Name: strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition
Uploaded: 2021-03-19T15:00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition at JoVE.com

Мы признаем поддержку со стороны Отдела структурной и вычислительной биологии и Центра электронной микроскопии в Европейской лаборатории молекулярной биологии в Гейдельберге, Германия, и iNEXT-Discovery (номер проекта 871037). Мы чрезвычайно благодарны за отличную поддержку автору программного пакета SerialEM, профессору Дэвиду Мастронарде. Мы также благодарим Германа Фунга за критическое прочтение рукописи.

<ol>
	<li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+viruses.">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM-How+did+it+get+here+and+where+will+it+go.">Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go.</a> Science. 361 (6405), 876-880 (2018).</li><li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+by+electron+tomography:+From+Cells+to+Molecules.">Structural studies by electron tomography: From Cells to Molecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 833-865 (2005).</li><li>Pfeffer, S., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+molecular+complexity+in+structural+cell+biology.">Unravelling molecular complexity in structural cell biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 52, 111-118 (2018).</li><li>Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+high-resolution+in+situ+structural+biology+with+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).</li><li>Bohning, J., Bharat, T. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high-throughput+in+situ+structural+biology+using+electron+cryotomography.">Towards high-throughput in situ structural biology using electron cryotomography.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. , (2020).</li><li>Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging.">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Wan, W., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).</li><li>Tan, Y. Z., Cheng, A., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+data+collection+in+single+particle+electron+microscopy.">Automated data collection in single particle electron microscopy.</a> Microscopy. 65 (1), 43-56 (2016).</li><li>Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Tomoauto:+A+protocol+for+high-throughput+automated+cryo-electron+tomography.">Using Tomoauto: A protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (107), e53608 (2016).</li><li>Resch, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 152, 135-178 (2019).</li><li>Bharat, T. A., Kukulski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Correlative Imaging: Focusing on the Future. , 137-153 (2019).</li><li>Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+cryo-electron+tomography+tilt-scheme+optimized+for+high+resolution+subtomogram+averaging.">Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).</li><li>O'Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, R. J., Mastronarde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16, 471-477 (2019).</li><li>Turonova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+tomographic+acquisition+schemes+for+high-resolution+structural+biology.">Benchmarking tomographic acquisition schemes for high-resolution structural biology.</a> Nature Communications. 11 (1), 876 (2020).</li><li>Chreifi, G., Chen, S., Metskas, L. A., Kaplan, M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tilt-series+acquisition+for+electron+cryotomography.">Rapid tilt-series acquisition for electron cryotomography.</a> Journal of Structural Biology. 205 (2), 163-169 (2019).</li><li>Eisenstein, F., Danev, R., Pilhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+applicability+and+robustness+of+fast+cryo-electron+tomography+data+acquisition.">Improved applicability and robustness of fast cryo-electron tomography data acquisition.</a> Journal of Structural Biology. 208 (2), 107-114 (2019).</li><li>Turonova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+structural+analysis+of+SARS-CoV-2+spike+reveals+flexibility+mediated+by+three+hinges.">In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges.</a> Science. 370 (6513), 203-208 (2020).</li><li>O'Reilly, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-cell+architecture+of+an+actively+transcribing-translating+expressome.">In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome.</a> Science. 369 (6503), 554-557 (2020).</li><li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.7+&#197;+inside+cells.">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.7 &#197; inside cells.</a> Nature Methods. 18, 186-193 (2020).</li><li>Karuppasamy, M., Karimi Nejadasl, F., Vulovic, M., Koster, A. J., Ravelli, R. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+in+single-particle+cryo-electron+microscopy:+effects+of+dose+and+dose+rate.">Radiation damage in single-particle cryo-electron microscopy: effects of dose and dose rate.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 18 (3), 398-412 (2011).</li><li>Liberta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+fibril+structures+from+systemic+AA+amyloidosis+reveal+the+species+complementarity+of+pathological+amyloids.">Cryo-EM fibril structures from systemic AA amyloidosis reveal the species complementarity of pathological amyloids.</a> Nature Communications. 10 (1), 1104 (2019).</li><li>Radamaker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+light+chain-derived+amyloid+fibril+from+a+patient+with+systemic+AL+amyloidosis.">Cryo-EM structure of a light chain-derived amyloid fibril from a patient with systemic AL amyloidosis.</a> Nature Communications. 10 (1), 1103 (2019).</li></ol>

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Из нишевой техники криоЭТ в настоящее время превратился в широко распространенный метод для выполнения структурных исследований на клеточном и молекулярном уровне с беспрецедентным достижимым разрешением21,22. Постоянно растущий спрос на криоЭМ-визуализацию создает нагрузку на ограниченные ресурсы, доступные для доступа к этой технологии. Несмотря на открытие ряда национальных установок криоЭМ и усилия научных институтов по наращиванию своего потенциала в области ТЕА для удовлетворения потребностей сообщества во всем мире, доступ к криоЭМ-приборам по-прежнему ограничен, и поэтому пользователи должны эффективно использовать время, имеемое для сбора данных, для максимального увеличения отдачи от каждого сеанса микроскопии. Необходимость получения сотен наклонных рядов в сочетании с ограниченным временем, доступным для сбора данных, потребовала новых процедур сбора изображений для достижения лучшей пропускной способности без ущерба для качества данных. Последние разработки в области аппаратного обеспечения и рабочих процессов обработки изображений значительно увеличили скорость захвата серий tilt18,19,что привело к резкому смещению соотношения между временем, затраченным на установку точки сбора, и временем, необходимым для фактического приобретения серии tilt. В целом, процедура создания точек сбора становится одним из основных узких мест для достижимой пропускной способности сеансов cryoET.
Оптимизированный протокол, представленный здесь, позволил нам настроить в режиме off-line 171 позицию для автоматического томографического сбора в течение первого дня сеанса криоЭТ, в то время как микроскоп активно участвовал в других операциях (например, квадратное картирование, настройка и автоматическое получение рядов наклона), таким образом, не влияя на время микроскопа, доступное для сбора данных. В дополнение к максимизации пропускной способности сеанса cryoET, этот конвейер значительно сокращает время, затрачиваемое пользователем на подготовительный этап сеанса автоматизированного сбора данных. В описанном протоколе пользователю предлагается просмотреть сопоставленные квадраты сетки, чтобы определить подходящие области, представляющие интерес, и добавить их в Serial EM Navigator в качестве точек сбора. Затем все цели будут автоматически обработаны пакетно в SerialEM инструментом PyEM для производства виртуальных карт16. Таким образом, представленный вычислительный подход значительно быстрее, чем получение реальных карт привязки, за счет устранения периодов ожидания, связанных с движением стадии, получением изображения, изменением условий изображения между просмотром и предварительным просмотром, а также путем возможного повторения этих шагов при центрировании при высоком увеличении. Кроме того, поскольку каждое полученное изображение приводит к накоплению электронной дозы на интересуемом объекте23,использование виртуальных карт для точной перестройки целей уменьшает радиационный ущерб, наносимый на подготовительном этапе сеанса криоЭТ перед фактическим получением серии наклона. Протокол, описанный здесь, использует виртуальные карты как промежуточного, так и высокого увеличения (Preview и View, соответственно) для перестройки цели перед получением серии наклона. Эта процедура может быть легко изменена для использования только промежуточного увеличения View image, когда точность выравнивания имеет меньшее значение, например, в случае крупных структур, где конечная точность цели имеет меньшее значение10, или для образцов анализа одиночных частиц, которые плохо распределены по криотрешетке, требуя ручного выбора пользователем каждой точки сбора24, 25 г. Наконец, подход, основанный на использовании в режиме онлайн фиктивного экземпляра SerialEM, также облегчает настройку точек сбора через удаленное соединение, сводя к минимуму необходимость физического присутствия пользователя у микроскопа, что обеспечивает большую гибкость с точки зрения оперативной организации объекта.
Последние достижения в области технологий и методов криоЭТ значительно повысили скорость и надежность автоматизированных сеансов сбора данных. Однако для решения остальных этапов ограничения скорости этого метода необходимы дальнейшие разработки. В частности, начальный этап картографирования сетки и квадратов в настоящее время становится одним из основных узких мест в настройке сеанса, что создает необходимость в аппаратных улучшениях, направленных на увеличение скорости движений ступени микроскопа и получения изображения прямыми электронными детекторами. Кроме того, разработка подходов машинного обучения для полной автоматизации процесса идентификации целей будет иметь решающее значение для устранения необходимости визуального осмотра пользователей для выбора интересующих регионов, что является трудоемкой процедурой, которая опирается на опыт пользователей.

Методы криогенной электронной микроскопии (криоЭМ) основаны на визуализации биологических образцов с помощью просвечивающих электронных микроскопов (ТЭМ) после их быстрой витрификации, процесса пробоподготовки, который сохраняет молекулярные и клеточные структуры образцов в близком к нативном и гидратированном состоянии1,2. В криогенной электронной томографии (криоЭТ) 3D-модель остеклованного образца достигается путем получения ряда изображений одной и той же интересующей области из разных ориентаций, так называемого наклонного ряда, с последующей вычислительной реконструкцией томографического тома3. Этот передовой метод визуализации превратился в мощный метод структурного исследования биологических процессов в контексте их нативных клеточных сред4,5,6.
Помимо ультраструктурного анализа остеклованного образца, реконструкции высокоместных макромолекулярных комплексов, присутствующих в нескольких копиях в пределах томографического объема, могут быть получены путем применения субтомограммы в среднем5. Этот подход к реконструкции основан на итеративном выравнивании и усреднении подтомов, содержащих интересующую структуру, и направлен на увеличение отношения сигнал/шум и разрешения окончательной реконструкции7,8. Усреднение субтомограммы зависит от сбора и обработки большого объема данных, что часто требует получения сотен наклонных рядов с помощью высококачественных ТЭМ с обременительными эксплуатационными расходами.
В настоящее время настройка таких автоматизированных сеансов криоЭТ является трудоемким процессом, который обычно опирается на ручной ввод пользователя9,10,11. Как правило, цели идентифицируются путем визуального осмотра картографированной сетки и впоследствии настраиваются для автоматизированного сбора данных. На эффективность пользователя в выявлении точек сбора часто влияет характер образца, что становится особенно сложным при анализе очищенных макромолекул с неоптимальной концентрацией или в случае редких событий в переполненных клеточных средах, подразумевая использование коррелятивных подходов12. Кроме того, текущие рабочие процессы требуют получения изображений во время настройки при различных увеличениях, которые впоследствии будут использоваться для точной локализации и центрирования цели при автоматизированном сборе11,13,14. Эти высокоточные шаги повторного выравнивания имеют решающее значение для приложений с высоким разрешением, которые требуют, чтобы изображение выполнялось при высоком увеличении и требуют точных шагов центрирования для удержания интересующей области в результирующем небольшом поле зрения. В общей сложности для этой трудоемкой процедуры, в течение которой ТЕА не занимается сбором рядов наклона, отводится несколько часов каждого сеанса сбора данных. Поэтому, в зависимости от количества требуемых серий наклона, идентификация и настройка точек сбора может оказать значительное влияние на время микроскопа, доступное для сбора данных во время сеанса криоЭТ.
Здесь описан оптимизированный протокол, основанный на программном пакете SerialEM15 и последней версии программного обеспечения PyEM16 для отображения сеток, отображения квадратов сетки, выбора целей и настройки автоматического сбора данных для крупномасштабного сбора серий наклона. Ключевая концепция этого подхода заключается в предоставлении SerialEM вычислительно сгенерированных изображений PyEM для каждого элемента сбора, так и называется виртуальными картами, для точной локализации и центрирования цели. Чтобы получить фактическое время сбора, выбор целей, а также создание виртуальных карт выполняются в режиме off-line с использованием второго фиктивного экземпляра SerialEM, отделяя процесс выбора целей сбора от операций TEM. Хотя этот протокол не рассматривает способ повышения качества данных13,17 или скорость получения18,19серийнаклона,этот протокол в первую очередь ориентирован на стратегии оптимизации временной эффективности крупномасштабной автоматизированной настройки сеансов криоЭТ. Таким образом, реализация представленного протокола предназначена для тех ученых, которые создают рабочие процессы сбора данных cryoET, которые хотят максимизировать выход автоматизированного сбора данных за счет увеличения времени микроскопа, доступного для сбора клоновых рядов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition

Криогенная электронная томография (криоЭТ) является мощным методом изучения 3D-структуры биологических образцов в близком к родному состоянию. Современное состояние криоЭТ в сочетании с анализом усреднения субтомограмм позволяет определять структуры макромолекулярных комплексов с высоким разрешением, которые присутствуют в нескольких копиях в томографических реконструкциях. Томографические эксперименты обычно требуют получения огромного количества наклонных рядов с помощью высококачественных просвечивающих электронных микроскопов с важными эксплуатационными расходами. Хотя пропускная способность и надежность автоматизированных процедур сбора данных постоянно улучшались в последние годы, процесс выбора интересующих регионов, в которых будет получен ряд наклонов, не может быть легко автоматизирован, и он по-прежнему зависит от ручного ввода пользователя. Таким образом, настройка крупномасштабного сеанса сбора данных является трудоемкой процедурой, которая может значительно сократить оставшееся время микроскопа, доступное для получения серии наклона. Здесь протокол описывает недавно разработанные реализации, основанные на пакете SerialEM и программном обеспечении PyEM, которые значительно повышают временную эффективность скрининга сетки и крупномасштабного сбора данных о сериях наклона. Представленный протокол иллюстрирует, как использовать функциональные возможности сценариев SerialEM для полной автоматизации сопоставления сетки, сопоставления квадратов сетки и получения рядов наклона. Кроме того, протокол описывает, как использовать PyEM для выбора дополнительных целей сбора в режиме off-line после начала автоматического сбора данных. Чтобы проиллюстрировать этот протокол, описано его применение в контексте сбора высококачественных данных серии наклона Sars-Cov-2. Представленный конвейер особенно подходит для максимизации временной эффективности томографических экспериментов, которые требуют тщательного выбора целей сбора и в то же время большого количества наклонных рядов, которые необходимо собрать.

Эта процедура была использована для получения серии наклона Sars-Cov-2, описанной в Turonova et al. 202020; весь набор данных был получен с использованием трех различных сеток в течение трех сеансов микроскопии в EMBL Heidelberg. Текущее исследование будет сосредоточено на первом 3-дневном (~ 72 ч) сеансе с первой сеткой и описано.
После того, как вся сетка была нанесена на карту с низким увеличением (~10 мин, см. шаг 2), на карте сетки был выбран 71 подходящий квадрат, а также получены карты среднего увеличения(квадратные карты)с настройками (увеличение, экспозиция, расфокусировка), которые позволяют напрямую визуализировать и идентифицировать интересующий образец, коронавирусы в данном случае (см. шаг 4)(рисунок 1А). Время приобретения составило ~3 мин на квадрат, всего 3 ч 45 мин.
Как только была создана первая квадратная карта, на отдельном компьютере был открыт фиктивный экземпляр SerialEM (без какого-либо управления на камере или микроскопе) для визуализации квадратной карты и добавления точек на цели, подходящие для получения серии наклона (см. шаг 5)(рисунок 1B). Вновь полученные квадратные карты были получены путем слияния текущего фиктивного навигатора SerialEM с навигатором из приобретающего экземпляра SerialEM. После ~2 ч сбора и выбора квадрата сетки можно было определить 50 первоначальных целей.
После завершения сбора квадратной карты была настроена низкая доза SerialEM, а эталонные изображения View и Preview были взяты и сохранены в виде карт (см. шаг 3). Последние карты затем могут быть немедленно использованы на фиктивном экземпляре SerialEM для создания из соответствующих квадратных изображений карт карты Virtual View (рисунок 1C)и Virtual Preview (Рисунок 1D)50 выбранных целей с помощью пакета программного обеспечения PyEM для времени обработки ~ 30 минут (см. шаг 6). Это время обработки на сеансе SerialEM было использовано для выполнения окончательной подготовки микроскопа к получению: настройки энергетического фильтра, получения эталонного изображения новой камерой, выравнивания объектива без астигматизма и комы.
После завершения настройки микроскопа и создания виртуальных карт из 50 начальных целей был настроен фактический навигатор SerialEM, который будет использоваться для сбора (см. шаг 8), были установлены позиции фокусировки и трека (шаг 9), и можно было начать сбор серии наклона (см. шаги 10 и 11). Карты Virtual View (рисунок 1C)использовались для начального центрирования цели(рисунок 1E),за которым последовало окончательное центрирование, выполненное при фактическом увеличении захвата серии наклона(рисунок 1F)с использованием карты виртуального предварительного просмотра (рисунок 1D).
Начиная с картографирования сетки в 9:30 утра, приобретение серии наклона для 50 первоначальных целей началось примерно в 15:00. С настройками, используемыми для томографического сбора (см. ссылку для деталей), серия наклона заняла ~ 20 минут, чтобы получить, с достаточным количеством целей, чтобы затем пробежать всю ночь. Пока происходило приобретение, остальные квадратные карты можно было проверить и добавить больше целей, все еще отключенных через фиктивный экземпляр SerialEM. Еще 121 цель была выбрана среди оставшихся квадратных карт и добавлена в навигатор сбора SerialEM после создания виртуальных карт для этих новых целей, достаточно для работы до завершения 72-х сессии.
Эта процедура (обобщенная на рисунке 2)позволила за один рабочий день установить 171 мишень для автоматизированных томографических сборов за 72-ч (3 дня) сеанса микроскопа.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62383/62383fig01.jpg"> Рисунок 1:Пример квадратной карты с репрезентативными виртуальными картами и соответствующими приобретениями после центрирования. (A) Репрезентативная квадратная карта криоЭМ-сетки Sars-Cov-2, использованная в Turonova et al.20. Четыре области, представляющие интерес, отмечены красным крестом. Увеличение микроскопа составляет 2 250x. (B) Обрезать квадратную карту, выделив области, которые использовались для создания карт виртуального представления (оранжевый) и виртуального предварительного просмотра (желтый) для выбранной целевой карты (красный крест)(C)виртуальный вид. (D) Карта виртуального предварительного просмотра. (E) Получение фактического представления после центрирования с использованием карты виртуального представления в качестве ссылки. Увеличение микроскопа составляет 11 500x. (F) Получение наклона на 0° из серии наклона после центрирования с использованием карты виртуального предварительного просмотра в качестве эталона. Увеличение микроскопа составляет 64 000x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62383/62383fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62383/62383fig02.jpg"> Рисунок 2:Рабочий процесс сеанса CryoET с использованием SerialEM с инструментами PyEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62383/62383fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition at JoVE.com

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Растущий спрос на крупномасштабный сбор данных в криогенной электронной томографии требует высокопроизводительных процедур получения изображений. Здесь описан протокол, который реализует последние разработки передовых стратегий сбора, направленных на максимизацию эффективности времени и пропускной способности сбора томографических данных.

Стратегии оптимизации сбора данных криогенной электронной томографии

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Настройка крупномасштабного сеанса сбора данных является трудоемкой процедурой, которая может значительно сократить оставшееся время микроскопа, доступное для получения серии наклона. Этот метод позволяет быстро настроить крупномасштабный автоматизированный сбор данных томографии для максимизации эффективности времени томографических экспериментов, требующих тщательного выбора целей сбора. Начните с открытия фиктивного экземпляра SerialEM.После того, как первый квадрат сетки сопоставлен, используйте пункт меню навигатора SerialEM, чтобы увидеть монтаж в фиктивном экземпляре SerialEM. Дважды щелкните окно навигатора, чтобы открыть квадратную карту сетки. Выполните поиск по карте и воспользуйтесь фиктивной опцией навигатора SerialEM, чтобы добавить точки получения изображений на интересуемую цель.После сопоставления новых квадратов сохраните файл навигатора и снова объедините навигатор. Продолжайте до тех пор, пока не будут сопоставлены все квадраты сетки. Снова объедините файл навигации с фиктивным экземпляром SerialEM.Запустите скрипт виртуальных карт Pi EM из фиктивного меню SerialEM. Выберите инструменты и выберите виртуальные якорные карты. Это может занять некоторое время в зависимости от размера и количества квадратных карт сетки, а также от биннинга карт просмотра и предварительного просмотра.Чтобы обеспечить надлежащую производительность микроскопа, используйте ту же настройку увеличения и размера пучка для сбора данных в следующем порядке. Выполните выравнивание SerialEM без комы с помощью CTF. Вставьте и центрите объективную диафрагму.Запустите SerialEM корректный астигматизм с помощью CTF и GIF быстрой настройки. В SerialEM откройте новый файл навигатора. Считаем все точки А.Выберите первый вид карт. Выберите свернуть. Дважды нажмите A и сверните сворачивание.Выберите первую позицию карты. Нажмите Shift T, затем выберите самую последнюю позицию карты и нажмите Shift T еще раз. Выберите однорамочные изображения в свойствах файла, чтобы открыть диалоговое окно.В следующем диалоговом окне свойств файла выберите нужные параметры в соответствии с потребностями в создании изображений и настройкой прибора. При появлении запроса дайте имя с номером и нажмите «Сохранить». Настройте контроллер серии наклона для первого положения TS.По завершении нажмите кнопку ОК, чтобы задать эти параметры для всех серий наклонов после этого элемента сбора. Все карты предварительного просмотра теперь выбираются как TS с пронумерованным именем файла. При необходимости установите расстояние фокусировки/трека для каждой цели.Дважды щелкните на карте просмотра, чтобы загрузить ее. Выберите карту предварительного просмотра в списке навигатора. Затем выберите «Редактировать фокус» в окне навигатора.На панели управления низкой дозой откажитесь от выбора, поверните межосевую ось, чтобы расположить испытание и сфокусироваться вдоль оси наклона ступени. Щелкните нужную область на загруженной карте просмотра, чтобы установить пробное положение фокуса для этой серии наклонов и убедиться, что элемент навигатора имеет TSP. Повторите процедуру для всех элементов.Отредактируйте диапазон фокусировки в скрипте PreTomo, который запускается перед каждым рядом наклона. В меню SerialEM tilt series проверьте сценарий запуска в TS и выберите номер сценария DuringTomo во время каждого наклона. Проверьте уровень азотного бака и то, выбран ли турбонаддув автозагрузчика.Проверьте свободное место в хранилище данных. В меню Файл SerialEM сняте выбор параметра Непрерывное сохранение файла журнала. Каждая серия наклонов получит свой собственный файл журнала.После нажатия на приобретаемые элементы в навигационном меню, запустите скрипт PreTomo. Выберите основную задачу получения серии наклонов, затем выберите запустить сценарий после PostTomo. Выберите закрыть клапаны столбцов в конце и отправьте электронное письмо в конце, затем нажмите «Перейти».71 подходящий квадрат был выбран на карте сетки при меньшем увеличении. Были получены карты среднего увеличения с настройками, которые позволяют напрямую визуализировать и идентифицировать интересующий образец, в данном случае коронавирусов. Время приобретения составило три минуты на квадрат, в общей сложности три часа и 45 минут.Когда была создана первая квадратная карта, на отдельном компьютере был открыт фиктивный экземпляр SerialEM для визуализации квадратной карты и добавления точек на мишенях, подходящих для получения серии наклона. Была настроена низкая доза SerialEM, а изображения с контрольным видом и предварительным просмотром были взяты и сохранены в виде карт. Последние карты затем могут быть немедленно использованы на фиктивном экземпляре SerialEM для создания виртуального представления и виртуального предварительного просмотра из соответствующих квадратных изображений карты.Карты виртуального вида использовались для первоначального центрирования цели, за которым последовало окончательное центрирование, выполненное при фактическом увеличении сбора серии наклона с использованием виртуальной карты предварительного просмотра. Пользователи должны предоставить себе достаточно времени для изучения ландшафта образцов. После поиска на некоторых картах вы лучше чувствуете области хорошего качества для сбора данных.

Research

JoVE Journal

Biology

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Do-It-Yourself Устройство для восстановления криоконсервированных образцов случайно уронил в криогенных резервуаров

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

Полимеразной цепной реакции: основные протокол Plus Устранение неполадок и оптимизация стратегии

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Визуализация АТФ-синтазы димеров в митохондриях с помощью электронной Cryo-томографии

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Подготовка и наблюдение Толстые биологических образцов с помощью сканирующего трансмиссионной электронной томографии

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Процедура и ключей оптимизации стратегии для автоматизированной капиллярного электрофореза на основе иммуноферментного анализа метода

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D митохондриальной Ультраструктура дрозофилы косвенные полет мышцы показали серийный Секция электрон томография

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Визуализация ДНК уплотнения в цианобактерий, томография высокого напряжения крио электрон

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Количественная оценка конкретных участков белка лизин ацетилирования и стехиометрии Succinylation с помощью приобретения данных независимые масс-спектрометрия

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

Оптимизация кристаллического роста для нейтронной макромолекулярной кристаллографии

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Рабочий процесс массивной томографии для целенаправленного получения объемной информации с помощью сканирующей электронной микроскопии

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...