Name: dynamic imaging of chimeric antigen receptor t cells with [18f]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography
Uploaded: 2022-02-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography at JoVE.com

Bu çalışma kısmen Mayo Clinic K2R boru hattı (SSK), Mayo Clinic Bireyselleştirilmiş Tıp Merkezi (SSK) ve Predolin Vakfı (RS) aracılığıyla desteklenmiştir. Şekil 1, 2 ve 4 BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Protokol, Mayo Clinic'in Kurumsal İnceleme Kurulu, Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi ve Mayo Clinic'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerini takip etmektedir.
1. NIS + BCMA-CAR T hücre üretimi
NOT: Bu protokol, Mayo Clinic'in Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB 17-008762) ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin (IBC Bios00000006.04) yönergelerini takip eder.
<ol><li>BCMA-CAR, NIS ve lusiferaz-yeşil floresan protein (GFP) kodla...

Bu yazıda NIS'in CAR T hücrelerine dahil edilmesi ve [18F]TFB-PET aracılığıyla infüze edilmiş CAR T hücrelerinin in vivo görüntülenmesi için bir metodoloji açıklanmaktadır. Kavramın kanıtı olarak, NIS + BCMA-CAR T hücreleri çift iletim yoluyla üretildi. Son zamanlarda, NIS'in CAR T hücrelerine dahil edilmesinin CAR T hücresi fonksiyonlarını ve etkinliğini in vivo olarak bozmadığını ve CAR T hücresi kaçakçılığına ve genişlemes...

Kimerik antijen reseptörü T (CAR T) hücre tedavisi, hematolojik malignitelerde hızla ortaya çıkan ve potansiyel olarak küratif bir yaklaşımdır1,2,3,4,5,6. CD19 yönelimli CAR T (CART19) veya B hücre olgunlaşma antijeni (BCMA) CAR T hücre tedavisinden sonra olağanüstü klinik sonuçlar bildirilmiştir2. Bu, agresif B hücreli lenfoma (aksikabagen ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 ve lisocabtagene maraleucel)7, akut lenfoblastik lösemi (Tisa-Cel)5,8, mantle hücreli lenfoma (brexucabtagene autoleuce)9 ve foliküler lenfoma (Axi-Cel)10 için ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) CART19 hücrelerinin onaylanmasına yol açmıştır. . Son zamanlarda, FDA, multipl miyelom (MM) (idecabtagene vicleucel)11 hastalarında BCMA yönelimli CAR T hücre tedavisini onayladı. Ayrıca, kronik lenfositik lösemi (KLL) için CAR T hücre tedavisi geç evre klinik gelişim aşamasındadır ve önümüzdeki üç yıl içinde FDA onayı alması beklenmektedir1.
CAR T hücre tedavisinin benzeri görülmemiş sonuçlarına rağmen, yaygın kullanımı 1) yetersiz in vivo CAR T hücre genişlemesi veya tümör bölgelerine zayıf kaçakçılık, daha düşük kalıcı yanıt oranlarına yol açar12,13 ve 2) sitokin salınım sendromu (CRS) dahil olmak üzere hayatı tehdit eden advers olayların gelişmesi14,15 ile sınırlıdır. . CRS'nin ayırt edici özellikleri arasında sadece inflamatuar sitokin/kemokinlerin yüksek düzeyleriyle sonuçlanan immün aktivasyon değil, aynı zamanda CAR T hücre infüzyonundan sonra masif T hücre proliferasyonu da bulunmaktadır15,16. Bu nedenle, CAR T hücrelerini in vivo olarak görüntülemek için doğrulanmış, klinik sınıf bir stratejinin geliştirilmesi, 1) CAR T hücresinin tümör bölgelerine kaçakçılığını izlemek ve potansiyel direnç mekanizmalarını ortaya çıkarmak için in vivo olarak gerçek zamanlı olarak izlenmesine ve 2) CAR T hücresi genişlemesinin izlenmesine ve CRS'nin gelişimi gibi toksisitelerini potansiyel olarak tahmin etmesine izin verecektir.
Hafif KRS'nin klinik özellikleri yüksek ateş, yorgunluk, baş ağrısı, döküntü, ishalji, artralji, miyalji ve halsizliktir. Daha şiddetli KRS'de hastalarda taşikardi/hipotansiyon, kılcal damar kaçağı, kardiyak disfonksiyon, böbrek/karaciğer yetmezliği ve yaygın intravasküler pıhtılaşma gelişebilir17,18. Genel olarak, interferon-gama, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör, interlökin (IL)-10 ve IL-6 dahil olmak üzere sitokinlerin yükselme derecesinin klinik semptomların şiddeti ile ilişkili olduğu gösterilmiştir17,19. Bununla birlikte, CRS'yi tahmin etmek için "gerçek zamanlı" serum sitokin izlemenin kapsamlı bir şekilde uygulanması, yüksek maliyet ve sınırlı kullanılabilirlik nedeniyle zordur. CAR T hücre tedavisinin yararlı özelliklerinden yararlanmak için, evlat edinen T hücrelerinin non-invaziv görüntülemesi, CAR T hücre infüzyonundan sonra etkinliği, toksisiteleri ve nüksetmeyi tahmin etmek için potansiyel olarak kullanılabilir.
Birçok araştırmacı, pozitron emisyon tomografisi (PET) veya tek foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT) ile radyonüklid tabanlı görüntülemeyi kullanmak için stratejiler geliştirmiştir, bu da yüksek çözünürlük ve yüksek hassasiyet sağlar20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 CAR T hücre kaçakçılığının in vivo görselleştirilmesi ve izlenmesi. Bu radyonüklid tabanlı görüntüleme stratejileri arasında, sodyum iyodür simporter (NIS), PET taramaları kullanılarak görüntü hücrelerine ve virüslere duyarlı bir yöntem olarak geliştirilmiştir31,32. [18F]TFB-PET ile NIS+CAR T hücre görüntüleme, CAR T hücresi genişlemesini, kaçakçılığını ve toksisitesini değerlendirmek ve teşhis etmek için hassas, verimli ve kullanışlı bir teknolojidir30. Bu protokol 1) yüksek etkinlikli çift transdüksiyon yoluyla NIS + CAR T hücrelerinin gelişimini ve 2) NIS + CAR T hücrelerini [18F] TFB-PET taraması ile görüntülemek için bir metodolojiyi açıklar. MM için BCMA-CAR T hücreleri, NIS'i CAR T hücresi görüntüleme için bir muhabir olarak tanımlamak için bir kavram kanıtı modeli olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu metodolojiler başka herhangi bir CAR T hücre tedavisine uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>22 Gauge needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881250206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 gauge insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human (ETNL) NIS</td>
			<td>Imanis</td>
			<td>REA009</td>
			<td>ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>357507</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45, clone HI30, BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304032</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103116</td>
			<td>Flow antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>F0110</td>
			<td>Secondary antibody for NIS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCMA-CAR construct, second generation</td>
			<td>IDT, Coralville, IA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-0037-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX System&#160; B5-R3-V5</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C04652</td>
			<td>flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Syringes with Luer-Lok Tips</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A13346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human T Cell Isolation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17951</td>
			<td>negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F8067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inveon Multiple Modality PET/CT scanner</td>
			<td>Siemens Medical Solutions USA, Inc.</td>
			<td>10506989 VFT 000 03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane liquid</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>66794-017-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina S5 Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS148588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>&#160;124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>450-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>450-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid&#160;Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson laboratory</td>
			<td>05557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM-2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>CRL-3273</td>
			<td>multiple myeloma cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>80389</td>
			<td>lentiviral vector encoding luciferase-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMOD software</td>
			<td>PMOD</td>
			<td>PBAS and P3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human AB Serum Plasma Derived</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IPLA-SERAB-H-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>MP Biomedicals, Inc.</td>
			<td>0210055210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RoboSep-S</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>21000</td>
			<td>Fully Automated Cell Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SepMate-50 (IVD)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85450</td>
			<td>density gradient separation tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, 5% (w/v)</td>
			<td>Ricca Chemical</td>
			<td>7144.8-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrell (isoflurane, USP)</td>
			<td>Piramal Critical Care Inc</td>
			<td>66794-019-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Webcol Alcohol Prep</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic imaging of chimeric antigen receptor t cells with [18f]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography

Kimerik antijen reseptörlerini (CAR) eksprese etmek için genetik olarak tasarlanmış T hücreleri, B hücreli maligniteleri veya multipl miyelom (MM) olan hastalar için önemli klinik çalışmalarda benzeri görülmemiş sonuçlar göstermiştir. Bununla birlikte, çok sayıda engel etkinliği sınırlamakta ve CAR T hücre tedavilerinin yaygın kullanımını, tümör bölgelerine kötü kaçakçılık ve infiltrasyonun yanı sıra in vivo kalıcılık eksikliği nedeniyle yasaklamaktadır. Ayrıca, sitokin salınım sendromu veya nörotoksisite gibi hayatı tehdit eden toksisiteler önemli endişelerdir. CAR T hücrelerinin verimli ve hassas görüntülenmesi ve izlenmesi, T hücresi kaçakçılığının, genişlemesinin ve in vivo karakterizasyonunun değerlendirilmesini sağlar ve CAR T hücre tedavisinin mevcut sınırlamalarının üstesinden gelmek için stratejilerin geliştirilmesine olanak tanır. Bu yazıda sodyum iyodür sempatizanının (NIS) CAR T hücrelerine dahil edilmesi ve preklinik modellerde [18F]tetrafloroborat-pozitron emisyon tomografisi ([18F]TFB-PET) kullanılarak CAR T hücre görüntülemesi için metodoloji anlatılmaktadır. Bu protokolde açıklanan yöntemler, bu çalışmada kullanılanlara ek olarak diğer CAR yapılarına ve hedef genlere uygulanabilir.

Şekil 1 , NIS + BCMA - CAR T hücreleri oluşturma adımlarını göstermektedir. 0. günde, PBMC'leri izole edin ve ardından negatif seleksiyonla T hücrelerini izole edin. Daha sonra, T hücrelerini anti-CD3 / CD28 boncuklarla uyarın. 1. günde, T hücrelerini hem NIS hem de BCMA-CAR lentivirüsleri ile dönüştürün. 3, 4 ve 5. günlerde, T hücrelerini sayın ve konsantrasyonu 1.0 × 106 / mL olarak ayarlamak için medya ile besleyin. NIS ile dönüştürülmü...

Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography at JoVE.com

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Bu protokol, klinik olarak mevcut bir platformla kimerik antijen reseptörlerini in vivo olarak eksprese etmek için genetik olarak tasarlanmış T hücrelerini invaziv olmayan bir şekilde izleme metodolojisini açıklamaktadır.

Kimerik Antijen Reseptör T Hücrelerinin [18F]Tetrafloroborat Pozitron Emisyon Tomografisi/Bilgisayarlı Tomografi ile Dinamik Görüntülenmesi

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Bugüne kadar klinik olarak doğrulanmış kimerik antijen reseptörü T-hücresi görüntüleme platformu bulunmamaktadır. Sodyum-iyodür simportörü, PET taraması ile Car T-hücrelerini görüntülemek için hassas ve klinik olarak ilgili bir muhabiri temsil eder. NIS CAR T-hücresinin TLP PET görüntülemesi, araştırmacıların infüze edilmiş hücreleri in vivo olarak invaziv olmayan bir şekilde izlemelerini sağlar ve CAR T-hücresi tedavisinin etkinliğini ve toksisitesini tahmin etme potansiyeline sahiptir.CAR T hücrelerinin verimli görüntülenmesi, T hücresi kaçakçılığının ve genişlemesinin değerlendirilmesini sağlar ve sınırlamaların üstesinden gelmek için stratejilerin geliştirilmesine olanak tanır. Bu protokolde açıklanan yöntem basittir ve bu çalışmada gösterilenlerin ötesinde diğer CAR yapılarına uygulanabilir. Standart yoğunluk gradyan tekniğini kullanarak periferik kan mononükleer hücrelerinin veya PBMC'lerin kan örneğinden izole edilmesiyle başlayın.Bunu yapmak için, kabarcık oluşumunu önleyen 50 mililitrelik yoğunluk gradyanı ayırma tüpüne nazikçe 15 mililitre yoğunluk gradyanı ortamı ekleyin. Hücre sıkışmasını önlemek için, kan örneğini bire bir hacim oranında% 2FBS içeren PBS ile seyreltin ve seyreltilmiş kanı ikisi arasındaki arayüzü kırmadan yoğunluk gradyanı ortamının üzerine yavaşça aktarın. Daha sonra ayırma tüpünü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.200 kez G'de santrifüj yapın.Süpernatantı taze bir 50 mililitrelik konik tüpe toplayın, tüpü 50 mililitreye kadar doldurarak hücreleri% 2 FBS içeren PBS ile yıkayın ve tüpü oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj edin. Pelet hücrelerini% 2 FBS içeren 50 mililitre PBS'de yeniden askıya almadan önce süpernatantı aspire edin. % 2 FBS içeren PBS'deki peletlenmiş PBMC'leri, mililitre başına 50 kat 10 ila altıncı hücre konsantrasyonuna kadar yeniden askıya alın.Yıkamayı taze 50 mililitrelik bir tüpte tekrarlayın. Hücre sayısını sayın ve ardından hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın. T-hücresi izolasyonu için, izole PBMC'leri 14 mililitrelik polistiren yuvarlak alt tüpe aktarın.Ardından, PBMC'leri tam otomatik bir hücre ayırıcıda negatif seleksiyon antikor kokteyline yerleştirerek T hücresi izolasyonunu gerçekleştirmek için negatif seleksiyonlu manyetik boncuk kiti kullanın. T-hücresi izolasyonundan sonra, hücreleri sayın ve T hücresi genişleme ortamındaki hücreleri veya TCM'deki hücreleri, mililitre başına altıncı hücrelere iki kez 10 ila iki kat konsantrasyonda kültürleyin. Daha sonra, anti-CD3 / CD28 boncuklarını içeren şişeyi, gerekli boncuk hacmini döndürerek ve pipetleyerek steril bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne karıştırın.Yıkama için, tüpü bir dakika boyunca bir mıknatısa yerleştirmeden önce boncukları bir mililitre TCM'de askıya alın ve süpernatanı aspire edin. Tüpü mıknatıstan çıkardıktan sonra, yıkanmış boncukları bir mililitre TCM içinde tekrar edin ve yıkamayı iki kez tekrarlayın. Yıkanmış boncukları T hücreleri kültürüne aktarmak için bir mililitre TCM'de yeniden askıya alın, daha sonra T hücresi boncuk süspansiyonunu TCM ile mililitre başına altıncı hücrelere 1.0 kat 10 ila 10 konsantrasyonda seyreltin ve altı kuyucuklu bir plakaya geçirilmiş bir doku kültürüne aktarın.Kuyu plakasını 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Lentivirüslerin transdüksiyonu ile ilerlemek için, donmuş lentivirüsleri kimerik antijen reseptörlerini veya sodyum-iyodür simporterini dört santigrat derecede kaplamada çözün. 24 ila 48 saatlik T hücresi stimülasyonundan sonra, kümeleri parçalamak için T hücrelerini karıştırın ve taze çözülmüş lentivirüsü hücrelere beş enfeksiyon çokluğunda ekleyin.Dönüştürülmüş T hücrelerini 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Kuluçkanın üç, dört ve beşinci günlerinde, dönüştürülmüş T hücrelerini sayın ve taze önceden ısıtılmış TCM ekleyerek hücre konsantrasyonunu mililitre başına 10 kat 10 ila altıncı hücrelere ayarlayın. Püromisin direnç genini taşıyan NIS dönüştürülmüş T hücreleri için, hücrelere üç, dört ve beşinci günlerde mililitre puromisin dihidroklorür başına bir mikrogram ile muamele edin.Altıncı günde, T hücresi kümelerini parçalayın ve plakayı bir dakika boyunca bir mıknatıs üzerine yerleştirerek dönüştürülmüş T hücrelerinden anti-CD3 / CD28 boncuklarını çıkarın. Daha sonra toplanan hücreleri, mililitre başına altıncı hücrelere 1.0 çarpı 10 ila 10 konsantrasyonda kültüre geri yerleştirin. 50.000 hücre içeren T-hücre kültürünün bir aliquotunu akış tamponu ile yıkayın ve hücreleri 50 mikrolitre akış tamponu ile yeniden askıya alın.CAR ekspresyonunu tespit etmek için, T hücrelerini bir mikrolitre keçi anti-fare antikoru ile boyayın. Ölü hücreleri dışlamak için, 0.3 mikrolitre LIVE / DEAD Aqua ekleyin. Lekeli hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin.15 dakika sonra, hücreleri dört santigrat derecede üç dakika boyunca 650 kez G'de 150 mikrolitre akış tamponu ile yıkayın. Lekeli hücreleri sabitlemek ve geçirgenleştirmek için, hücreleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 100 mikrolitre fiksasyon ortamı ile inkübe edin. Daha sonra hücreleri, saponin ve santrifüj gibi hücre geçirgenleştirici bir ajan içeren 100 mikrolitre tamponla iki kez yıkayın.Yıkadıktan sonra, geçirgenleştirilmiş hücreleri geçirgenleştirici bir tamponun 50 mikrolitresinde yeniden askıya alın. Daha sonra 0.3 nanogram anti-insan ETNL NIS antikoru ekleyin ve dört santigrat derecede inkübe edin. Bir saatlik inkübasyondan sonra, gösterildiği gibi 150 mikrolitre akış tamponu ve santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın.Daha sonra hücreleri, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 2.5 mikrolitre anti-tavşan sekonder antikoru içeren 50 mikrolitre akış tamponu ile inkübe edin. T hücrelerini gösterildiği gibi yıkadıktan sonra, akış sitometrisi yapmak için hücreleri 200 mikrolitre akış tamponunda yeniden askıya alın. Daha sonra hücrelerin transdüksiyon verimliliğini belirleyin.Sekizinci günde, T hücrelerini dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 300 kez G'de sayın ve döndürün, ardından hücre peletini mililitre başına altıncı hücrelere 10 kez 10 konsantrasyonda bir dondurucu ortamla yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun bir mililitresini, eksi 80 santigrat derece dondurucuda 48 saat boyunca saklamak için etiketli her kriyo şişesine aktarın. 48 saat sonra, T hücrelerini sıvı azota aktarın.NIS pozitif BCMA CAR T hücreleri enjekte edilen fareleri, fareleri tartarak ve metal kulak etiketlerini çıkararak PET/BT görüntüleme için hazırlayın. Daha sonra taze hazırlanmış F18 tetrafloroboratın 9.25 megabecquerel'ini kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla fareye intravenöz olarak enjekte edin. 45 dakikalık alım süresinden sonra, 15 dakika boyunca anestezi uygulanan bir farenin statik PET görüntülerini elde etmeye devam edin, ardından 360 derece dönüş ve 180 projeksiyon ile beş dakika boyunca BT görüntü alımı izleyin.Bu temsili analizde, iki virüsün T hücrelerine birlikte transdüksiyonu, hücrelerin% 90'ından fazlasının NIS pozitif olduğu NIS pozitif BCMA CAR T hücreleri üretti. T hücresi büyüme kinetiğinin sıfırdan sekiz güne kadar analizi, BCMA CAR ve NIS'in dahil edilmesinin, dönüştürülmemiş hücrelere kıyasla T hücresi genişlemesini önemli ölçüde etkilemediğini ortaya koymuştur. OPM-2'nin akış sitometrik analizinde, lentivirüs ile transdüklenen hücreler, puromisin ile tedavi üzerine GFP ekspresyonunu temsil etti.BCMA pozitif lusiferaz pozitif OPM-2 hücreleri alan fareler, OPM-2 hücrelerinin engraftmanını doğrulamak için biyolüminesans görüntülemeye tabi tutuldu. F18 tetrafloroborat uygulanan farenin PET görüntülemesinde çeşitli organlarda ve kemik iliğinde NIS pozitif BCMA CAR T-hücre dağılımı saptandı. Ek olarak, fareden toplanan kemik iliği hücreleri, OPM-2 hücrelerinin engraftmanını ve NIS pozitif BCMA CAR T hücrelerinin kemik iliğine verilmesini gösterdi.İnfüze edilmiş CAR T hücrelerinin yüksek kaliteli görüntülenmesi için, NIS CAR T hücresi üretim protokolünün adımlarını takip etmek ve çift NIS ve CAR pozitif fraksiyonlarının varlığını doğrulamak önemlidir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Canlı Görüntüleme taksan dirençli Meme Kanserlerinde Mikrotubul dinamik dengesizlik Eğitim için

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

18F-FDG PET/BT görüntüleme ve nicel Histoloji glikoz metabolizması akciğer kanserinin fare modellerinde dinamik değişiklikleri ölçmek için kullanmak

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Floresans moleküler tomografi Glioblastoma Xenografts in Vivo içinde görüntüleme için

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Multipl Miyelom kemik iliği Xenografts NOG farelerde Multimodal kollarındaki ve pozitronik emisyon tomografi/Hesaplamalı tomografi görüntüleme

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

İmal İmmünoterapi için İmkanerik Antijen Reseptör (CAR) T Hücreleri

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

Management of Respiratory Motion Artefacts in 18F-fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography using an Amplitude-Based Optimal Respiratory Gating Algorithm

Genlik Tabanlı Optimal Solunum Gating Algoritması Kullanılarak 18F-florrodeoksiglukoz Pozitron Emisyon Tomografisinde Solunum Hareket Etoburlarının Yönetimi

Positron emission tomography (PET) combined with X-ray computed tomography (CT) is an important molecular imaging platform that is required for accurate ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Positron Emission Tomography-based Dose Painting Radiation Therapy in a Glioblastoma Rat Model using the Small Animal Radiation Research Platform

Küçük Hayvan Radyasyonu Araştırma Platformu kullanılarak Glioblastoma Rat Modelinde Pozitron Emisyon Tomografi tabanlı Doz Boyama Radyasyon Tedavisi

A rat glioblastoma model to mimic chemo-radiation treatment of human glioblastoma in the clinic was previously established. Similar to the clinical ...