbre alta, affaticamento, mal di testa, eruzione cutanea, diarrea, artralgia, mialgia e malessere. Nella CRS più grave, i pazienti possono sviluppare tachicardia/ipotensione, perdita capillare, disfunzione cardiaca, insufficienza renale/epatica e coagulazione intravascolare disseminata17,18. In generale, il grado di elevazione delle citochine, tra cui interferone-gamma, fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi, interleuchina (IL)-10 e IL-6, ha dimostrato di essere correlato alla gravità dei sintomi clinici17,19. Tuttavia, l'ampia applicazione del monitoraggio delle citochine sieriche "in tempo reale" per prevedere la CRS è difficile a causa dell'elevato costo e della disponibilità limitata. Per sfruttare le caratteristiche benefiche della terapia con cellule T CAR, l'imaging non invasivo delle cellule T adottive può essere potenzialmente utilizzato per prevedere l'efficacia, la tossicità e la ricaduta dopo l'infusione di cellule T CAR.
Diversi ricercatori hanno sviluppato strategie per utilizzare l'imaging a base di radionuclidi con tomografia ad emissione di positroni (PET) o tomografia computerizzata a emissione di singolo fotone (SPECT), che fornisce alta risoluzione e alta sensibilità20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 per il visualizzazione e monitoraggio in vivo del traffico di cellule T CAR. Tra queste strategie di imaging basate su radionuclidi, il symporter di ioduro di sodio (NIS) è stato sviluppato come modalità sensibile per l'immagine di cellule e virus utilizzando scansioni PET31,32. L'imaging delle cellule T NIS+CAR con [18F]TFB-PET è una tecnologia sensibile, efficiente e conveniente per valutare e diagnosticare l'espansione, il traffico e la tossicità delle cellule T CAR30. Questo protocollo descrive 1) lo sviluppo di cellule T NIS+CAR attraverso la doppia trasduzione ad alta efficacia e 2) una metodologia per l'imaging di cellule T NIS+CAR con scansione [18F]TFB-PET. Le cellule T BCMA-CAR per MM sono utilizzate come modello proof-of-concept per descrivere NIS come reporter per l'imaging delle cellule T CAR. Tuttavia, queste metodologie possono essere applicate a qualsiasi altra terapia con cellule T CAR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>22 Gauge needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881250206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 gauge insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human (ETNL) NIS</td>
			<td>Imanis</td>
			<td>REA009</td>
			<td>ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>357507</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45, clone HI30, BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304032</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103116</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>F0110</td>
			<td>Secondary antibody for NIS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCMA-CAR construct, second generation</td>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-0037-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX System&#160; B5-R3-V5</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C04652</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Syringes with Luer-Lok Tips</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A13346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human T Cell Isolation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17951</td>
			<td>negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inveon Multiple Modality PET/CT scanner</td>
			<td>Siemens Medical Solutions USA, Inc.</td>
			<td>10506989 VFT 000 03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane liquid</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>66794-017-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina S5 Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS148588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>&#160;124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>450-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>450-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid&#160;Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>05557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM-2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>CRL-3273</td>
			<td>multiple myeloma cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>80389</td>
			<td>lentiviral vector encoding luciferase-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMOD software</td>
			<td>PMOD</td>
			<td>PBAS and P3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human AB Serum Plasma Derived</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IPLA-SERAB-H-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals, Inc.</td>
			<td>0210055210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep-S</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>21000</td>
			<td>Fully Automated Cell Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SepMate-50 (IVD)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85450</td>
			<td>density gradient separation tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrell (isoflurane, USP)</td>
			<td>Piramal Critical Care Inc</td>
			<td>66794-019-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Webcol Alcohol Prep</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic imaging of chimeric antigen receptor t cells with [18f]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography

Le cellule T geneticamente modificate per esprimere i recettori dell'antigene chimerico (CAR) hanno mostrato risultati senza precedenti in studi clinici registrativi per pazienti con tumori maligni delle cellule B o mieloma multiplo (MM). Tuttavia, numerosi ostacoli limitano l'efficacia e vietano l'uso diffuso di terapie con cellule T CAR a causa dello scarso traffico e infiltrazione nei siti tumorali e della mancanza di persistenza in vivo. Inoltre, le tossicità potenzialmente letali, come la sindrome da rilascio di citochine o la neurotossicità, sono le principali preoccupazioni. L'imaging e il tracciamento efficienti e sensibili delle cellule T CAR consentono la valutazione del traffico, dell'espansione e della caratterizzazione in vivo delle cellule T e consentono lo sviluppo di strategie per superare gli attuali limiti della terapia con cellule T CAR. Questo documento descrive la metodologia per incorporare il symporter di ioduro di sodio (NIS) nelle cellule T CAR e per l'imaging delle cellule T CAR utilizzando la tomografia ad emissione di tetrafluoroborato-positrone [18F] tetrafluoroborato ([18F] TFB-PET) in modelli preclinici. I metodi descritti in questo protocollo possono essere applicati ad altri costrutti CAR e geni bersaglio oltre a quelli utilizzati per questo studio.

La Figura 1 illustra le fasi di generazione delle cellule T NIS+BCMA-CAR. Il giorno 0, isolare i PBMC e quindi isolare le cellule T mediante selezione negativa. Quindi, stimolare le cellule T con perline anti-CD3 / CD28. Il giorno 1, trasdurre le cellule T con lentivirus NIS e BCMA-CAR. Nei giorni 3, 4 e 5, contare le cellule T e nutrirsi con i mezzi per regolare la concentrazione in modo che sia 1,0 × 106 / ml. Per le cellule T trasdotte da NIS, aggiungere 1 μg/mL di...

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Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Questo protocollo descrive la metodologia per il tracciamento non invasivo delle cellule T geneticamente modificate per esprimere i recettori dell'antigene chimerico in vivo con una piattaforma clinicamente disponibile.

Imaging dinamico di cellule T del recettore dell'antigene chimerico con [18F] tomografia ad emissione di positroni tetrafluoroborato/tomografia computerizzata

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Ad oggi non esiste una piattaforma di imaging delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico clinicamente convalidata. Il symporter sodio-ioduro rappresenta un reporter sensibile e clinicamente rilevante per l'immagine delle cellule T car mediante scansione PET. L'imaging PET TLP delle cellule T CAR NIS consente agli investigatori di tracciare in modo non invasivo le cellule infuse in vivo e ha un potenziale per prevedere l'efficacia e la tossicità della terapia con cellule T CAR.L'imaging efficiente delle cellule T CAR consente la valutazione del traffico e dell'espansione delle cellule T e consente lo sviluppo di strategie per superare i limiti. I metodi descritti in questo protocollo sono semplici e possono essere applicati ad altri costrutti CAR oltre a quelli mostrati in questo studio. Inizia con l'isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico o PBMC dal campione di sangue utilizzando la tecnica del gradiente di densità standard.Per fare ciò, aggiungere delicatamente 15 millilitri di gradiente di densità medio a un tubo di separazione con gradiente di densità di 50 millilitri evitando la formazione di bolle. Per evitare l'intrappolamento cellulare, diluire il campione di sangue con PBS contenente il 2% di FBS con un rapporto di volume uno a uno e trasferire delicatamente il sangue diluito sulla parte superiore del mezzo gradiente di densità senza rompere l'interfaccia tra i due. Quindi centrifugare il tubo di separazione a 1.200 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente.Raccogliere il surnatante in un tubo conico fresco da 50 millilitri, lavare le celle con PBS contenente il 2% di FBS riempiendo il tubo fino a 50 millilitri e centrifugando il tubo a 300 volte G per otto minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante prima di risospendere le celle pellettate in 50 millilitri di PBS contenenti il 2% di FBS. Risospesso i PBMC pellettizzati in PBS contenenti il 2% di FBS ad una concentrazione di 50 volte 10 alla sesta cella per millilitro.Ripetere il lavaggio in un tubo fresco da 50 millilitri. Contare il numero di celle e quindi centrifugare la sospensione cellulare a 300 volte G per otto minuti a temperatura ambiente. Per l'isolamento delle cellule T, trasferire PBMC isolati in un tubo di fondo rotondo in polistirene da 14 millilitri.Quindi utilizzare un kit di perline magnetiche di selezione negativa per eseguire l'isolamento delle cellule T posizionando i PBMC in un cocktail di anticorpi di selezione negativa in un separatore cellulare completamente automatizzato. Dopo l'isolamento delle cellule T, contare le cellule e coltivare le cellule nel mezzo di espansione delle cellule T o TCM ad una concentrazione di due volte 10 alla sesta cellula per millilitro. Quindi, mescolare il flaconcino contenente le perle anti-CD3/CD28 ruotando e pipettando il volume richiesto di perline in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri.Per il lavaggio, risospesciare le perline in un millilitro di MTC prima di posizionare il tubo su un magnete per un minuto e aspirare il surnatante. Dopo aver rimosso il tubo dal magnete, risospesciare le perline lavate in un millilitro di MTC e ripetere il lavaggio due volte. Sospendere le perle lavate in un millilitro di MTC per trasferirle alla coltura delle cellule T, quindi diluire la sospensione di perline di cellule T con MTC a una concentrazione di 1,0 volte 10 alla sesta cellula per millilitro prima di trasferirla in una coltura tissutale trattata con piastra a sei pozzetti.Incubare la piastra del pozzo a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Per progredire con la trasduzione dei lentivirus, scongelare i lentivirus congelati nel rivestimento dei recettori dell'antigene chimerico o del symporter dello ioduro di sodio a quattro gradi Celsius. Dopo 24-48 ore di stimolazione delle cellule T, mescolare le cellule T per rompere i cluster e aggiungere il lentivirus appena scongelato alle cellule a una molteplicità di infezione di cinque.Incubare le cellule T trasdotte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Nei giorni tre, quattro e cinque di incubazione, contare le cellule T trasdotte e regolare la concentrazione cellulare a 1,0 volte 10 alla sesta cella per millilitro aggiungendo TCM preriscaldata fresca. Per le cellule T trasdotte NIS che trasportano il gene di resistenza alla puromicina, trattare le cellule con un microgrammo per millilitro di puromicina dicloridrato nei giorni tre, quattro e cinque.Il sesto giorno, rompere i cluster di cellule T e rimuovere le perle anti-CD3 / CD28 dalle cellule T trasdotte posizionando la piastra su un magnete per un minuto. Quindi riposizionare le cellule raccolte nella coltura ad una concentrazione di 1,0 volte 10 alla sesta cella per millilitro. Lavare un'aliquota della coltura di cellule T contenente 50.000 cellule con buffer di flusso e risospese le celle con 50 microlitri di buffer di flusso.Per rilevare l'espressione di CAR, colorare le cellule T con un microlitro di anticorpo anti-topo di capra. Per escludere le cellule morte, aggiungere 0,3 microlitri di LIVE/DEAD Aqua. Incubare le cellule macchiate al buio a temperatura ambiente.Dopo 15 minuti, lavare le celle con 150 microlitri di tampone di flusso a 650 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius. Per fissare e permeabilizzare le cellule colorate, incubare le cellule con 100 microlitri di mezzo di fissazione per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi lavare le cellule due volte con 100 microlitri di un tampone contenente un agente permeabilizzante cellulare come saponina e centrifuga.Dopo il lavaggio, risospese le cellule permeabilizzate in 50 microlitri di un tampone permeabilizzante. Quindi aggiungere 0,3 nanogrammi di anticorpo ETNL NIS anti-umano e incubare a quattro gradi Celsius. Dopo un'ora di incubazione, lavare le cellule aggiungendo 150 microlitri di tampone di flusso e centrifuga come dimostrato.Quindi incubare le cellule con 50 microlitri di tampone di flusso contenenti 2,5 microlitri di anticorpo secondario anti-coniglio per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato le cellule T come dimostrato, risospese le cellule in 200 microlitri di tampone di flusso per eseguire la citometria a flusso. Quindi determinare l'efficienza di trasduzione delle cellule.L'ottavo giorno, contare e far girare le cellule T a 300 volte G per otto minuti a quattro gradi Celsius prima di risospendere il pellet cellulare con un mezzo di congelamento ad una concentrazione di 10 volte 10 alla sesta cella per millilitro. Trasferire un millilitro della sospensione cellulare in ogni flaconcino criomarchia etichettato per conservare a meno 80 gradi Celsius congelatore per 48 ore. Dopo 48 ore, trasferire le cellule T in azoto liquido.Preparare i topi iniettati con cellule T BCMA CAR NIS positive per l'imaging PET / CT pesando i topi e rimuovendo i marchi auricolari metallici. Quindi iniettare 9,25 megabecquerel di tetrafluoroborato F18 appena preparato nel topo per via endovenosa tramite iniezione della vena della coda. Dopo 45 minuti di periodo di assorbimento, procedere all'acquisizione di immagini PET statiche di un mouse anestetizzato per 15 minuti, seguite dall'acquisizione di immagini CT per cinque minuti con rotazione a 360 gradi e 180 proiezioni.In questa analisi rappresentativa, la co-trasduzione di due virus in cellule T ha generato cellule T BCMA CAR NIS positive in cui oltre il 90% delle cellule era NIS positivo. L'analisi della cinetica di crescita delle cellule T da zero a otto giorni ha rivelato che l'incorporazione di BCMA CAR e NIS non ha avuto un impatto significativo sull'espansione delle cellule T rispetto alle cellule non trasdotte. Nell'analisi citometrica a flusso di OPM-2, le cellule trasdotte con lentivirus rappresentavano l'espressione di GFP dopo il trattamento con puromicina.I topi che hanno ricevuto cellule OPM-2 BCMA positive alla luciferasi positiva sono stati sottoposti a imaging a bioluminescenza per confermare l'attecchimento delle cellule OPM-2. L'imaging PET del topo somministrato con tetrafluoroborato F18 ha rivelato la distribuzione delle cellule T BCMA CAR positiva al NIS nei vari organi e midollo osseo. Inoltre, le cellule del midollo osseo raccolte dal topo mostravano l'attecchimento delle cellule OPM-2 e la consegna delle cellule T BCMA CAR NIS positive al midollo osseo.Per l'imaging di alta qualità delle cellule T CAR infuse, è importante seguire le fasi del protocollo di generazione delle cellule T NIS CAR e confermare la presenza di frazioni NIS e CAR positive doppie.

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