Name: isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting at JoVE.com

نود أن نشكر الأعضاء في علم الأمراض وجراحة الأعصاب في كلية إيكان للطب في ماونت سيناي للمساعدة في شراء أنسجة المخ غير المحددة و ISMMS Flow Cytometry CORE للحصول على مشورة الخبراء. تم تمويل الدراسة جزئيا من قبل NIH RF1DA048810 و R01NS106229 و R03NS101581 (إلى N.M.T.) و R61DA048207 (إلى S.A).

ملاحظة: يضمن برنامج حماية المواد البشرية في كلية إيكان للطب في ماونت سيناي (ISMMS) ومجلس المراجعة المؤسسية (IRB) التابع لها السلوك الأخلاقي للبحث والامتثال للوائح الفيدرالية والولائية والمؤسسية. في هذه الدراسة ، تم إلغاء تحديد جميع عينات ما بعد الوفاة المستخدمة ، وتم الحصول عليها بموجب المواف...

<ol>
	<li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain.">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).</li><li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PsychENCODE+project.">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).</li><li>Tome-Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+isolation+and+transcriptomic+profiling+informs+glial+pathology+in+human+temporal+lobe+epilepsy.">Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse.">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+Is+an+astrocyte-specific+nuclear+marker+in+the+adult+brain+outside+the+neurogenic+regions.">SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).</li><li>Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebral+cortical+neurogenesis+by+the+Pax6+transcription+factor.">Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).</li><li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurogenesis-controlling+factor,+Pax6,+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes.">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li><li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus.">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li><li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development.">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li><li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX6:+25th+anniversary+and+more+to+learn.">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li><li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy.">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li><li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue:+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium.">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li><li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+&#945;A.">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin &#945;A.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li></ol>

وينبغي وضع اللمسات الأخيرة على التصميم التجريبي وفقا للبروتوكول المحدد بعد النظر في عدة عوامل بيولوجية وتقنية. يتم تجميد عينات الأنسجة الأولية طازجة ، دون أن يتم إصلاحها ، ويفضل أن يكون لها فاصل زمني قصير لجمع ما بعد الوفاة لتحقيق أقصى قدر من استعادة النوى. استنادا إلى الخبرة ، يسمح مؤشر م...

لا يزال التعقيد الجزيئي للخلايا النجمية البشرية غير محدد بشكل جيد في الأنسجة الأولية ، مما يتطلب أدوات أفضل لعزلها وتوصيفها بدقة عالية ، سواء في الصحة أو المرض. لقد ثبت أن فصل الخلايا العصبية البشرية السليمة والدبقية عن مكانتها أمر صعب بسبب محدودية الوصول إلى عينات أنسجة المخ الجديدة ، والطبيعة المترابطة بشدة للعمليات الدبقية والعصبية ، والتنشيط الخلوي الحتمي أثناء المعالجة ، وكلها تحد من التوصيف الجزيئي لهذه الأنواع من الخلايا خارج الجسم الحي1 . ظهر فرز النوى المنشطة بالفلور (FANS) كبديل لفرز الخلايا الحية ، مما مكن من التفكك ووضع العلامات المناعية لمجموعات النوى من الأنسجة المجمدة. في العقد الماضي ، أصبحت FANS تستخدم على نطاق واسع لعزل وتوصيف مجموعات النوى العصبية البشرية (NeuN +) في مجموعة متنوعة من عينات الدماغ والمناطق التشريحية1،2،3،4.
ومع ذلك، كانت الطرق المماثلة لعزل مجموعات فرعية محددة من النوى الدبقية من القشرة البشرية محدودة، مما أدى إلى نقص نسبي في التطور في فهم تعقيد الخلايا النجمية في كل من الأنسجة الطبيعية والمريضة. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تكييف بروتوكول نشر سابقا لعزل مجموعات الخلايا العصبية البشرية باستخدام FANS4 ، وتم التحقق من صحة طريقة لإثراء الخلايا النجمية (وللأسلاف oligodendroglial) باستخدام مزيج من الأجسام المضادة الثلاثية ، والتقاط الخلايا النجمية في كل من ظروف الراحة والتفاعل5. لإثراء الخلايا النجمية على وجه التحديد في الكسر NeuN- ، تم استخدام الأجسام المضادة ضد أحد عاملي النسخ المعروفين بالتعبير عنهما بشكل تفاضلي عبر مجموعات الخلايا النجمية ، PAX6 أو عامل النسخ SRY-box 9 (SOX9) 6,7. يتم التعبير عن PAX6 بشكل كبير خلال نمو الجنين المبكر داخل السلف الشبيه بالدبقية الشعاعية في المناطق الجرثومية ويساهم في كل من تكوين الخلايا العصبية وتكوين الخلايا الدبقية8،9،10،11 وكذلك في مواصفات الخلايا العصبية الشبكية12. في البالغين ، يتم التعبير عن PAX6 بشكل تفاضلي في الخلايا النجمية البشريةالمستريحة 6 ويظهر تعبيرا مشتركا للبروتين مع البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) في الخلايا النجمية لأنسجة الصرع البشري13.
يصف هذا البروتوكول العزلة المتزامنة للخلايا العصبية المخية الجديدة ومجموعات النوى الغنية بالخلايا النجمية بواسطة FANS. يتم أولا فصل أنسجة ما بعد الوفاة الطازجة (غير الثابتة) المجمدة (أي المجمدة الطازجة) التي تم جمعها من القشرة الدماغية البالغة ميكانيكيا وكيميائيا. بعد التحلل والطرد المركزي الفائق في تدرج السكروز ، يتم التخلص من المكونات السيتوبلازمية وخارج الخلية أثناء الاحتفاظ بالنواة. ثم يتم تصنيف النوى بأجسام مضادة نووية مترافقة بشكل فلوري تتوافق مع السلالات المستهدفة المطلوبة ويتم فرزها باستخدام المراوح. باتباع هذا النهج ، يتم إثبات إثراء الخلايا النجمية في مجموعات PAX6 + NeuN التي تم جمعها ، والتي تم التحقق من صحتها من خلال لوحة qPCR المستهدفة وكذلك من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي النووي في المصب.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS pH 7.2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>70013073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377A5MI</td>
			<td>mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN50A4MI</td>
			<td>mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Counting Chamber</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C614-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 40 &#181;M</td>
			<td>SP Scienceware</td>
			<td>136800040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Library Kit</td>
			<td>Illumina, Nextera</td>
			<td>FC-121&#8211;1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>WHEATON</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>BD FACSAria III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M13-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP234705J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian</td>
			<td>Clontech Laboratories</td>
			<td>635005</td>
			<td>Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J22638AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>non-ionic surfactant in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>reagent for isolation of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter Optima XE-100</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td>referred to as distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting

لا يزال تعقيد الخلايا النجمية البشرية غير محدد بشكل جيد في الأنسجة البشرية الأولية ، مما يتطلب أدوات أفضل لعزلها وتوصيفها الجزيئي. يمكن استخدام فرز النوى المنشطة بالفلور (FANS) لعزل ودراسة مجموعات النوى العصبية البشرية (NeuN+) بنجاح من الأنسجة الأرشيفية المجمدة ، وبالتالي تجنب المشاكل المرتبطة بالتعامل مع الأنسجة الطازجة. ومع ذلك ، لا توجد جهود لعزل الخلايا الدبقية النجمية بالمثل عن العنصر غير العصبي (NeuN-). تستخدم استراتيجية وضع العلامات المناعية التي تم تطويرها مؤخرا والتي تم التحقق منها ثلاثة أجسام مضادة لعامل النسخ لعزل مجموعات النوى العصبية المخصبة (NeuN+) في وقت واحد من الخلايا النجمية (بروتين الصندوق المقترن 6 (PAX6) + NeuN-) ، وسلف الخلايا قليلة التغصن (OLIG2 + NeuN-) من أنسجة القشرة المخية الجديدة البشرية الصدغية غير المريضة والطازجة (غير الثابتة) المجمدة بعد الوفاة.
وقد تبين أن هذه التقنية مفيدة لتوصيف التغييرات في النسخ الخاصة بنوع الخلية في القشرة المخية الجديدة للصرع المرضي الأساسي. أكدت التحليلات النسخية أن المجموعات المصنفة من PAX6 + NeuN يتم تخصيبها بقوة لعلامات الخلايا النجمية الشاملة والتقاط الخلايا النجمية في كل من ظروف الراحة والتفاعل. تصف هذه الورقة منهجية FANS لعزل مجموعات النوى الغنية بالخلايا النجمية عن القشرة البشرية المجمدة الطازجة ، بما في ذلك تفكك الأنسجة إلى تعليق أحادي النواة (sn) ؛ وضع علامات مناعية على النوى بالأجسام المضادة المضادة ل NeuN و PAX6 المترافقة بالفلورسنت ؛ استراتيجيات بوابات المراوح ومقاييس مراقبة الجودة لتحسين الحساسية والخصوصية أثناء الفرز وتأكيد إثراء الخلايا النجمية ؛ وأوصت بالشراء لتسلسل إمكانية الوصول إلى النسخ النهائي والكروماتين بدقة مجمعة أو sn. ينطبق هذا البروتوكول على العينات القشرية البشرية غير الميتة والمجمدة حديثا مع أمراض مختلفة وجمع الأنسجة الموصى بها بعد الوفاة في غضون 24 ساعة.

تم جمع النوى من أنسجة القشرة المخية الجديدة الصدغية الطازجة (غير الثابتة) المجمدة المفاجئة مع وقت جمع ما بعد الوفاة من 12 ساعة. بعد تفكك الأنسجة إلى تعليق النوى ، تم احتضان العينات بأجسام مضادة ضد NeuN و PAX6 و OLIG2 ، وتم فرزها وفقا للبوابة الموضحة في الشكل 1 والشكل 2</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting at JoVE.com

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

لقد طورنا طريقة تثري وتعزل مجموعات الخلايا النجمية البشرية عن الأنسجة المجمدة الطازجة لاستخدامها في التحليلات الجزيئية النهائية.

عزل مجموعات الخلايا النجمية البشرية البالغة عن القشرة الطازجة المجمدة باستخدام فرز النوى المنشطة بالفلور

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

يمكن أن يساعد هذا البروتوكول العلماء المهتمين بدراسة الوظيفة الجزيئية للخلايا النجمية البشرية في مكانتها الأصلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بعزل وإثراء نوع معين من الخلايا ، الخلايا النجمية البالغة من عينات أنسجة المخ البشرية السائبة باستخدام فرز النوى المنشطة بالفلور. يمكن تطبيق هذه المنهجية على عزل أنواع الخلايا الأخرى عن القشرة المخية الجديدة البشرية ، مثل الخلايا العصبية والخلايا السلفية قليلة التغصن باستخدام أجسام مضادة أخرى مترافقة مع الفلورسنت.ابدأ في تشريح ما يقرب من 200 إلى 400 ملليغرام من الأنسجة من عينة أنسجة قشرة بشرية مجمدة جديدة. ضع المنديل في دزاز مناديل زجاجية سعة سبعة ملليلتر يحتوي على أربعة ملليلترات من المخزن المؤقت للتحلل البارد على الجليد وطحن الأنسجة حوالي 50 مرة. انقل المتجانس إلى أنبوب بولي بروبيلين فائق الطرد المركزي سعة 12 ملليلتر.استخدم ماصة سعة خمسة ملليلتر لإضافة 6.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للسكروز البارد إلى أسفل أنبوب الطرد المركزي الفائق دون إزعاج الواجهة بين السكروز وتجانس الأنسجة. لجمع النوى ، قم بالطرد المركزي الفائق للليزات لمدة ساعة واحدة عند 101،814 مرة G وقم بشفط السوبرنات والحطام بعناية دون إزعاج الكرية. أضف 0.1٪ BSA في PBS إلى أنبوب جهاز الطرد المركزي الفائق لحضانة لمدة 10 دقائق على الجليد قبل إعادة تعليق حبيبات النوى.بعد ذلك ، استخدم التربان الأزرق لتصور النوى السليمة تحت المجهر الضوئي وللتأكد من أن التركيز أعلى من 10 إلى النوى الخامسة لكل ملليلتر للفرز المنشط بالتألق للنوى المعزولة ، أضف ما يقرب من 20 ميكرولتر من العينة المعاد تعليقها إلى محلول الأجسام المضادة الذي يحتوي على Alexa fluor 555 من الأجسام المضادة المضادة للفأر المترافق مع NeuN. أضف ما يقرب من 20 ميكرولتر من العينة المعاد تعليقها إلى محلول الأجسام المضادة الذي يحتوي على أجسام مضادة للماوس المترافق مع APC PAX6. بعد حضانة لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية مع الاهتزاز ، محمية من الضوء ، أضف DAPI بنسبة 1: 1000 إلى جميع العينات والضوابط.لتضمين نوى ذات حجم مناسب واستبعاد خلايا الدم الحمراء والحطام ، استخدم أنبوب تحكم لبوابة الخلايا من مناطق تشتتها الأمامية والجانبية. لتحديد مجموعة النوى المفردة، قم بالبوابة حسب منطقة التشتت الأمامي مقابل عرض أو ارتفاع التشتت الأمامي ومنطقة التشتت الجانبي مقابل عرض أو ارتفاع التشتت الجانبي. بوابة من قبل DAPI لتشمل فقط النوى السليمة المفردة واستبعاد أي حطام ومزدوجات.بعد وضع البوابة وفقا لأي عناصر تحكم إضافية في التألق، قم بتشغيل عينة التحكم DAPI فقط. قم بتشغيل عنصر التحكم NeuN Alexa fluor 555 فقط لتحديد قطع التلطيخ الإيجابي NeuN في قناة Alexa fluor 555. قم بتشغيل عنصر تحكم PAX6 APC فقط لتحديد قطع التلطيخ الإيجابي PAX6 في قناة APC.بعد تشغيل جميع عناصر التحكم ، قم ببوابة الخلايا الإيجابية NeuN لجمع الخلايا العصبية وبوابة الخلايا الإيجابية PAX6 مع السكان السالبين NeuN لجمع الخلايا النجمية. قم ببوابة وجمع أي مجموعات دبقية إضافية ذات أهمية من السكان السالبين PAX6 من NeuN. لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة السائبة ، بعد جمع 50،000 إلى 500،000 نواة في PBS المكمل بنسبة 0.04٪ BSA ، أضف ملليلترين من محلول السكروز ، و 50 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم المولي الواحد ، و 30 ميكرولتر من خلات المغنيسيوم ذات المولي الواحد إلى العينة.اجعل الحجم النهائي للتعليق يصل إلى 10 ملليلتر باستخدام PBS. امزج محتويات الأنبوب عن طريق الانعكاس واحتضن التفاعل على الجليد لمدة 15 دقيقة. قم بتكسير النوى عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق النوى في ملليلتر واحد من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي.ثم ، دوامة الأنبوب ، وتجميد العينة على الجليد الجاف ، وتخزين النوى عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لتسلسل الكروماتين المقبول للترانسبوزاز أحادي النواة السائبة ، قم بجمع 50،000 إلى 75،000 نواة في PBS مكمل بنسبة 0.04٪ BSA في أنبوب طرد مركزي دقيق مغلف ب 5٪ BSA وتجميد النوى حتى تحليلها في المصب. يمكن فرز مجموعات النوى السلفية العصبية والخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن من عينة جديدة من القشرة المخية الجديدة الصدغية البشرية المجمدة بعد الوفاة كما هو موضح.أعطت دراسات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة مزيدا من الأولوية ل PAX6 كعامل نسخ نووي أعلى يتم التعبير عنه بشكل تفاضلي عبر كل من المجموعات الفرعية للخلايا النجمية البالغة البروتوبلازمية والليفية. بعد الفرز ، يمكن وصف تغييرات النسخ الخاصة بنوع الخلية في القشرة المخية الجديدة للصرع المرضي الأساسي. في هذا التحليل ، أكدت التحليلات النسخية أن المجموعات السكانية الإيجابية ل NeuN إيجابية PAX6 تم إثراؤها بقوة لعلامات الخلايا النجمية واستنفدت للعلامات العصبية.يمكن استخدام تلطيخ التألق المناعي لتأكيد التوطين المشترك ل PAX6 مع البروتين الحمضي الليفي الدبقي في الخلايا النجمية القشرية البشرية. ترتبط فترات ما بعد الوفاة الأقصر باستعادة أكبر للنوى السليمة من عينات الأنسجة الطازجة. يمكن استرداد غلة عالية من النوى السليمة من الأنسجة المجمدة حتى 24 ساعة بعد الوفاة ، ولكن في 30 ساعة ، يمكن استرداد عدد قليل جدا من النوى السليمة.أهم شيء يجب تذكره هو الحصول على السكان الإيجابيين PAX6 من السكان السلبيين ل NeuN ، لأن هناك خلايا عصبية تعبر أيضا عن PAX6 ، ونريد استبعاد تلك. سمحت هذه التقنية أيضا بدراسة الخلايا النجمية في عينات الدماغ الجراحية للصرع ، مما زاد من توضيح عدم التنظيم الجزيئي للخلايا النجمية البشرية في سياق مكانة مرضية محددة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

وهو الإجراء الأمثل لالإسفار تنشيط عزل الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) فرز الأسلاف العصبية الاستقلال الذاتي من الجهاز التنفسي والهضمي من الفئران الجنينية

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

التصوير الوظيفي للسمعي اللحاء في القطط الكبار باستخدام الحقل عالي الرنين المغناطيسي الوظيفي

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

عزل بالسكان خلية متميزة من المخيخ تطوير من تسليخ مجهري

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

باستخدام الإسفار خلية المنشط الفرز لفحص الخلية من نوع محدد التعبير الجيني في الأنسجة دماغ الفئران

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) وجين تحليل التعبير عن فوس، معربا عن الخلايا العصبية من الطازجة والمجمدة الأنسجة دماغ الفئران

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

الأمثل لالتقاط الليزر ميكروديسيكشن لعزل Ganglia المعوي من الأنسجة البشرية الطازجة المجمدة

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

عزل نويات الحبل الشوكي الكبار لتسلسل الحمض النووي الريبي المفرد-نواة موازية على نطاق واسع

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

الخلايا الاساسيه الثقافة المنقية جابايرجيك أو الخلايا العصبية جلوتاميجيك أنشئت من خلال الفرز الخلية المنشطة الفلورية

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

الحصول على ميكروجليا الإنسان من أنسجة الدماغ البشري الكبار

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

الأنسجة المعالجة بالفرز الإشعاعي للخلايا المنشطة بالتألق (FACS-RTT) لتحديد الأصل الخلوي للإشارة المشعة

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...