Name: dynamic imaging of chimeric antigen receptor t cells with [18f]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography
Uploaded: 2022-02-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography at JoVE.com

이 작업은 Mayo Clinic K2R 파이프 라인 (SSK), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) 및 Predolin Foundation (RS)을 통해 부분적으로 지원되었습니다. 그림 1, 2 및 4는 BioRender.com 로 작성되었습니다.

이 프로토콜은 Mayo Clinic의 기관 검토위원회, 기관 생물 안전위원회 및 Mayo Clinic의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침을 따릅니다.
1. NIS+ BCMA-CAR T 세포 생산
참고: 이 프로토콜은 Mayo Clinic의 기관 검토 위원회(IRB 17-008762) 및 기관 생물안전위원회(IBC Bios00000006.04)의 지침을 따릅니다.
<ol><li>BCMA-CAR, NIS, 및 루시페라제-녹색 형광 단백질 (GFP)-코딩 렌?...

이 논문은 NIS를 CAR T 세포에 통합하고 [18F]TFB-PET 를 통해 생체 내에서 주입된 CAR T 세포를 이미징하는 방법론을 설명한다. 개념 증명으로서, NIS+BCMA-CAR T 세포는 이중 형질도입을 통해 생성되었다. 우리는 최근 NIS를 CAR T 세포에 혼입하는 것이 생체 내에서 CAR T 세포 기능 및 효능을 손상시키지 않으며 CAR T 세포 밀매 및 확장을 허용한다는 보고30을 보고?...

키메라 항원 수용체 T (CAR T) 세포 요법은 혈액학적 악성 종양 1,2,3,4,5,6에서 빠르게 출현하고 잠재적으로 치유적인 접근법이다. CD19-지시된 CAR T (CART19) 또는 B 세포 성숙 항원 (BCMA) CART 세포 요법2 후에 특별한 임상 결과가 보고되었다. 이로 인해 미국 식품의약국(FDA)은 공격적인 B 세포 림프종(axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 및 lisocabtagene maraleucel)7, 급성 림프모구성 백혈병(Tisa-Cel)5,8, 맨틀 세포 림프종(brexucabtagene autoleuce)9 및 여포 림프종(Axi-Cel)10에 대한 CART19 세포의 승인을 받았다. . 가장 최근에, FDA는 다발성 골수종 (MM) (idecabtagene vicleucel)11 환자에서 BCMA 지시 CAR T 세포 요법을 승인했다. 또한, 만성 림프구성 백혈병(CLL)에 대한 CAR T 세포 치료제는 후기 단계의 임상 개발 단계에 있으며 향후 3년 이내에 FDA 승인을 받을 것으로 예상됩니다1.
CAR T 세포 요법의 전례 없는 결과에도 불구하고, 그것의 광범위한 사용은 1) 생체내 CAR T 세포 확장이 불충분하거나 종양 부위로의 불량한 밀매에 의해 제한되며, 이는 내구성 있는 반응의 낮은 비율로 이어진다.12,13 및 2) 사이토카인 방출 증후군(CRS)14,15을 포함한 생명을 위협하는 유해 사례의 발달 . CRS의 특징은 염증성 사이토카인/케모카인의 상승된 수준을 초래하는 면역 활성화뿐만 아니라 CAR T 세포 주입 후 대규모 T 세포 증식을 포함한다15,16. 따라서, 생체내에서 CAR T 세포를 이미지화하기 위한 검증된, 임상적 등급 전략의 개발은 1) CAR T 세포 추적이 생체내에서 실시간으로 추적되어 종양 부위로의 그들의 인신매매를 모니터링하고, 내성의 잠재적 메카니즘을 밝혀내고, 2) CAR T 세포 확장의 모니터링과 CRS의 발달과 같은 잠재적으로 그들의 독성을 예측하는 것을 허용할 것이다.
경미한 CRS의 임상 적 특징은 고열, 피로, 두통, 발진, 설사, 관절통, 근육통 및 불쾌감입니다. 더 심한 CRS에서 환자는 빈맥 / 저혈압, 모세관 누출, 심장 기능 장애, 신장 / 간 기능 부전 및 전파 된 혈관 내 응고를 일으킬 수 있습니다17,18. 일반적으로, 인터페론-감마, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자, 인터루킨(IL)-10, 및 IL-6을 포함하는 사이토카인의 상승 정도는 임상 증상의 중증도와 상관관계가 있는 것으로 나타났다17,19. 그러나, CRS를 예측하기 위한 "실시간" 혈청 사이토카인 모니터링의 광범위한 적용은 높은 비용 및 제한된 가용성으로 인해 어렵다. CAR T 세포 요법의 유익한 특성을 이용하기 위해, 입양 T 세포의 비침습적 영상화는 CAR T 세포 주입 후 효능, 독성 및 재발을 예측하는데 잠재적으로 이용될 수 있다.
몇몇 연구자들은 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT)을 사용하여 방사성 핵종 기반 이미징을 사용하는 전략을 개발했으며, 이는 고해상도 및 고감도를 제공합니다.20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 CAR T 세포 트래피킹의 생체내 시각화 및 모니터링. 이러한 방사성 핵종 기반 이미징 전략 중에서 요오드화 나트륨 심포터 (NIS)는 PET 스캔31,32을 사용하여 이미지 세포 및 바이러스에 민감한 양식으로 개발되었습니다. [18F]TFB-PET를 사용한 NIS+CAR T 세포 이미징은 CAR T 세포 확장, 트래피킹 및 독성을 평가하고 진단하는 민감하고 효율적이며 편리한 기술입니다30. 이 프로토콜은 1) 높은 효능을 갖는 이중 형질도입을 통한 NIS+CAR T 세포의 발달 및 2) [18F]TFB-PET 스캔으로 NIS+CAR T 세포를 이미징하기 위한 방법론을 기술한다. MM용 BCMA-CAR T 세포는 CAR T 세포 이미징을 위한 리포터로서 NIS를 설명하기 위한 개념 증명 모델로서 사용된다. 그러나, 이들 방법론은 임의의 다른 CAR T 세포 요법에 적용될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>22 Gauge needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881250206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 gauge insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human (ETNL) NIS</td>
			<td>Imanis</td>
			<td>REA009</td>
			<td>ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>357507</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45, clone HI30, BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304032</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103116</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>F0110</td>
			<td>Secondary antibody for NIS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCMA-CAR construct, second generation</td>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-0037-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX System&#160; B5-R3-V5</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C04652</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Syringes with Luer-Lok Tips</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A13346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human T Cell Isolation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17951</td>
			<td>negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inveon Multiple Modality PET/CT scanner</td>
			<td>Siemens Medical Solutions USA, Inc.</td>
			<td>10506989 VFT 000 03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane liquid</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>66794-017-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina S5 Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS148588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>&#160;124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>450-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>450-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid&#160;Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>05557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM-2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>CRL-3273</td>
			<td>multiple myeloma cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>80389</td>
			<td>lentiviral vector encoding luciferase-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMOD software</td>
			<td>PMOD</td>
			<td>PBAS and P3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human AB Serum Plasma Derived</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IPLA-SERAB-H-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals, Inc.</td>
			<td>0210055210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep-S</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>21000</td>
			<td>Fully Automated Cell Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SepMate-50 (IVD)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85450</td>
			<td>density gradient separation tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrell (isoflurane, USP)</td>
			<td>Piramal Critical Care Inc</td>
			<td>66794-019-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Webcol Alcohol Prep</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic imaging of chimeric antigen receptor t cells with [18f]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography

키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포는 B 세포 악성 종양 또는 다발성 골수종 (MM) 환자에 대한 중추적 인 임상 시험에서 전례없는 결과를 보여주었습니다. 그러나, 수많은 장애물들이 효능을 제한하고, 생체 내에서의 지속성의 부족뿐만 아니라 종양 부위로의 불량한 밀매 및 침윤으로 인해 CAR T 세포 요법의 광범위한 사용을 금지한다. 또한, 사이토카인 방출 증후군이나 신경 독성과 같은 생명을 위협하는 독성이 주요 관심사입니다. CAR T 세포의 효율적이고 민감한 이미징 및 추적은 T 세포 밀매, 확장 및 생체내 특성화의 평가를 가능하게 하고, CAR T 세포 요법의 현재 한계를 극복하기 위한 전략의 개발을 가능하게 한다. 이 논문은 CAR T 세포에 요오드화 나트륨 교감 (NIS)을 통합하고 전임상 모델에서 [18F]테트라플루오로보레이트-양전자 방출 단층 촬영 ([18F]TFB-PET)을 사용하는 CAR T 세포 이미징에 대한 방법론을 설명합니다. 이 프로토콜에 기재된 방법은 본 연구에 사용된 것들 이외에 다른 CAR 구축물 및 표적 유전자에 적용될 수 있다.

도 1은 NIS+BCMA-CAR T 세포를 생성하는 단계를 나타낸다. 0일째에, PBMCs를 분리한 다음, 음성 선택에 의해 T 세포를 분리한다. 이어서, T 세포를 항-CD3/CD28 비드로 자극한다. 1일째에, T 세포를 NIS 및 BCMA-CAR 렌티바이러스 둘 다로 형질도입한다. 3일, 4일, 5일째에 T 세포를 계수하고 배지로 사료를 공급하여 농도를 1.0 × 106/mL로 조정한다. NIS 형질도입된 T 세포의 경우, ?...

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Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

이 프로토콜은 임상적으로 이용가능한 플랫폼으로 생체내에서 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 T 세포를 비침습적으로 추적하는 방법론을 기술한다.

키메라 항원 수용체 T 세포의 동적 이미징 [18F]테트라플루오로보레이트 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

현재까지 임상적으로 검증된 키메라 항원 수용체 T 세포 이미징 플랫폼은 없다. 소듐-요오드화물 심포터는 PET 스캔에 의해 자동차 T 세포를 이미지화하는 민감하고 임상적으로 관련된 리포터를 나타낸다. NIS CAR T-세포의 TLP PET 이미징은 조사자들이 생체내에서 주입된 세포를 비침습적으로 추적할 수 있게 하며, CAR T-세포 요법의 효능 및 독성을 예측할 수 있는 잠재력을 갖는다.CAR T-세포의 효율적인 이미징은 T-세포 밀매와 확장의 평가를 가능하게 하고, 한계를 극복하기 위한 전략의 개발을 가능하게 한다. 이 프로토콜에 기술된 방법은 간단하며, 본 연구에 나타난 것 이상의 다른 CAR 구축물에 적용될 수 있다. 표준 밀도 구배 기술을 사용하여 혈액 샘플에서 말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC를 분리하는 것으로 시작하십시오.이렇게하려면 거품 형성을 피하는 50 밀리리터 밀도 구배 분리 튜브에 15 밀리리터의 밀도 구배 매체를 부드럽게 첨가하십시오. 세포 포획을 피하기 위해, 혈액 샘플을 일대일 부피비로 2%FBS를 함유하는 PBS로 희석하고, 희석된 혈액을 밀도 구배 배지의 상부에 부드럽게 전달하여 둘 사이의 계면을 깨뜨리지 않는다. 그 후 분리관을 실온에서 10분 동안 1, 200배 G에서 원심분리한다.상층액을 신선한 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 넣고, 튜브를 최대 50 밀리리터 마크까지 채우고, 실온에서 8분 동안 튜브를 300배 G에서 원심분리하여 2%FBS를 함유하는 PBS로 세포를 세척한다. 펠릿화된 세포를 2%FBS를 함유하는 PBS 50 밀리리터에 재현탁시키기 전에 상청액을 흡인한다. 펠릿된 PBMCs를 2%FBS를 함유하는 PBS에 밀리리터당 여섯 번째 세포에 10배 내지 50배의 농도로 재현탁시킨다.신선한 50 밀리리터 튜브에서 세척을 반복하십시오. 세포 수를 계수한 다음, 실온에서 8분 동안 300배 G에서 세포 현탁액을 원심분리한다. T 세포 분리를 위해, 분리된 PBMC를 14밀리리터 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.그런 다음 음성 선택 자기 비드 키트를 사용하여 PBMC를 완전 자동화 된 세포 분리기의 음성 선택 항체 칵테일에 배치하여 T 세포 분리를 수행하십시오. T 세포 분리 후, 세포를 계수하고, 밀리리터 당 여섯 번째 세포를 10회 내지 두 배의 농도로 T-세포 확장 배지 또는 TCM에서 배양하였다. 다음에, 항-CD3/CD28 비드를 함유하는 바이알을 소용돌이치면서 혼합하고, 필요한 부피의 비드를 피펫팅하여 멸균된 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브 내로 피펫팅한다.세척을 위해, 튜브를 자석에 놓기 전에 TCM의 한 밀리리터에 비드를 재현탁시키고 상청액을 흡인시킨다. 자석에서 튜브를 제거한 후, 세척된 비드를 TCM 한 밀리리터에 재현탁시키고 세척을 두 번 반복한다. 세척된 비드를 TCM 1밀리리터에 재현탁시켜 이를 T 세포 배양물로 옮긴 다음, 이를 조직 배양물로 옮기기 전에 TCM으로 T-세포 비드 현탁액을 밀리리터당 여섯 번째 세포에 1.0배 1.0배의 농도로 희석하여 여섯 웰 플레이트로 처리하였다.웰 플레이트를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 인큐베이션하십시오. 렌티바이러스의 형질도입과 함께 진행하기 위해, 동결된 렌티바이러스를 섭씨 네 도에서 키메라 항원 수용체 또는 나트륨-요오드화물 교감체로 코팅하여 해동시킨다. 24 내지 48시간의 T 세포 자극 후, T-세포를 혼합하여 클러스터를 분해하고 갓 해동된 렌티바이러스를 다섯 개의 감염의 다중도에서 세포에 첨가한다.형질도입된 T 세포를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 배양한다. 배양 셋째, 넷, 다섯 번째 날에, 형질도입된 T 세포를 계수하고, 신선한 미리 가온된 TCM을 첨가함으로써 밀리리터 당 여섯 번째 세포에 1.0배 1.0배로 세포 농도를 조정한다. 퓨로마이신 내성 유전자를 운반하는 NIS 형질도입된 T 세포의 경우, 세 번째, 네 번째 및 다섯 일에 푸로마이신 디하이드로클로라이드의 밀리리터당 하나의 마이크로그램으로 세포를 처리한다.여섯째 날에, T 세포 클러스터를 분해하고, 플레이트를 자석 상에 1분 동안 위치시킴으로써 형질도입된 T-세포로부터 항-CD3/CD28 비드를 제거한다. 그 다음 수집된 세포를 다시 1.0배의 농도로 배양물에 넣고 밀리리터당 여섯 번째 세포에 10배의 농도로 배치한다. 50, 000 세포를 함유하는 T 세포 배양물의 분취량을 유동 완충액으로 세척하고, 세포를 50 마이크로리터의 유동 완충액으로 재현탁시킨다.CAR 발현을 검출하기 위해, T-세포를 한 마이크로리터의 염소 항-마우스 항체로 염색한다. 죽은 세포를 제외하려면 0.3 마이크로 리터의 LIVE / DEAD Aqua를 추가하십시오. 염색된 세포를 실온에서 어둠 속에서 인큐베이션한다.15분 후, 세포를 섭씨 4도에서 3분 동안 650배 G에서 150 마이크로리터의 유동 완충액으로 세척한다. 염색된 세포를 고정시키고 투과시키기 위해, 세포를 섭씨 네 도에서 20분 동안 100 마이크로리터의 고정 배지로 인큐베이션한다. 그런 다음 사포닌 및 원심분리기와 같은 세포 투과제를 함유하는 완충액 100 마이크로리터로 세포를 두 번 세척한다.세척 후, 투과화된 세포를 50 마이크로리터의 투과성 완충액에 재현탁시킨다. 그 다음 0.3 나노그램의 항-인간 ETNL NIS 항체를 첨가하고, 섭씨 4도에서 배양한다. 1시간의 인큐베이션 후에, 입증된 바와 같이 150 마이크로리터의 유동 완충액 및 원심분리기를 첨가하여 세포를 세척한다.이어서, 세포를 섭씨 4도에서 30분 동안 2.5 마이크로리터의 항토끼 이차 항체를 함유하는 50 마이크로리터의 유동 완충액으로 인큐베이션한다. 입증된 바와 같이 T 세포를 세척한 후, 세포를 200 마이크로리터의 유동 완충액에 재현탁시켜 유세포 분석을 수행한다. 그런 다음 세포의 형질도입 효율을 결정한다.여덟 번째 날에, T-세포를 섭씨 네 도에서 8분 동안 300배 G에서 카운트하고 스핀다운한 다음, 세포 펠릿을 밀리리터당 여섯 번째 세포에 10배 10배의 농도로 동결 배지로 재현탁시켰다. 세포 현탁액 한 밀리리터를 라벨이 붙은 각 냉동 바이알로 옮겨 섭씨 영하 80도 냉동고에서 48시간 동안 보관한다. 48시간 후, T-세포를 액체 질소로 옮긴다.PET/CT 이미징을 위해 NIS 양성 BCMA CAR T 세포를 주입한 마우스를 준비하여 마우스를 칭량하고 금속 귀 태그를 제거합니다. 그런 다음 갓 준비한 F18 테트라플루오로보레이트의 9.25 메가베크렐을 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에 정맥 주사합니다. 흡수 기간 45분 후, 15분 동안 마취된 마우스의 정적 PET 이미지 획득을 진행하고, 이어서 360도 회전 및 180도 프로젝션으로 5분 동안 CT 이미지 획득을 진행한다.이 대표적인 분석에서, 두 바이러스를 T 세포로 공동-형질도입하여 NIS 양성 BCMA CAR T-세포를 생성하였으며, 여기서 세포의 90% 이상이 NIS 양성이었다. 0일에서 여덟 일까지의 T 세포 성장 동역학을 분석한 결과, BCMA CAR 및 NIS의 혼입은 형질도입되지 않은 세포와 비교했을 때 T 세포 확장에 유의한 영향을 미치지 않았다는 것이 밝혀졌다. OPM-2의 유세포 분석에서, 렌티바이러스로 형질도입된 세포는 퓨로마이신으로 처리시 GFP 발현을 나타내었다.BCMA 양성 루시퍼라아제 양성 OPM-2 세포를 투여받은 마우스는 OPM-2 세포의 생착을 확인하기 위해 생체발광 이미징을 실시하였다. F18 테트라플루오로보레이트 투여된 마우스의 PET 영상화는 다양한 기관 및 골수에서 NIS 양성 BCMA CAR T 세포 분포를 밝혀냈다. 추가적으로, 마우스로부터 수확된 골수 세포는 OPM-2 세포의 생착 및 NIS 양성 BCMA CAR T 세포의 골수로의 전달을 나타내었다.주입된 CAR T-세포의 고품질 이미징을 위해서는 NIS CAR T 세포 생성 프로토콜의 단계를 따르고 이중 NIS 및 CAR 양성 분획의 존재를 확인하는 것이 중요하다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

라이브 영상은 탁 내성 유방암의 미세 소관 동적 불안정성을 연구하는

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

연구

암 연구학

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

18F FDG PET/CT 영상 및 정량 조직학 폐암의 마우스 모델에서 포도 당 물질 대사에 있는 동적인 변화를 측정 하

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

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Vivo에서 이미징 세포종 Xenografts의 형광 분자 단층 촬영

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

다 발성 골 수 Xenografts 노 그 쥐에서의 복합 발광 및 양자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 영상

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

체 외 종양 세포 Rechallenge 공상 항 원 수용 체 T 세포 Antitumor 기능 예측 평가

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

입양 면역 요법을 위한 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 제조

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

진폭 기반 최적의 호흡기 개팅 알고리즘을 사용하여 18F-플루오로옥시옥포도당 양전자 방출 단층 촬영에서 호흡기 운동 유물 관리

Positron emission tomography (PET) combined with X-ray computed tomography (CT) is an important molecular imaging platform that is required for accurate ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Positron Emission Tomography-based Dose Painting Radiation Therapy in a Glioblastoma Rat Model using the Small Animal Radiation Research Platform

작은 동물 방사선 연구 플랫폼을 사용하여 교모 세포종 쥐 모델에서 양전자 방출 단층 촬영 기반 용량 페인팅 방사선 요법

A rat glioblastoma model to mimic chemo-radiation treatment of human glioblastoma in the clinic was previously established. Similar to the clinical ...