Name: strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition
Uploaded: 2021-03-19T15:00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition at JoVE.com

Vi bekräftar stöd från enheten för struktur- och beräkningsbiologi och kärnanläggningen elektronmikroskopi vid European Molecular Biology Laboratory i Heidelberg, Tyskland och från iNEXT-Discovery (projektnummer 871037). Vi är oerhört tacksamma för det utmärkta stödet från författaren till SerialEM-mjukvarupaketet, professor David Mastronarde. Vi tackar också Herman Fung för den kritiska läsningen av manuskriptet.

Protokollet som beskrivs här är en del av ett mer omfattande dokument som produceras av EMBL CryoEM Service Platform som innehåller noggranna steg-för-steg-instruktioner och skärmdumpar som illustrerar hela proceduren för en typisk cryoET-session, inklusive provinläsning, rutnätsmappning, mikroskopjustering, uppsättning av anskaffningspunkter och automatiserad datainsamling. Det fullständiga protokollet kan laddas ner på följande länk: https://oc.embl.de/index.php/s/9OuTl8AazDkCNq0/download
1. Förutsättningar
<ol><li>Installera SerialEM version 3.8 och konfigurera för att styra mikroskopet och detektorn (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/betaHlp/html/setting_up_serialem.htm).</li>
	<li>Installera en dummy-instans av SerialEMversion 3.8 (https://sphinx-emdocs.readthedocs.io/en/latest/serialEM-note-setup-dummy.html).</li>
	<li>Installera PyEM (https://git.embl.de/schorb/pyem).</li>
</ol>2. Rutnätsmappning
<ol><li>Ladda en kassett med galler i mikroskopets autolastare.</li>
	<li>Ställ in avbildningsförhållanden som är lämpliga för att mappa hela rutnätet. Gör detta vid minsta möjliga förstoring med hänsyn till synfältet på den använda detektorn (EFTEM SA 2250x). Spara avbildningsförhållandena som ett SerialEM Imaging State för att göra det bekvämt för senare användning.</li>
	<li>Ställ in fullständigt montage<ol>
<li>Öppna Menyn SerialEM Navigator. </li>
		<li>Välj Montaging & Grids.</li>
		<li>Välj Ställ in fullständigt montage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Starta skriptet Grid_Mapping. Låt skriptet vänta tills autoloadern har svalnat. gör en inventering och mappa sedan varje rutnät som lagerproceduren hittade. Mata in ett e-postmeddelande via Tilt Series-menyn så att skriptet enkelt kan skicka ett e-postmeddelande när det är klart.</li>
	<li>Spara Navigator.</li>
	<li>Inspektera alla rutnätskartor från SerialEM Navigator och välj vilket rutnät som ska mappas vidare vid högre förstoring. OBS: Många TEMs utrustade med ett autoloader-system visar en rotation av rutnätet när det laddas om. Det är bäst att mappa om alla rutnät efter att ha laddat om det. Alternativa system drabbas vanligtvis bara av vissa skift, som kan korrigeras i SerialEM med en Shift To Marker-procedur.</li>
</ol>3. Ställ in Den låga dosen serialem
<ol><li>Ställ in förstoring av SeriellEM lågdosVy och Förhandsgranskningslägen (detta krävs för steg 6).</li>
	<li>Hämta en visa-bild och spara den som en karta i Navigator.</li>
	<li>Hämta en förhandsgranskningsbild och spara den som en karta i Navigator.<ol>
<li>Ställ in båda lägena på samma lagerplats (lagerplats 4 föreslås). Detta gör det möjligt att spara de två kartorna i en bildstack.</li>
		<li>I fönstret SerialEM Navigator ändrar du etiketten på visa karta till Visa och etiketten på förhandsgranskningskartan till Förhandsgranska.</li>
		<li>Spara och stäng navigatörsfilen. Inget mål behövs för de första vy- och förhandsgranskningsbilderna, PyEM använder bara sina bildinställningar. </li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Rutnät kvadratisk mappning
<ol><li>Ställ in avbildningsförhållandena för att mappa rutnätsrutor. Det är av stor vikt att kunna se urvalet av intresse och den fiduciala pärlfördelningen. Utför följande steg för att säkerställa optimal kontrast för rutnätsrutor.<ol>
<li>Sätt in en objektiv bländare.</li>
		<li>Sätt i förekommande fall in energifilterslitsen.</li>
		<li>Använd en defokusering på -100 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Skärm för bra rutnätsrutor som lämpar sig för ytterligare kartläggning. Efter visuell inspektion av rutorna från rutnätskartan, ta testbilder av torget med de bildförhållanden som ska användas för rutnätsrutor.</li>
	<li>När en bra kvadrat identifieras markerar du dess mitt i rutnätskartan med funktionen Lägg till punkter i SerialEM Navigator.</li>
	<li>När alla punkter har lagts till trycker du på Skift + A på den första punkten i SerialEM Navigator och trycker sedan på Skift + A på den sista punkten. Alla tillagda poäng markeras nu med ett A, vilket innebär att de alla är förvärvspoäng.</li>
	<li>Tryck på Skift + N (skapa en ny fil vid objektet) på den första punkten och sedan igen på den sista punkten. Välj MontagedImages i dialogrutan som kommer upp.</li>
	<li>När montagedialogrutan dyker upp ställer du in en montagestorlek som täcker en rutnätsruta. Detta beror på förstoringen och nätstorleken på de använda rutnäten och kräver vanligtvis 2 x 2 till 4 x 4 montage. Ge det ett namn med ett nummer (t.ex. squaremap_01.mrc) så att SerialEM bekvämt kan automatiskt numrera alla filer per rutnätsruta.</li>
	<li>Starta rutnätsmappningen genom att öppna SerialEM Navigator-menyn och klicka på Hämta vid objekt.</li>
	<li>Välj följande alternativ på popup-menyn.<ol>
<li>Välj Grov eucentricitet.</li>
		<li>Välj Hämta kartbild.</li>
		<li>Välj Stäng kolumnventiler i slutet.</li>
		<li>Välj Skicka e-post i slutet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Välja mål
<ol><li>Öppna en dummy SerialEM-instans. Detta kan ställas in på SerialEM-datorn som styr mikroskopet eller på en annan (stöd) dator om båda datorerna delar en nätverksanslutning.</li>
	<li>När den första rutnäts kvadraten har mappats använder du menyalternativet SerialEM Navigator Merge för att se montage i dummy SerialEM-instansen.</li>
	<li>Dubbelklicka på navigatörsfönstret för att öppna rutnätsrutans fyrkantiga karta.</li>
	<li>Sök på kartan och använd alternativet dummy SerialEM Navigator för att lägga till bildförvärvspunkter på räntemålet.</li>
	<li>När du är klar och efter mappning av de nya rutorna sparar du navigatörsfilen och sammanfogar Navigator igen. fortsätta tills alla rutnätsrutor har mappats.</li>
</ol>6. Generera virtuella kartor
<ol><li>Sammanfoga återigen navigatörsfilen med dummy SerialEM-instansen.</li>
	<li>Kör PyEM Virtual maps skript från dummy SerialEM-menyn, Verktyg och välj Virtual Anchor Maps. Detta kan ta lite tid beroende på storleken och mängden av rutnätets fyrkantiga kartor och bineringen av vy- och förhandsgranskningsmapparna. OBS: PyEM startar ett kommandofönster som stängs automatiskt när det är klart, då kan den nya navigatörfilen öppnas. Per montaged karta som innehåller valda punkter skriver PyEM en enda sammanslagen karta och alla sina Visa och förhandsgranska kartor. Slutligen skriver den en ny Navigator-fil som heter <navigatorfilename>_automaps.nav.</li>
</ol>7. Inställning av mikroskop
<ol><li>Kontrollera mikroskopjusteringen. För att säkerställa korrekt mikroskopprestanda, använd samma förstorings- och strålstorleksinställning för datainsamling i följande ordning.<ol>
<li>Kör SeriaLEM Komafri inriktning av CTF (Zemlin tableau).</li>
		<li>Sätt i och centrera en objektiv bländare.</li>
		<li>Kör SerialEM Correct Astigmatism av CTF (auto-stigmate).</li>
		<li>Kör GIF Quick Tune (dvs. endast slitsfokus). OBS: Eftersom steg 7.1.1, 7.1.3 och 7.1.4 kan kräva mer dosrat, bör endast spotstorleken ändras; strålstorleken bör inte ändras eftersom detta orsakar balklutning, vilket gör tuningsna felaktiga. Steg 7.1.1, 7.1.2 och 7.1.3 är halvautomatiska i detta allmänt tillgängliga skript (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Ställ in Navigator
<ol><li>Öppna den nya navigatörsfilen med namnet <navigatorfilename>_automaps.nav. Obs: V_yyyy är Visa kartor och P_yyyy är förhandsgranskningskartorna. Förhandsgranskningsmapporna är inställda som anskaffningspoäng.</li>
	<li>I fönstret SerialEM-navigatör avmarkerar du alla A-punkter, markerar den första V_yyyy-kartan, väljer Komprimera, klickar på A två gånger och avmarkerar Dölj.</li>
	<li>Välj den första V_yyyy positionen, tryck på Skift + Toch välj sedan den allra sista V_yyyy positionen och tryck på Skift + T igen.</li>
	<li>Välj Bilder med enkel bildruta i egenskaperna för den fil som ska öppnas.</li>
	<li>I nästa dialogruta för filegenskaper väljer du önskade parametrar enligt avbildningsbehoven och instrumentinställningarna.</li>
	<li>När du uppmanas till det, ge ett namn med ett nummer (t.ex. TS_001.mrc) och klicka på Spara. SerialEM numrerar filnamnen automatiskt för alla tiltserier.</li>
	<li>Ställ in styrenheten för tiltserien för den första TS-positionen. När du är klar klickar du på OK för att ställa in dessa parametrar för alla tiltserier efter den här anskaffningsartikeln. Alla förhandsgranskningsmappningar är nu markerade som TS (Tilt Series) med numrerat filnamn TS_xxx.mrc. Obs: Man kan ändra parametrarna manuellt senare med hjälp av navigatören TSparams-funktionen; ändringar kommer att tillämpas för alla poster nedåt i listan. Användaren har möjlighet att köra ett anpassat skript i stället för tilt-serien.</li>
</ol>9. Ställ in fokus-/spårpositionerna
<ol><li>Ställ in fokus/spåravstånd för varje mål om det behövs (se till att SerialEM Low Dose är påslagen).</li>
	<li>Dubbelklicka på Visa karta för att läsa in den.</li>
	<li>Välj förhandsgranskningskartan i listan Navigatör.</li>
	<li>Välj Redigera fokus i navigatörsfönstret.</li>
	<li>På kontrollpanelen med låg dos avmarkerar du Rotera mellanområdesaxeln för att placera Trial and Focus längs scenens lutningsaxel.</li>
	<li>Klicka på önskat område i den inlästa vykartan för att ställa in fokus/utvärderingspositionen för den här lutningsserien.</li>
	<li>Kontrollera att navigatörsobjektet har TSP inställt nu. upprepa proceduren för alla artiklar. OBS: Fokus-/spårpositioner kopieras automatiskt nedåt i Navigatören. Om fokus-/spårpositionen för föregående artikel är på rätt sida och på rätt avstånd behöver du därför inte ändra den för den aktuella artikeln.</li>
</ol>10. Ställ in ytterligare skript
<ol><li>Två skript hanterar fokusintervallet: pretomo och duringtomo. Pretomo-skriptet körs före varje tiltserie och duringtomo-skriptet under varje lutning.</li>
	<li>Redigera fokusintervallet i skriptet pretomo.</li>
	<li>På menyn SerialEM Tilt Series kontrollerar du Kör skript i TS och väljer skriptnumret för duringtomo-skriptet. </li>
</ol>11. Kör
<ol><li>Kontrollera kvävetankens nivå.</li>
	<li>Kontrollera om Turbon för autoloader är vald.</li>
	<li>Kontrollera det lediga utrymmet för datalagring.</li>
	<li>På SerialEM-filmenyn avmarkerar du kontinuerlig sparning för loggfilen och stänger alla öppna loggfiler. Varje tiltserie får sin egen loggfil.</li>
	<li>Klicka på Hämta på objekt på Navigator-menyn.</li>
	<li>Kör skriptet PreTomo.</li>
	<li>Välj Primär uppgift Hämta lutningsserie.</li>
	<li>Välj Kör skript efter PostTomo.</li>
	<li>Välj Stäng kolumnventiler i slutet.</li>
	<li>Välj Skicka e-post i slutet.</li>
	<li>Klicka på GÅ. SerialEM skickar ett e-postmeddelande per tiltserie, antingen framgångsrikt eller fel; kan dock också innebära att hela lutningsområdet inte nåddes.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+viruses.">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM-How+did+it+get+here+and+where+will+it+go.">Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go.</a> Science. 361 (6405), 876-880 (2018).</li><li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+by+electron+tomography:+From+Cells+to+Molecules.">Structural studies by electron tomography: From Cells to Molecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 833-865 (2005).</li><li>Pfeffer, S., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+molecular+complexity+in+structural+cell+biology.">Unravelling molecular complexity in structural cell biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 52, 111-118 (2018).</li><li>Schur, F. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+high-resolution+in+situ+structural+biology+with+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging.">Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).</li><li>Bohning, J., Bharat, T. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high-throughput+in+situ+structural+biology+using+electron+cryotomography.">Towards high-throughput in situ structural biology using electron cryotomography.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. , (2020).</li><li>Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging.">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Wan, W., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).</li><li>Tan, Y. Z., Cheng, A., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+data+collection+in+single+particle+electron+microscopy.">Automated data collection in single particle electron microscopy.</a> Microscopy. 65 (1), 43-56 (2016).</li><li>Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Tomoauto:+A+protocol+for+high-throughput+automated+cryo-electron+tomography.">Using Tomoauto: A protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (107), e53608 (2016).</li><li>Resch, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 152, 135-178 (2019).</li><li>Bharat, T. A., Kukulski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Correlative Imaging: Focusing on the Future. , 137-153 (2019).</li><li>Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+cryo-electron+tomography+tilt-scheme+optimized+for+high+resolution+subtomogram+averaging.">Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).</li><li>O'Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, R. J., Mastronarde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy.">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16, 471-477 (2019).</li><li>Turonova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+tomographic+acquisition+schemes+for+high-resolution+structural+biology.">Benchmarking tomographic acquisition schemes for high-resolution structural biology.</a> Nature Communications. 11 (1), 876 (2020).</li><li>Chreifi, G., Chen, S., Metskas, L. A., Kaplan, M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tilt-series+acquisition+for+electron+cryotomography.">Rapid tilt-series acquisition for electron cryotomography.</a> Journal of Structural Biology. 205 (2), 163-169 (2019).</li><li>Eisenstein, F., Danev, R., Pilhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+applicability+and+robustness+of+fast+cryo-electron+tomography+data+acquisition.">Improved applicability and robustness of fast cryo-electron tomography data acquisition.</a> Journal of Structural Biology. 208 (2), 107-114 (2019).</li><li>Turonova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+structural+analysis+of+SARS-CoV-2+spike+reveals+flexibility+mediated+by+three+hinges.">In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges.</a> Science. 370 (6513), 203-208 (2020).</li><li>O'Reilly, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-cell+architecture+of+an+actively+transcribing-translating+expressome.">In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome.</a> Science. 369 (6503), 554-557 (2020).</li><li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.7+&#197;+inside+cells.">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.7 &#197; inside cells.</a> Nature Methods. 18, 186-193 (2020).</li><li>Karuppasamy, M., Karimi Nejadasl, F., Vulovic, M., Koster, A. J., Ravelli, R. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+in+single-particle+cryo-electron+microscopy:+effects+of+dose+and+dose+rate.">Radiation damage in single-particle cryo-electron microscopy: effects of dose and dose rate.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 18 (3), 398-412 (2011).</li><li>Liberta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+fibril+structures+from+systemic+AA+amyloidosis+reveal+the+species+complementarity+of+pathological+amyloids.">Cryo-EM fibril structures from systemic AA amyloidosis reveal the species complementarity of pathological amyloids.</a> Nature Communications. 10 (1), 1104 (2019).</li><li>Radamaker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+light+chain-derived+amyloid+fibril+from+a+patient+with+systemic+AL+amyloidosis.">Cryo-EM structure of a light chain-derived amyloid fibril from a patient with systemic AL amyloidosis.</a> Nature Communications. 10 (1), 1103 (2019).</li></ol>

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Från en nischteknik har cryoET nu mognat till en utbredd metod för att utföra strukturella studier på cellulär och molekylär nivå med oöverträffadräckviddsupplösning 21,22. Den ständigt ökande efterfrågan på cryoEM-avbildning har satt press på de begränsade resurser som finns tillgängliga för att få tillgång till denna teknik. Trots öppnandet av ett antal nationella cryoEM-anläggningar och vetenskapliga instituts ansträngningar för att öka sin TEM-kapacitet för att stödja samhällets behov över hela världen är tillgången till cryoEM-instrument fortfarande begränsad och den tid som finns tillgänglig för datainsamling måste därför användas effektivt av användarna för att maximera avkastningen av varje mikroskopisession. Behovet av att förvärva hundratals tiltserier i kombination med den begränsade tid som finns tillgänglig för datainsamling krävde nya rutiner för bildförvärv för att uppnå bättre dataflöde utan att kompromissa med datakvaliteten. Den senaste utvecklingen inom arbetsflöden för hårdvara och bildbehandling har avsevärt ökat hastigheten på förvärvetav tiltserier 18,19, vilket resulterar i en dramatisk förändring av förhållandet mellan den tid som spenderas för att ställa in en förvärvspunkt och tid som behövs för det faktiska förvärvet av tiltserien. Sammantaget håller förfarandet för att inrätta förvärvspunkter på att bli en av de största flaskhalsarna för den uppnåeliga genomströmningen av cryoET-sessioner.
Det optimerade protokollet som presenteras här gjorde det möjligt för oss att i off-line-läge ställa in 171 positioner för automatiserat tomografiskt förvärv inom den första dagen av en cryoET-session medan mikroskopet var aktivt engagerat i andra operationer (t.ex. kvadratisk mappning, justering och automatiserad tiltserieförvärv), således utan att påverka mikroskoptiden som är tillgänglig för datainsamling. Förutom att maximera data flödet för en cryoET-session minskar den här pipelinen drastiskt den tid som användaren investerar i den förberedande fasen av en automatiserad data insamlings session. I det beskrivna protokollet ombeds användaren att bläddra bland de mappade rutnätsrutorna för att identifiera lämpliga intressanta regioner och lägga till dem i Serial EM Navigator som anskaffningspunkter. Alla mål bearbetas sedan automatiskt i batch inom SerialEM av PyEM-verktyget för produktion av de virtuella kartorna16. Den presenterade beräkningsmetoden är därför betydligt snabbare än att förvärva verkliga förankringskartor genom att eliminera väntetiderna i samband med scenrörelser, bildförvärv, förändring av bildförhållandena mellan Visa och Förhandsgranskning och genom eventuell upprepning av dessa steg samtidigt som de centrerades vid hög förstoring. Dessutom, eftersom varje förvärvad bild leder till ackumulering av elektrondos på föremålet av intresse23, minskar användningen av virtuella kartor för exakt omjustering av målen den strålningsskada som infördes i den förberedande fasen av en cryoET-session före det faktiska förvärvet av tiltserien. Protokollet som beskrivs här använder virtuella kartor för både mellanliggande och hög förstoring (förhandsversion respektive vy) för omjustering av målet före förvärvet av tilt-serien. Denna procedur kan enkelt ändras för att endast använda den mellanliggande förstoringsbilden när justeringsnoggrannheten är mindre viktig, till exempel när det gäller stora strukturer där den slutliga målnoggrannheten ärmindre oroande 10 eller för enskilda partikelanalysprover som är dåligt spridda på kryonätet som kräver användarens manuella val av varje anskaffningspunkt24, 25. I artikel 25 i eu 25 Slutligen underlättar en metod som bygger på off-line-användning av en dummy SerialEM-instans också installationen av förvärvspunkter genom fjärranslutning genom att minimera behovet av användarens fysiska närvaro vid mikroskopet, vilket möjliggör mer flexibilitet när det gäller anläggningens operativa organisation.
De senaste framstegen inom teknik och metoder för cryoET har drastiskt förbättrat hastigheten och tillförlitligheten hos automatiserade datainsamlingssessioner. Det krävs dock ytterligare utveckling för att ta itu med de återstående räntebegränsande stegen i denna metod. Framför allt håller det första steget i nät- och kvadratkartläggning nu på att bli en av de största flaskhalsarna i sessionsinstallationen, vilket genererar behovet av hårdvaruförbättringar som syftar till att öka hastigheten på mikroskopstegrörelser och bildförvärv av de direkta elektrondetektorerna. Dessutom kommer utvecklingen av maskininlärningsmetoder för att fullt ut automatisera processen för målidentifiering att vara avgörande för att eliminera behovet av användarnas visuella inspektion för att välja ut de regioner av intresse, ett tidskrävande förfarande som förlitar sig på användarnas expertis.

Kryogena elektronmikroskopimetoder (cryoEM) baseras på avbildning av biologiska prover med hjälp av ett transmissionselektronmikroskop (TEM) efter deras snabba vitrifiering, en provberedningsprocess som bevarar de molekylära och cellulära strukturerna hos exemplar i ett nära inbyggt och hydratiserat tillstånd1,2. I kryogen elektrontomografi (cryoET) uppnås en 3D-modell av det vitrifierade provet genom att förvärva ett antal bilder av samma intresseregion från olika riktningar, den så kallade tiltserien, följt av beräkningsrekonstruktionen av den tomografiska volymen3. Denna avancerade bildteknik har mognat till en kraftfull metod för strukturell undersökning av biologiska processer i samband med deras inhemska celluläramiljöer 4,5,6.
Förutom den strukturella analysen av det vitrifierade provet kan högupplösta rekonstruktioner av makromolekylära komplex som finns i flera kopior inom den tomografiska volymen erhållas genom tillämpning av subtomogram i genomsnitt5. Denna återuppbyggnadsstrategi bygger på iterativ anpassning och genomsnitt av delvolymer som innehållerintressestrukturen,och den syftar till att öka förhållandet mellan signaler och buller och upplösningen av den slutliga återuppbyggnaden7,8. Subtomogram i genomsnitt förlitar sig på insamling och bearbetning av en stor mängd data som ofta kräver förvärv av hundratals tiltserier med hjälp av avancerade TEMs med betungande driftskostnader.
För närvarande är installationen av sådana automatiserade cryoET-sessioner en tidskrävande process som vanligtvis förlitar sig på användarens manuellaingång 9,10,11. Vanligtvis identifieras mål genom visuell inspektion av det kartlagda rutnätet och ställs därefter in för automatiserad datainsamling. Användarens effektivitet vid identifiering av förvärvspunkter påverkas ofta av provets art och blir särskilt utmanande vid analys av renade makromolekyler med suboptimal koncentration eller vid sällsynta händelser i trånga cellulära miljöer, vilket innebär användning av korrelativa metoder12. Dessutom kräver aktuella arbetsflöden förvärv av bilder under uppsamling vid olika förstoringar som senare kommer att användas för exakt lokalisering och centrerad av målet under automatiseratförvärv 11,13,14. Dessa steg för omjustering med hög precision är avgörande för högupplösta program, som kräver att avbildningen utförs vid hög förstoring och kräver exakta centreringssteg för att behålla den intresseregion som finns inom det resulterande lilla synfältet. Sammanlagt har flera timmar av varje datainsamlingssession åtagit sig för detta tidskrävande förfarande under vilket TEM inte är engagerad i förvärv av tiltserier. Beroende på hur mycket tiltserier som krävs kan därför identifiering och uppsättning av anskaffningspunkter ha en betydande inverkan på den mikroskoptid som är tillgänglig för datainsamling under en cryoET-session.
Beskrivs här är ett optimerat protokoll baserat på SerialEMmjukvarupaket 15 och den senaste versionen PyEM programvara16 för att kartlägga rutnät, kartlägga rutnät kvadrater, välja mål och ställa in automatiserad datainsamling för storskalig tilt serie insamling. Det viktigaste konceptet med den här metoden är att förse SerialEM med beräkningsgenererade bilder av PyEM för varje förvärvsobjekt, så kallad virtuella kartor, för korrekt lokalisering och centrering av målet. För att få faktisk förvärvstid utförs valet av mål samt skapandet av de virtuella kartorna offline med hjälp av en andra dummy-instans av SerialEM, vilket frikopplar urvalsprocessen för förvärvsmål från TEM-verksamheten. Även om du inte tar itu med hur du ökardatakvaliteten 13,17 eller hastigheten för förvärv av tiltserier18,19, är detta protokoll främst inriktat på strategier för att optimera tidseffektiviteten hos storskaliga automatiserade cryoET-sessioner. Därför är implementeringen av det presenterade protokollet avsedd för de forskare som upprättar cryoET-datainsamlingsarbetsflöden som vill maximera avkastningen av automatiserat dataförvärv genom att öka mikroskoptiden som är tillgänglig för anskaffning av tiltserier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition

Kryogen elektrontomografi (cryoET) är en kraftfull metod för att studera 3D-strukturen hos biologiska prover i ett nära inbyggt tillstånd. Nuvarande toppmoderna cryoET i kombination med subtomogram genomsnitt analys möjliggör högupplöst strukturell bestämning av makromolekylära komplex som finns i flera kopior inom tomographic rekonstruktioner. Tomografiska experiment kräver vanligtvis att en stor mängd tiltserier förvärvas med hjälp av avancerade transmissionselektronmikroskop med viktiga driftskostnader. Även om genomströmningen och tillförlitligheten hos automatiserade datainsamlingsrutiner ständigt har förbättrats under de senaste åren, kan processen för att välja regioner av intresse där en tiltserie kommer att förvärvas inte enkelt automatiseras och den förlitar sig fortfarande på användarens manuella indata. Därför är idriftsordningen av en storskalig datainsamlingssession en tidskrävande procedur som avsevärt kan minska den återstående mikroskoptiden som är tillgänglig för förvärv av tiltserier. Här beskriver protokollet de nyligen utvecklade implementeringarna baserade på SerialEM-paketet och PyEM-programvaran som avsevärt förbättrar tidseffektiviteten för nätscreening och storskalig datainsamling i tiltserien. Det presenterade protokollet illustrerar hur du använder SerialEM-skriptfunktioner för att helt automatisera rutnätsmappning, grid square mapping och tilt series acquisition. Dessutom beskriver protokollet hur du använder PyEM för att välja ytterligare förvärvsmål i off-line-läge efter att automatiserad datainsamling har initierats. För att illustrera detta protokoll beskrivs dess tillämpning i samband med avancerade datainsamling av Sars-Cov-2 tilt-serien. Den presenterade rörledningen är särskilt lämpad för att maximera tidseffektiviteten hos tomografiexperiment som kräver ett noggrant urval av förvärvsmål och samtidigt en stor mängd tiltserier som ska samlas in.

Detta förfarande användes för att förvärva Sars-Cov-2 tilt-serien som beskrivs i Turonova m.fl. 202020; hela datauppsättningen producerades med hjälp av tre distinkta rutnät över tre mikroskopisessioner på EMBL Heidelberg. Den aktuella studien kommer att fokusera på och beskriva den första 3-dagars (~ 72 h) sessionen som körs med det första rutnätet.
Efter att hela rutnätet kartlagts vid låg förstoring (~10 min, se steg 2), valdes 71 lämpliga rutor ut på rutnätskartan och kartor över medelstora förstoringar(kvadratkartor)förvärvades med inställningar (förstoring, exponering, defokus) som möjliggör direkt visualisering och identifiering av urvalet av intresse, coronavirus i detta fall (se steg 4) (Figur 1A). Förvärvstiden var ~3 min per kvadrat, 3 h 45 min totalt.
Så snart den första fyrkantiga kartan skapades öppnades en dummy SerialEM-instans (utan någon kontroll på kamera eller mikroskop) på en separat dator för att visualisera den fyrkantiga kartan och lägga till punkter på mål som är lämpliga för anskaffning av tiltserier (se steg 5) (figur 1B). Nyligen förvärvade kvadratiska kartor hämtades genom sammanslagning av den aktuella dummy SerialEM navigatören med navigatören från den förvärvande SerialEM instansen. Efter ~2 h av grid square förvärv och urval, 50 ursprungliga mål kunde identifieras.
När de fyrkantiga kartförvärven hade slutförts, SerialEM låg dos inrättades och referensvy- och förhandsgranskningsbilder togs och sparades som kartor (se steg 3). De senare kartorna kan sedan användas omedelbart på dummy SerialEM-instansen för att generera kartor över de 50 valda målen med PyEM-programvarusviten från motsvarande fyrkantiga kartbilder (figur 1C) och virtual preview (figur 1D)under en bearbetningstid på ~ 30 min (se steg 6). Denna bearbetningstid på dummy SerialEM-sessionen användes för att utföra slutliga förberedelser av mikroskopet för förvärv: energifilterjustering, ny kameravinstreferensbildförvärv, astigmatism- och komafri justering av objektivlinsen.
När mikroskopjusteringen var klar och virtuella kartor från de 50 ursprungliga målen genererades, inrättades den faktiska SerialEM-navigatören som skulle användas för förvärv (se steg 8), fokus- och spårpositioner sattes (steg 9) och förvärvet av tiltserien kunde startas (se steg 10 och 11). Kartorna för virtuell vy (figur 1C) användes för en inledande centrering av målet (figur 1E) följt av en slutlig centrering som utfördes vid den faktiska anskaffningsförstoringen av tiltserien (Figur 1F) med hjälp av virtual preview-kartan (Figur 1D).
Från och med rutnätskartläggningen klockan 9:30 på morgonen började förvärvet av tiltserien för de 50 ursprungliga målen vid ungefär 15:00. Med de inställningar som används för tomografisk förvärv (se referensen för detaljer) tog en tiltserie ~ 20 min att förvärva, med tillräckligt med mål för att sedan springa igenom hela natten. Medan förvärvet på var igång kunde resten av de fyrkantiga kartorna inspekteras och fler mål läggas till, fortfarande offline via dummy SerialEM-instansen. Ytterligare 121 mål valdes ut bland de återstående kvadratkartorna och lades till i förvärvet SerialEM navigatör efter att virtuella kartor hade skapats för dessa nya mål, tillräckligt för att köras fram till slutförandet av 72 h-sessionen.
Den här proceduren (sammanfattad i figur 2) tillät, på en enda arbetsdag, inställningen av 171 mål för automatiserade tomografiska förvärv för en 72 timmar (3 dagar) mikroskopsession.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62383/62383fig01.jpg"> Bild 1: Exempel på fyrkantig karta med representativa virtuella kartor och motsvarande förvärv eftercentrerad. (A) Representativ kvadratkarta över ett Sars-Cov-2 cryoEM-rutnät som används i Turonovam.fl. Fyra regioner av intresse markeras med ett rött kors. Mikroskopförstoring är 2250x. (B) Beskär ut från den fyrkantiga kartan som markerar de områden som användes för att generera kartorna Virtuell vy (orange) och Virtuell förhandsgranskning (gul) för den valda kartan mål (röda korset) (C). (D) Karta över virtuell förhandsgranskning. (E) Förvärv av faktisk vy efter centrerad med hjälp av virtual view-kartan som referens. Mikroskopförstoring är 11 500x. (F) 0° tilt förvärv från tilt serien efter centrering med hjälp av virtual preview karta som referens. Mikroskopförstoring är 64 000x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62383/62383fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62383/62383fig02.jpg"> Bild 2: Arbetsflöde för CryoET-session med SerialEM med PyEM-verktyg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62383/62383fig02large.jpg" target="_blank"></a>

Watch this Scientific Journal Video about Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition at JoVE.com

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Den ökande efterfrågan på storskalig datainsamling i kryogen elektrontomografi kräver hög genomströmning av bildförvärvsrutiner. Beskrivs här är ett protokoll som implementerar den senaste utvecklingen av avancerade förvärvsstrategier som syftar till att maximera tidseffektiviteten och genomströmningen av tomografisk datainsamling.

Strategier för optimering av kryogen elektrontomografi dataförvärv

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Installationen av en storskalig datainsamlingssession är en tidskrävande procedur som avsevärt kan minska den återstående mikroskoptiden som är tillgänglig för anskaffning av tiltserier. Den här metoden möjliggör snabb installation av storskalig automatiserad datortomografidatainsamling för att maximera tidseffektiviteten för datortomografiexperiment som kräver ett noggrant urval av förvärvsmål. Börja med att öppna en dummy SerialEM-instans.När den första rutnäts kvadraten har mappats använder du alternativet SerialEM navigatörsmeny för att se montage i dummy SerialEM-instansen. Dubbelklicka på navigatörsfönstret för att öppna rutnätets fyrkantiga karta. Sök på kartan och använd alternativet dummy SerialEM navigatör lägga till punkter för att lägga till bildförvärvspunkter på målet för ränta.När du har mappat de nya rutorna sparar du navigatörsfilen och sammanfogar navigatören igen. Fortsätt tills alla rutnätsrutor har mappats. Sammanfoga navigatörfilen igen med dummy SerialEM-instansen.Kör skriptet Pi EM virtual maps från menyn dummy SerialEM. Välj verktyg och välj virtuella ankarkarkarmappningar. Detta kan ta lite tid beroende på storleken och mängden av rutnätets fyrkantiga kartor, liksom binning av vy- och förhandsgranskningsmappningar.För att säkerställa korrekt mikroskopprestanda, använd samma förstorings- och strålstorleksinställning för datainsamling i följande ordning. Kör SerialEM komafri justering med CTF. Infoga och centrera en objektiv bländare.Kör SerialEM korrekt astigmatism av CTF och GIF snabb melodi. Öppna den nya navigatörfilen i SerialEM. Avval alla A-punkter.Välj de första visningsmapporna. Välj dölj. Klicka på A två gånger och avval avkollaps.Välj den första visningskartapositionen. Tryck på Skift T och välj sedan den allra sista visningskartapositionen och tryck på Skift T igen. Välj enstaka rambilder i filens egenskaper för att öppna en dialogruta.I dialogrutan nästa filegenskaper väljer du önskade parametrar enligt bildbehoven och instrumentinställningarna. När du uppmanas att göra det, ge ett namn med ett nummer och klicka på spara. Ställ in styrenheten för tiltserien för den första TS-positionen.När du är klar klickar du på OK för att ställa in dessa parametrar för alla tiltserier efter den här anskaffningsartikeln. Alla förhandsgranskningskartor är nu markerade som TS med ett numrerat filnamn. Om det behövs ställer du in fokus/spåravstånd för varje mål.Dubbelklicka på visningskartan för att läsa in den. Välj förhandsgranskningskartan i navigatörslistan. Välj sedan redigera fokus i navigatörsfönstret.I kontrollpanelen med låg dos avvalt roterar du inter-area axel för att placera försök och fokusera längs scenens lutningsaxel. Klicka på önskad region i den inlästa vykartan för att ställa in fokustestpositionen för den här tiltserien och se till att navigatörsobjektet har TSP-uppsättning. Upprepa proceduren för alla objekt.Redigera fokusintervallet i skriptet PreTomo som körs före varje tiltserie. På menyn SerialEM tilt series kontrollerar du kör skript i TS och väljer skriptnumret för DuringTomo-skriptet under varje lutning. Kontrollera kvävetankens nivå och om autolastaren turbo av är vald.Kontrollera det lediga utrymmet för datalagring. På SerialEM-filmenyn avvals kontinuerlig sparning för loggfilen. Varje tiltserie får sin egen loggfil.När du har klickat på hämta på objekt i navigeringsmenyn kör du skriptet PreTomo. Välj primär uppgift hämta tilt serie och välj sedan kör skript efter PostTomo. Välj stäng kolumnventiler i slutet och skicka e-post i slutet och klicka sedan på gå.71 lämpliga rutor valdes ut på rutnätskartan vid lägre förstoring. Medelstorifieringskartor förvärvades med inställningar som möjliggör direkt visualisering och identifiering av urvalet av intresse, coronavirus i detta fall. Förvärvstiden var totalt tre minuter per kvadrat, tre timmar och 45 minuter.När den första fyrkantiga kartan skapades öppnades en dummy SerialEM-instans på en separat dator för att visualisera den fyrkantiga kartan och lägga till punkter på mål som är lämpliga för tiltserieförvärv. SerialEM låg dos inrättades och referensvy och förhandsgranskningsbilder togs och sparades som kartor. De senare kartorna kan sedan användas omedelbart på dummy SerialEM-instansen för att generera den virtuella vyn och den virtuella förhandsgranskningen från motsvarande kvadratiska kartbilder.De virtuella vymappningsmapparna användes för en inledande centrering av målet, följt av en slutlig centrering som utfördes vid den faktiska anskaffningsförstoringen av tiltserien med hjälp av den virtuella förhandsgranskningskartan. Användare bör ge sig själva gott om tid att utforska provlandskapet. Efter att ha sökt på några kartor utvecklar man en bättre känsla för områden av god kvalitet att samla in data från.

Research

JoVE Journal

Biology

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Gör-det-själv Device för återhämtning av kryokonserverade prover Tappade misstag i Kryogena Lagringstankar

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

Polymerase Chain Reaction: Basic protokoll Plus Felsökning och optimering strategier

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Visualisering av ATP-syntas dimerer i Mitokondrier från Electron Cryo-tomografi

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Beredning och övervakning av Thick Biologiska Prover av Scanning transmissionselektronmikroskopi Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Förfarande och nyckel optimering strategier för en automatiserad kapillär elektrofores-baserad Immunoassay metod

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D mitokondriell ultrastruktur Drosophila indirekta flyg muskel avslöjades av Serial-avsnitt Electron tomografi

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisering av DNA packning i cyanobakterier av högspännings-Cryo-elektron tomografi

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kvantifiering av platsspecifika Protein lysin acetylering och Succinylation stökiometri använder Data-oberoende förvärv masspektrometri

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

Optimering av kristalltillväxt för neutronmakromolekylär kristallografi

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Matristomografiarbetsflöde för riktad förvärv av volyminformation med scanningelektronmikroskopi

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...