Name: strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition
Uploaded: 2021-03-19T15:00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition at JoVE.com

Reconhecemos o apoio da Unidade de Biologia Estrutural e Computacional e da Instalação do Núcleo de Microscopia eletrônica no Laboratório Europeu de Biologia Molecular em Heidelberg, Alemanha e do iNEXT-Discovery (número do projeto 871037). Somos extremamente gratos pelo excelente apoio do autor do pacote de software SerialEM, professor David Mastronarde. Agradecemos também a Herman Fung pela leitura crítica do manuscrito.

O protocolo descrito aqui faz parte de um documento mais abrangente produzido pela Plataforma de Serviços EMBL CryoEM que inclui instruções detalhadas passo a passo e capturas de tela ilustrando todo o procedimento de uma sessão crioET típica, incluindo carregamento de amostras, mapeamento de grade, ajuste de microscópio, configuração de pontos de aquisição e coleta automatizada de dados. O protocolo completo pode ser baixado no seguinte link: https://oc.embl.de/index.php/s/9OuTl8AazDkCNq0/download
1. Pré-requisitos
<ol><li>Instale a versão SerialEM 3.8 e configure-se para controlar o microscópio e o detector (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/betaHlp/html/setting_up_serialem.htm).</li>
	<li>Instale uma instância falsa do SerialEMversion 3.8 (https://sphinx-emdocs.readthedocs.io/en/latest/serialEM-note-setup-dummy.html).</li>
	<li>Instalar o PyEM (https://git.embl.de/schorb/pyem).</li>
</ol>2. Mapeamento de grade
<ol><li>Carregue um com grades no carregador automático do microscópio.</li>
	<li>Configure condições de imagem adequadas para mapear toda a grade. Faça isso na menor ampliação possível levando em conta o campo de visão no detector utilizado (EFTEM SA 2250x). Salve as condições de imagem como um Estado de Imagem SerialEM para tornar as coisas convenientes para uso posterior.</li>
	<li>Configurar montagem completa<ol>
<li>Abra o menu SerialEM Navigator. </li>
		<li>Selecione Montaging & Grids.</li>
		<li>Selecione Configurar a montagem completa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inicie o Grid_Mappingdo roteiro . Deixe que o script espere o carregador automático esfriar; fazer um inventário e, em seguida, mapear cada grade que o procedimento de inventário encontrou. Insira um e-mail através do Menu série Tilt para permitir que o script envie convenientemente um e-mail quando feito.</li>
	<li>Salve o Navegador.</li>
	<li>Inspecione todos os mapas de grade do SerialEM Navigator e escolha qual grade mapear mais a uma ampliação mais alta. NOTA: Muitos TEMs equipados com um sistema de autocarregador mostrarão uma rotação da grade quando recarregados. É melhor remapear qualquer rede depois de recarregá-la. Sistemas alternativos geralmente sofrem apenas alguns turnos, que podem ser corrigidos no SerialEM com um procedimento Shift To Marker.</li>
</ol>3. Configure a dose baixa serialem
<ol><li>Defina a ampliação dos modos SerialEM de baixa dose Exibir e Visualizar (isso é necessário para a etapa 6).</li>
	<li>Adquira uma imagem de exibição e salve-a como um mapa no Navegador.</li>
	<li>Adquira uma imagem de visualização e salve-a como um mapa no Navegador.<ol>
<li>Defina ambos os modos para o mesmo binning (binning 4 é sugerido). Isso permite salvar os dois mapas em uma pilha de imagens.</li>
		<li>Na janela SerialEM Navigator, altere o rótulo do mapa Exibir para Exibir e o rótulo do mapa de visualização para visualização.</li>
		<li>Salve e feche o arquivo do navegador. NOTA: Nenhum alvo é necessário para as imagens iniciais De exibição e visualização, o PyEM usará apenas suas configurações de imagem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Mapeamento quadrado da grade
<ol><li>Configure as condições de imagem para mapear quadrados de grade. É de grande importância poder ver a amostra de interesse e a distribuição fiduciária de contas. Para garantir o contraste ideal para mapas quadrados de grade, execute as seguintes etapas.<ol>
<li>Insira uma abertura objetiva.</li>
		<li>Se for o caso, insira a fenda do filtro de energia.</li>
		<li>Use um desfoco de -100 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tela para bons quadrados de grade adequados para um mapeamento posterior. Após inspeção visual dos quadrados do mapa da grade, faça imagens de teste do quadrado com as condições de imagem a serem usadas para mapas quadrados de grade.</li>
	<li>Quando um bom quadrado for identificado, marque seu centro na imagem do mapa de grade usando o recurso Add Points do SerialEM Navigator.</li>
	<li>Uma vez que todos os pontos são adicionados, no SerialEM Navigator pressione Shift + A no primeiro ponto, em seguida, pressione Shift + A no último ponto. NOTA: Todos os pontos adicionados são agora marcados por um A, o que significa que são todos Pontos de Aquisição.</li>
	<li>Pressione Shift + N (crie um novo arquivo no item) no primeiro ponto e, em seguida, novamente no último ponto. Na caixa de diálogo que aparece, selecione Imagens Em montagem.</li>
	<li>Quando o diálogo de montagem aparecer, configure um tamanho de montagem que cubra um quadrado de grade. Isso depende da ampliação e do tamanho da malha das grades utilizadas e normalmente requer montagens de 2 x 2 a 4 x 4. Dê-lhe um nome com um número (por exemplo, squaremap_01.mrc) para permitir que o SerialEM tenha um número automático conveniente de todos os arquivos por grade quadrada.</li>
	<li>Inicie o mapeamento da grade abrindo o menu SerialEM Navigator e clique em Adquirir itens.</li>
	<li>No menu pop-up, selecione as seguintes opções.<ol>
<li>Selecione Eucentricidade áspera.</li>
		<li>Selecione Adquirir imagem do mapa.</li>
		<li>Selecione válvulas de coluna de fechamento no final.</li>
		<li>Selecione Enviar e-mail no final.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Selecionar os alvos
<ol><li>Abra uma instância serialem falsa. Isso pode ser configurado no SerialEM PC que controla o microscópio ou em um PC diferente (suporte) se ambos os computadores compartilharem uma conexão de rede.</li>
	<li>Uma vez que o primeiro quadrado de grade seja mapeado, use a opção de menu SerialEM Navigator Mesclar para ver a montagem na instância serialem falsa.</li>
	<li>Clique duas vezes na janela Do Navegador para abrir o mapa quadrado da grade.</li>
	<li>Pesquise o mapa e use a opção serialem navigator manequim Adicionar pontos para adicionar pontos de aquisição de imagem no alvo de interesse.</li>
	<li>Quando terminar e depois de mapear os novos quadrados, salve o arquivo Navigator e mescle novamente o Navegador; continuar até que todos os quadrados de grade sejam mapeados.</li>
</ol>6. Gere mapas virtuais
<ol><li>Mais uma vez, mescla o arquivo do navegador com a instância serialEM falsa.</li>
	<li>Execute o script de mapas virtuais pyem a partir do menu SerialEM falso, ferramentas e selecione Mapas de Âncora Virtual. Isso pode levar algum tempo dependendo do tamanho e quantidade dos mapas quadrados da grade e do binning dos mapas View e Preview. NOTA: O PyEM inicia uma janela de comando que fecha automaticamente quando feita, e o novo arquivo do navegador pode ser aberto. De acordo com o mapa em montagem que contém pontos selecionados, o PyEM escreve um único mapa mesclado e todos os seus mapas View e Preview. Finalmente, ele grava um novo arquivo Navigator chamado <navegador>_automaps.nav.</li>
</ol>7. Ajuste de microscópio
<ol><li>Verifique o ajuste do microscópio. Para garantir o bom desempenho do microscópio, use a mesma configuração de ampliação e tamanho do feixe para aquisição de dados, na seguinte ordem.<ol>
<li>Executar o alinhamento sem coma do SeriaLEM pelo CTF (quadro Zemlin).</li>
		<li>Insira e centrale uma abertura objetiva.</li>
		<li>Execute serialem correct astigmatism por CTF (auto-estigmas).</li>
		<li>Execute GIF Quick Tune (ou seja, apenas foco de fenda). NOTA: Como as etapas 7.1.1, 7.1.3 e 7.1.4 podem exigir mais taxa de dose, apenas o tamanho da mancha deve ser alterado; o tamanho do feixe não deve ser alterado, pois isso causa inclinação do feixe, o que torna as afinações incorretas. As etapas 7.1.1, 7.1.2 e 7.1.3 são semi-automatizadas neste script disponível publicamente (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Configurar navegador
<ol><li>Em SerialEM, abra o novo arquivo navegador chamado <navigatorfilename>_automaps.nav. NOTA: V_yyyy são os mapas de exibição e P_yyyy são os mapas de visualização. Os mapas de visualização são definidos como Pontos de Aquisição.</li>
	<li>Na janela SerialEM Navigator, desmarque todos os pontos A, selecione o primeiro mapa V_yyyy, selecione Colapso,clique em A duas vezes e desmarque o Colapso.</li>
	<li>Selecione a primeira posição V_yyyy, pressione Shift + T, em seguida, selecione a última posição V_yyyy e pressione Shift + T novamente.</li>
	<li>Escolha imagens de quadro único nas propriedades do arquivo para abrir a caixa de diálogo.</li>
	<li>Na próxima caixa de diálogo Propriedades de Arquivo, selecione os parâmetros desejados de acordo com as necessidades de imagem e a configuração do instrumento.</li>
	<li>Quando solicitado, dê um nome com um número (por exemplo, TS_001.mrc) e clique em Salvar. NOTA: SerialEM numerará automaticamente os nomes dos arquivos para todas as séries de inclinação.</li>
	<li>Configure o controlador da série de inclinação para a primeira posição TS. Quando terminar, clique em OK para definir esses parâmetros para todas as séries de inclinação após este item de aquisição. Todos os mapas de visualização são agora selecionados como TS (Tilt Series) com nome de arquivo numerado TS_xxx.mrc. NOTA: Pode-se alterar os parâmetros manualmente mais tarde usando o recurso Navigator TSparams; alterações serão aplicadas para todos os itens para baixo na lista. O usuário tem a opção de executar um script personalizado em vez da série de inclinação.</li>
</ol>9. Definir as posições de foco/faixa
<ol><li>Defina a distância de foco/faixa para cada destino, se necessário (certifique-se de que a Dose Baixa serialem está ligada).</li>
	<li>Clique duas vezes no Mapa de exibição para carregá-lo.</li>
	<li>Selecione o Mapa de Visualização na lista Navegador.</li>
	<li>Selecione Editar foco na janela Navegador.</li>
	<li>No painel Controle de Baixa Dose, desmarque o eixo inter-área para posicionar o ensaio e o foco ao longo do eixo de inclinação do estágio.</li>
	<li>Clique na região desejada no mapa de exibição carregado para definir a posição de foco/teste para esta série de inclinação.</li>
	<li>Certifique-se de que o item Navegador tenha conjunto TSP agora; repetir o procedimento para todos os itens. NOTA: As posições de foco/faixa são copiadas automaticamente para baixo no Navegador. Portanto, se a posição de foco/faixa para o item anterior estiver no lado correto e na distância correta, não há necessidade de alterá-la para o item atual.</li>
</ol>10. Configure scripts adicionais
<ol><li>Dois scripts lidam com a linha Focus: pretomo e duringtomo. O script pretomo é executado antes de cada série de inclinação e o script durante cada inclinação.</li>
	<li>Edite o intervalo de foco no script pretomo.</li>
	<li>No menu SerialEM Tilt Series, verifique executar script em TS e selecione o número de script do script duringtomo. </li>
</ol>11. Corra
<ol><li>Verifique o nível do tanque de nitrogênio.</li>
	<li>Verifique se o Turbo off do Autoloader está selecionado.</li>
	<li>Verifique o espaço livre de armazenamento de dados.</li>
	<li>No menu de arquivos SerialEM, desmarque a poupança contínua para o arquivo log e feche qualquer arquivo de log aberto no momento. Cada série de inclinação terá seu próprio arquivo de registro.</li>
	<li>No menu Navegador, clique em Adquirir em Itens.</li>
	<li>Execute o script PreTomo.</li>
	<li>Selecione Tarefa primária Adquirir série de inclinação.</li>
	<li>Selecione Executar script após PostTomo.</li>
	<li>Selecione Fechar válvulas de coluna no final.</li>
	<li>Selecione Enviar e-mail no final.</li>
	<li>Clique em GO. NOTA: O SerialEM enviará um e-mail por série de inclinação, seja bem sucedido ou por engano; erro pode, no entanto, também significar que o alcance total de inclinação não foi atingido.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+viruses.">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM-How+did+it+get+here+and+where+will+it+go.">Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go.</a> Science. 361 (6405), 876-880 (2018).</li><li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+by+electron+tomography:+From+Cells+to+Molecules.">Structural studies by electron tomography: From Cells to Molecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 833-865 (2005).</li><li>Pfeffer, S., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+molecular+complexity+in+structural+cell+biology.">Unravelling molecular complexity in structural cell biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 52, 111-118 (2018).</li><li>Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+high-resolution+in+situ+structural+biology+with+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).</li><li>Bohning, J., Bharat, T. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high-throughput+in+situ+structural+biology+using+electron+cryotomography.">Towards high-throughput in situ structural biology using electron cryotomography.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. , (2020).</li><li>Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging.">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Wan, W., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).</li><li>Tan, Y. Z., Cheng, A., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+data+collection+in+single+particle+electron+microscopy.">Automated data collection in single particle electron microscopy.</a> Microscopy. 65 (1), 43-56 (2016).</li><li>Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Tomoauto:+A+protocol+for+high-throughput+automated+cryo-electron+tomography.">Using Tomoauto: A protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (107), e53608 (2016).</li><li>Resch, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 152, 135-178 (2019).</li><li>Bharat, T. A., Kukulski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Correlative Imaging: Focusing on the Future. , 137-153 (2019).</li><li>Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+cryo-electron+tomography+tilt-scheme+optimized+for+high+resolution+subtomogram+averaging.">Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).</li><li>O'Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, R. J., Mastronarde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16, 471-477 (2019).</li><li>Turonova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+tomographic+acquisition+schemes+for+high-resolution+structural+biology.">Benchmarking tomographic acquisition schemes for high-resolution structural biology.</a> Nature Communications. 11 (1), 876 (2020).</li><li>Chreifi, G., Chen, S., Metskas, L. A., Kaplan, M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tilt-series+acquisition+for+electron+cryotomography.">Rapid tilt-series acquisition for electron cryotomography.</a> Journal of Structural Biology. 205 (2), 163-169 (2019).</li><li>Eisenstein, F., Danev, R., Pilhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+applicability+and+robustness+of+fast+cryo-electron+tomography+data+acquisition.">Improved applicability and robustness of fast cryo-electron tomography data acquisition.</a> Journal of Structural Biology. 208 (2), 107-114 (2019).</li><li>Turonova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+structural+analysis+of+SARS-CoV-2+spike+reveals+flexibility+mediated+by+three+hinges.">In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges.</a> Science. 370 (6513), 203-208 (2020).</li><li>O'Reilly, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-cell+architecture+of+an+actively+transcribing-translating+expressome.">In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome.</a> Science. 369 (6503), 554-557 (2020).</li><li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.7+&#197;+inside+cells.">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.7 &#197; inside cells.</a> Nature Methods. 18, 186-193 (2020).</li><li>Karuppasamy, M., Karimi Nejadasl, F., Vulovic, M., Koster, A. J., Ravelli, R. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+in+single-particle+cryo-electron+microscopy:+effects+of+dose+and+dose+rate.">Radiation damage in single-particle cryo-electron microscopy: effects of dose and dose rate.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 18 (3), 398-412 (2011).</li><li>Liberta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+fibril+structures+from+systemic+AA+amyloidosis+reveal+the+species+complementarity+of+pathological+amyloids.">Cryo-EM fibril structures from systemic AA amyloidosis reveal the species complementarity of pathological amyloids.</a> Nature Communications. 10 (1), 1104 (2019).</li><li>Radamaker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+light+chain-derived+amyloid+fibril+from+a+patient+with+systemic+AL+amyloidosis.">Cryo-EM structure of a light chain-derived amyloid fibril from a patient with systemic AL amyloidosis.</a> Nature Communications. 10 (1), 1103 (2019).</li></ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

A partir de uma técnica de nicho, a crioET amadureceu agora em um método generalizado para realizar estudos estruturais em nível celular e molecular com resolução alcançável sem precedentes21,22. A crescente demanda por imagens crioEM tem pressionado os recursos limitados disponíveis para acessar essa tecnologia. Apesar da abertura de uma série de instalações nacionais de crioEM e dos esforços dos institutos científicos para aumentar sua capacidade tem para apoiar as necessidades da comunidade em todo o mundo, o acesso aos instrumentos crioem ainda é limitado e o tempo disponível para coleta de dados deve, portanto, ser utilizado eficientemente pelos usuários para maximizar o rendimento de cada sessão de microscopia. A necessidade de adquirir centenas de séries de inclinação combinadas com o tempo limitado disponível para coleta de dados exigiu novas rotinas de aquisição de imagens para obter melhor throughput sem comprometer a qualidade dos dados. Os recentes desenvolvimentos nos fluxos de trabalho de hardware e imagem aumentaram consideravelmente a velocidade de aquisição da série tilt18,19, resultando em uma mudança dramática da relação entre o tempo gasto para configurar um ponto de aquisição e o tempo necessário para a aquisição da série tilt real. Ao todo, o procedimento para a criação de pontos de aquisição está se tornando um dos principais gargalos para o rendimento alcançável das sessões de crioET.
O protocolo otimizado aqui apresentado nos permitiu configurar, no modo off-line, 171 posições para aquisição tomográfica automatizada no primeiro dia de uma sessão crioteco enquanto o microscópio estava ativamente envolvido em outras operações (por exemplo, mapeamento quadrado, ajuste e aquisição automatizada de séries de inclinação), sem afetar o tempo de microscópio disponível para coleta de dados. Além de maximizar o throughput de uma sessão crioET, esse pipeline reduz drasticamente o tempo investido pelo usuário na fase preparatória de uma sessão automatizada de coleta de dados. No protocolo descrito, o usuário é solicitado a navegar nos quadrados de grade mapeadas para identificar regiões de interesse adequadas e adicioná-las ao Serial EM Navigator como pontos de aquisição. Todos os alvos serão processados automaticamente em lote dentro do SerialEM pela ferramenta PyEM para a produção dos mapas virtuais16. A abordagem computacional apresentada é, portanto, consideravelmente mais rápida do que a aquisição de mapas de ancoragem reais, eliminando os períodos de espera associados ao movimento do palco, aquisição de imagens, mudança das condições de imagem entre View e Preview, e pela eventual reiteração dessas etapas enquanto centralização em alta ampliação. Além disso, como cada imagem adquirida leva ao acúmulo de dose de elétrons no objeto de interesse23, o uso de mapas virtuais para o realinhamento dos alvos reduz o dano de radiação introduzido na fase preparatória de uma sessão crioequito antes da aquisição da série de inclinação real. O protocolo descrito aqui faz uso de mapas virtuais intermediários e de alta ampliação (Preview e View, respectivamente) para realinhamento do alvo antes da aquisição da série tilt. Este procedimento pode ser facilmente modificado para usar apenas a imagem de ampliação intermediária quando a precisão do alinhamento é de menor importância, por exemplo, no caso de grandes estruturas onde a precisão final do alvo é menos preocupante10 ou para amostras de análise de partículas únicas que são mal espalhadas na crio-grade que requerem a seleção manual do usuário de cada ponto de aquisição24, 25. Finalmente, uma abordagem baseada no uso off-line de uma instância serialem falsa também facilita a configuração de pontos de aquisição por meio de conexão remota, minimizando a necessidade da presença física do usuário no microscópio, permitindo assim mais flexibilidade em termos de organização operacional da instalação.
Os recentes avanços tecnológicos e métodos para crioET melhoraram drasticamente a velocidade e a confiabilidade das sessões automatizadas de coleta de dados. No entanto, outros desenvolvimentos são necessários para abordar as etapas de limitação de taxas restantes deste método. Mais notavelmente, a etapa inicial do mapeamento da grade e do quadrado está se tornando um dos principais gargalos da configuração da sessão, gerando assim a necessidade de melhorias de hardware visando aumentar a velocidade dos movimentos do estágio do microscópio e da aquisição de imagens pelos detectores de elétrons diretos. Além disso, o desenvolvimento de abordagens de machine learning para automatizar totalmente o processo de identificação de destino será crucial para eliminar a necessidade de inspeção visual dos usuários para a seleção das regiões de interesse, um procedimento demorado que conta com a expertise dos usuários.

Os métodos de microscopia eletrônica criogênica (crioEM) baseiam-se na imagem de amostras biológicas por meio de um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) após sua rápida vitrificação, um processo de preparação amostral que preserva as estruturas moleculares e celulares dos espécimes em estado próximo ao nativo e hidratado1,2. Na tomografia eletrônica criogênica (crioET) um modelo 3D da amostra vitrificada é alcançado através da aquisição de uma série de imagens da mesma região de interesse de diferentes orientações, a chamada série inclinação, seguida pela reconstrução computacional do volume tomográfico3. Esta técnica avançada de imagem amadureceu em um poderoso método de investigação estrutural de processos biológicos no contexto de seus ambientes celulares nativos4,5,6.
Além da análise ultraestrutural da amostra vitrificada, reconstruções de alta resolução de complexos macromoleculares presentes em múltiplas cópias dentro do volume tomográfico podem ser obtidas aplicando subtomograma em média5. Esta abordagem de reconstrução baseia-se no alinhamento iterativo e na média de suba volumes contendo a estrutura de interesse e visa aumentar a relação sinal-ruído e a resolução da reconstrução final7,8. A média do subtomograma depende da coleta e processamento de uma grande quantidade de dados que muitas vezes exige a aquisição de centenas de séries de inclinação por meio de TEMs high-end com custos operacionais onerosos.
Atualmente, a configuração dessas sessões crioET automatizadas é um processo demorado que geralmente depende da entrada manual do usuário9,10,11. Normalmente, os alvos são identificados por inspeção visual da grade mapeada e, posteriormente, configurados para coleta automatizada de dados. A eficiência do usuário na identificação de pontos de aquisição é frequentemente afetada pela natureza da amostra, tornando-se particularmente desafiadora ao analisar macromoléculas purificadas com concentração subótima ou no caso de eventos raros em ambientes celulares lotados, implicando o uso de abordagens correlativas12. Além disso, os fluxos de trabalho atuais exigem a aquisição de imagens durante a configuração em várias ampliações que serão posteriormente utilizadas para localização precisa e centralização da meta durante a aquisição automatizada11,13,14. Essas etapas de re-alinhamento de alta precisão são cruciais para aplicações de alta resolução, que exigem que a imagem seja realizada em alta ampliação e requerem etapas precisas de centralização para manter a região de interesse dentro do pequeno campo de visão resultante. Ao todo, várias horas de cada sessão de coleta de dados são comprometidas para este procedimento demorado durante o qual o TEM não está envolvido na aquisição da série tilt. Portanto, dependendo da quantidade de séries de inclinação necessárias, a identificação e configuração dos pontos de aquisição pode ter um impacto considerável no tempo de microscópio disponível para coleta de dados durante uma sessão crioet.
Descrito aqui é um protocolo otimizado baseado no pacote de software SerialEM15 e na versão mais recente do software PyEM16 para mapear grades, quadrados de grade de mapa, selecionar alvos e configurar aquisição automatizada de dados para coleta de séries de inclinação em larga escala. O conceito-chave dessa abordagem é fornecer ao SerialEM imagens geradas computacionalmente pela PyEM para cada item de aquisição, denominados mapas virtuais, para a localização precisa e o centro do alvo. Para ganhar tempo real de aquisição, a seleção dos alvos, bem como a criação dos mapas virtuais são realizadas off-line usando uma segunda instância fictícia do SerialEM, desacoscando o processo de seleção de metas de aquisição de operações TEM. Embora não abordando como aumentar a qualidade dos dados13,17 ou a velocidade de aquisição da série tilt18,19, este protocolo é focado principalmente em estratégias para otimizar a eficiência de tempo da configuração de sessões crioET automatizadas em larga escala. Portanto, a implementação do protocolo apresentado destina-se àqueles cientistas que estabelecem fluxos de trabalho de coleta de dados crioET que desejam maximizar o rendimento da aquisição automatizada de dados, aumentando o tempo de microscópio disponível para aquisição da série tilt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition

A tomografia eletrônica criogênica (crioET) é um método poderoso para estudar a estrutura 3D de amostras biológicas em um estado próximo ao nativo. O crioET de última geração atual combinado com a análise de média do subtomograma permite a determinação estrutural de alta resolução de complexos macromoleculares presentes em múltiplas cópias dentro de reconstruções tomográficas. Experimentos tomográficos geralmente requerem uma grande quantidade de séries de inclinação para serem adquiridas por meio de microscópios eletrônicos de transmissão high-end com importantes custos operacionais de execução. Embora o throughput e a confiabilidade das rotinas automatizadas de aquisição de dados tenham melhorado constantemente nos últimos anos, o processo de seleção de regiões de interesse nas quais uma série de inclinação será adquirida não pode ser facilmente automatizado e ainda depende da entrada manual do usuário. Portanto, a configuração de uma sessão de coleta de dados em larga escala é um procedimento demorado que pode reduzir consideravelmente o tempo restante do microscópio disponível para aquisição da série tilt. Aqui, o protocolo descreve as implementações recentemente desenvolvidas com base no pacote SerialEM e no software PyEM que melhoram significativamente a eficiência do tempo de triagem da grade e a coleta de dados de séries de inclinação em larga escala. O protocolo apresentado ilustra como usar funcionalidades de scripting serialem para automatizar totalmente o mapeamento da grade, o mapeamento quadrado da grade e a aquisição de séries de inclinação. Além disso, o protocolo descreve como usar o PyEM para selecionar alvos adicionais de aquisição no modo off-line após o início da coleta automatizada de dados. Para ilustrar este protocolo, sua aplicação no contexto da coleta de dados high-end da série de inclinação Sars-Cov-2 é descrita. O pipeline apresentado é particularmente adequado para maximizar a eficiência temporal dos experimentos de tomografia que requerem uma seleção cuidadosa de metas de aquisição e, ao mesmo tempo, uma grande quantidade de séries de inclinação a serem coletadas.

Este procedimento foi utilizado para a aquisição da série de inclinação Sars-Cov-2 descrita em Turonova et al.2020 20; todo o conjunto de dados foi produzido usando três grades distintas ao longo de três sessões de microscopia na EMBL Heidelberg. O estudo atual se concentrará e descreverá a primeira sessão de 3 dias (~72 h) com a primeira grade.
Após toda a grade ser mapeada em baixa ampliação (~10 min, ver etapa 2), foram selecionados 71 quadrados adequados no mapa da grade, e mapas médios de ampliação(mapas quadrados)foram adquiridos com configurações (ampliação, exposição, desfoco) que permitem a visualização direta e identificação da amostra de interesse, coronavírus neste caso (ver etapa 4) (Figura 1A). O tempo de aquisição foi de ~3 min por quadrado, 3 h 45 min no total.
Assim que o primeiro mapa quadrado foi criado, uma instância serialEM falsa (sem qualquer controle na câmera ou microscópio) foi aberta em um computador separado para visualizar o mapa quadrado e adicionar pontos em alvos adequados para aquisição de séries de inclinação (ver passo 5) (Figura 1B). Mapas quadrados recém-adquiridos foram recuperados mesclando o navegador SerialEM falso atual com o navegador da instância SerialEM adquirida. Após ~2h de aquisição e seleção quadrada de grade, 50 alvos iniciais poderiam ser identificados.
Após o término das aquisições do mapa quadrado, a dose baixa do SerialEM foi configurada e as imagens de exibição e visualização de referência foram tiradas e salvas como mapas (ver passo 3). Estes últimos mapas poderiam então ser usados imediatamente na instância serialem falsa para gerar, a partir das imagens correspondentes do mapa quadrado, os mapas Virtual View (Figura 1C) e Visualização Virtual (Figura 1D) dos 50 alvos selecionados com o pacote de software PyEM, para um tempo de processamento de ~30 min (ver etapa 6). Esse tempo de processamento na sessão serialem falsa foi usado para realizar os preparativos finais do microscópio para aquisição: ajuste de filtro de energia, nova aquisição de imagem de referência, alinhamento astigmatismo e sem coma da lente objetiva.
Uma vez que a sintonia do microscópio foi concluída e mapas virtuais dos 50 alvos iniciais gerados, o navegador SerialEM real a ser usado para aquisição foi configurado (ver passo 8), posições de foco e faixa foram definidas (passo 9) e a aquisição da série tilt poderia ser iniciada (ver etapas 10 e 11). Os mapas de visualização virtual (Figura 1C) foram utilizados para um centro inicial do alvo (Figura 1E) seguido de um centro final realizado na ampliação real da série tilt(Figura 1F) utilizando o mapa de visualização virtual ( Figura1D).
Começando com o mapeamento da grade às 9:30 da manhã, a aquisição da série de inclinação para os 50 alvos iniciais começou por volta das 15:00. Com as configurações usadas para aquisição tomográfica (veja a referência para detalhes), uma série de inclinação levou ~20 minutos para adquirir, com alvos suficientes para correr a noite inteira. Enquanto a aquisição estava sendo realizada, o resto dos mapas quadrados poderiam ser inspecionados e mais alvos adicionados, ainda off-line através da instância serialem falsa. Mais 121 alvos foram selecionados entre os mapas quadrados restantes e adicionados à aquisição do navegador SerialEM após a criação de mapas virtuais para esses novos alvos, o suficiente para serem executados até a conclusão da sessão de 72 h.
Este procedimento (resumido na Figura 2) permitiu, em um único dia útil, a instalação de 171 metas para aquisições tomográficas automatizadas para uma sessão de microscópio de 72 horas (3 dias).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62383/62383fig01.jpg"> Figura 1: Exemplo de mapa quadrado com mapas virtuais representativos e aquisições correspondentes após o centro. (A) Mapa quadrado representativo de uma grade crioEM Sars-Cov-2 usada em Turonova et al.20. Quatro regiões de interesse estão marcadas com uma cruz vermelha. A ampliação do microscópio é de 2.250x. (B) Crop out of the square map destacando as áreas que foram usadas para gerar os mapas Virtual View (laranja) e Virtual Preview (amarelo) para o mapa de mira selecionada (cruz vermelha) (C) Visualização Virtual. (D) Mapa de visualização virtual. (E) A aquisição do Actual View após o centralizar usando o mapa Virtual View como referência. A ampliação do microscópio é de 11.500x. (F) aquisição de inclinação de 0° da série de inclinação após o centro usando o mapa Visualização Virtual como referência. A ampliação do microscópio é de 64.000x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62383/62383fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62383/62383fig02.jpg"> Figura 2: Fluxo de trabalho de sessão CryoET usando o SerialEM com as ferramentas PyEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62383/62383fig02large.jpg" target="_blank">figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition at JoVE.com

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

A crescente demanda por coleta de dados em larga escala na tomografia criogênica de elétrons requer rotinas de aquisição de imagens de alto rendimento. Descrito aqui é um protocolo que implementa os recentes desenvolvimentos de estratégias avançadas de aquisição que visam maximizar o tempo-eficiência e o throughput da coleta de dados tomográficos.

Estratégias de Otimização da Aquisição de Dados de Tomografia Eletrônica Criogênica

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

A configuração de uma sessão de coleta de dados em larga escala é um procedimento demorado que pode reduzir consideravelmente o tempo restante do microscópio disponível para aquisição da série tilt. Este método permite a configuração rápida da aquisição automatizada de dados de tomografia em larga escala para maximizar a eficiência de tempo dos experimentos de tomografia que requerem uma seleção cuidadosa de metas de aquisição. Comece abrindo uma instância serialem falsa.Uma vez mapeado o primeiro quadrado de grade, use a opção de menu do navegador SerialEM para ver a montagem na instância serialEM falsa. Clique duas vezes na janela do navegador para abrir o mapa quadrado da grade. Pesquise o mapa e use a opção de navegador SerialEM falsa adicionar pontos para adicionar pontos de aquisição de imagem no alvo de interesse.Depois de mapear os novos quadrados, salve o arquivo do navegador e mescle novamente o navegador. Continue até que todos os quadrados da grade sejam mapeados. Novamente, mescla o arquivo do navegador com a instância serialEM falsa.Execute o script de mapas virtuais Pi EM a partir do menu SerialEM falso. Selecione ferramentas e selecione mapas de âncora virtual. Isso pode levar algum tempo dependendo do tamanho e quantidade dos mapas quadrados da grade, bem como do binning dos mapas de exibição e visualização.Para garantir o bom desempenho do microscópio, use a mesma configuração de ampliação e tamanho do feixe para aquisição de dados na seguinte ordem. Execute o alinhamento sem coma serialem pelo CTF. Insira e centrale uma abertura objetiva.Execute serialem astigmatismo correto por CTF e GIF quick tune. Em SerialEM, abra o novo arquivo do navegador. Deses selecione todos os pontos A.Selecione os mapas de primeira exibição. Selecione o colapso. Clique em Um colapso duas vezes e dese selecione.Selecione a posição do mapa de visualização da primeira. Pressione Shift T e selecione a última posição do mapa de exibição e pressione Shift T novamente. Escolha imagens de quadro único nas propriedades do arquivo para abrir uma caixa de diálogo.Na próxima caixa de diálogo de propriedades do arquivo, selecione os parâmetros desejados de acordo com as necessidades de imagem e a configuração do instrumento. Quando solicitado, dê um nome com um número e clique em salvar. Configure o controlador da série de inclinação para a primeira posição TS.Quando terminar, clique em OK para definir esses parâmetros para todas as séries de inclinação após este item de aquisição. Todos os mapas de visualização são agora selecionados como TS com um nome de arquivo numerado. Se necessário, defina a distância de foco/faixa para cada alvo.Clique duas vezes no mapa de exibição para carregá-lo. Selecione o mapa de visualização na lista do navegador. Em seguida, selecione editar foco na janela do navegador.No painel de controle de baixa dose, dese selecione girar o eixo inter-área para posicionar o ensaio e focar ao longo do eixo de inclinação do estágio. Clique na região desejada no mapa de exibição carregado para definir a posição de teste de foco para esta série de inclinação e garantir que o item do navegador tenha conjunto TSP. Repita o procedimento para todos os itens.Edite o intervalo de foco no script PreTomo que é executado antes de cada série de inclinação. No menu da série de inclinação SerialEM, verifique o script de execução em TS e selecione o número de script do script DuringTomo durante cada inclinação. Verifique o nível do tanque de nitrogênio e se o turbo-off do carregador automático está selecionado.Verifique o espaço livre de armazenamento de dados. No menu de arquivos SerialEM, dese selecione a economia contínua para o arquivo log. Cada série de inclinação terá seu próprio arquivo de registro.Depois de clicar em adquirir em itens no menu de navegação, execute o script PreTomo. Selecione a tarefa principal de adquirir séries de inclinação e selecione executar script após PostTomo. Selecione válvulas de coluna fechada no final e envie e-mail no final e clique em ir.Foram selecionados 71 quadrados adequados no mapa da grade na ampliação inferior. Foram adquiridos mapas médios de ampliação com configurações que permitem a visualização direta e identificação da amostra de interesse, coronavírus neste caso. O tempo de aquisição foi de três minutos por quadrado, três horas e 45 minutos no total.À medida que o primeiro mapa quadrado foi criado, uma instância serialEM falsa foi aberta em um computador separado para visualizar o mapa quadrado e adicionar pontos em alvos adequados para aquisição de séries de inclinação. A dose baixa serialEM foi configurada e imagens de visualização e visualização de referência foram tiradas e salvas como mapas. Estes últimos mapas poderiam então ser usados imediatamente na instância serialEM falsa para gerar a visualização virtual e a visualização virtual a partir das imagens correspondentes do mapa quadrado.Os mapas de visualização virtual foram usados para um centro inicial do alvo, seguido por um centro final realizado na ampliação real da série tilt usando o mapa de visualização virtual. Os usuários devem se dar muito tempo para explorar a paisagem da amostra. Depois de ter pesquisado alguns mapas, desenvolve-se uma melhor sensação de áreas de boa qualidade para coletar dados.

Research

JoVE Journal

Biology

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Do-It-Yourself Dispositivo de Recuperação de amostras criopreservadas cair acidentalmente em Tanques de armazenamento criogênico

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Biologia

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

Reação em Cadeia da Polimerase: Protocolo Basic Plus Estratégias de solução de problemas e otimização

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Visualização da ATP sintase Dimers na mitocôndria por Electron Cryo-tomografia

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Preparação e observação de amostras biológicas Grosso por Scanning Transmission Electron Tomografia

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Procedimento e estratégias de otimização de chave para um método automatizado capilar imunoensaio eletroforética com base em

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D ultraestrutura mitocondrial do músculo de voo indirecto Drosophila revelada pela série-seção elétron Tomography

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualização de compactação do DNA em cianobactérias por tomografia computadorizada de alta tensão Cryo-elétron

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Quantificação de Estoicometria de Acetilação e Succinilação de Lisinas Proteicas em Sítios Específicos Usando Espectrometria de Massa de Aquisição de Dados Independente

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

Otimização do Crescimento de Cristal para Cristalização Macromolecular de Nêutrons

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Fluxo de trabalho de tomografia de array para a aquisição direcionada de informações de volume usando microscopia eletrônica de varredura

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...