Name: isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting at JoVE.com

אנו רוצים להודות לחברים בפתולוגיה ונוירוכירורגיה בבית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני על העזרה ברכישת רקמת מוח שלא זוהתה ול-Flow Cytometry CORE של ISMMS על ייעוץ מומחה. המחקר מומן בחלקו על ידי NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (ל- N.M.T.) ו- R61DA048207 (ל- S.A.).

הערה: התוכנית להגנה על נבדקים אנושיים בבית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני (ISMMS) ומועצת הביקורת המוסדית שלה (IRB) מבטיחה את ההתנהלות האתית של מחקר ועמידה בתקנות פדרליות, מדינתיות ומוסדיות. במחקר זה, כל הדגימות שלאחר המוות שבהן נעשה שימוש לא זוהו, התקבלו בהסכמה מתאימה באמצעות הביו-רפוזיטור, והיו ...

<ol>
	<li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain.">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).</li><li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PsychENCODE+project.">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).</li><li>Tome-Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+isolation+and+transcriptomic+profiling+informs+glial+pathology+in+human+temporal+lobe+epilepsy.">Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse.">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+Is+an+astrocyte-specific+nuclear+marker+in+the+adult+brain+outside+the+neurogenic+regions.">SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).</li><li>Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebral+cortical+neurogenesis+by+the+Pax6+transcription+factor.">Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).</li><li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurogenesis-controlling+factor,+Pax6,+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes.">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li><li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus.">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li><li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development.">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li><li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX6:+25th+anniversary+and+more+to+learn.">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li><li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy.">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li><li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue:+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium.">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li><li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+&#945;A.">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin &#945;A.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li></ol>

יש לסיים את התכנון הניסויי על פי הפרוטוקול המתואר לאחר ששקל מספר גורמים ביולוגיים וטכניים. דגימות הרקמות המתחילות מוקפאות טריות, מבלי שתוקנו, ועדיף שיהיה להן מרווח איסוף קצר לאחר המוות כדי למקסם את התאוששות הגרעינים. בהתבסס על ניסיון, PMI של עד 24 שעות מאפשר התאוששות גרעינים נאותה; עם זאת, PMI ?...

המורכבות המולקולרית של האסטרוציטים האנושיים נותרה לא מוגדרת היטב ברקמות הראשוניות, ודורשת כלים טובים יותר לבידוד ולאפיון שלהם ברזולוציה גבוהה, הן בבריאות והן במחלות. הפרדת תאי עצב אנושיים וגליה שלמים מהנישה שלהם הוכחה כקשה בשל גישה מוגבלת של דגימות רקמת מוח טריות, האופי המקושר בכבדות של תהליכי גליה ונוירונים, והפעלה תאית בלתי נמנעת במהלך העיבוד, כל אלה מגבילים את האפיון המולקולרי של סוגי תאים אלה ex vivo1 . מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FANS) התגלה כחלופה למיון תאים חיים, המאפשר דיסוציאציה ואימונו-תיוג של אוכלוסיות גרעינים מרקמה קפואה. בעשור האחרון, FANS הפך לשימוש נרחב לבידוד ואפיון מולקולרי של אוכלוסיות גרעינים עצביים אנושיים (NeuN+) במגוון דגימות מוח ואזורים אנטומיים 1,2,3,4.
עם זאת, שיטות דומות לבידוד תת-אוכלוסיות של גרעיני גליה ספציפיים מקליפת המוח האנושית היו מוגבלות, מה שהוביל לחוסר תחכום יחסי בהבנת מורכבות האסטרוציטים ברקמות נורמליות וחולות כאחד. לשם כך, פרוטוקול שפורסם בעבר הותאם לבידוד אוכלוסיות נוירונים אנושיות באמצעות FANS4, ואומתה שיטה להעשרתם עבור אסטרוציטים (ועבור אבות אוליגודנדרוגליאליים) באמצעות שילוב נוגדנים משולש, לכידת אסטרוציטים הן בתנאי מנוחה והן בתנאים תגובתיים5. כדי להעשיר באופן ספציפי עבור אסטרוציטים בשבר ה-NeuN, נעשה שימוש בנוגדנים כנגד אחד משני גורמי שעתוק הידועים כמבוטאים באופן דיפרנציאלי בין אוכלוסיות אסטרוציטים, PAX6 או גורם שעתוק תיבת SRY 9 (SOX9)6,7. PAX6 מתבטאת מאוד במהלך ההתפתחות המוקדמת של העובר בתוך אבות דמויי גליה רדיאליים באזורי חיידקים ותורמת הן לנוירוגנזה והן לגליוגנזה 8,9,10,11, כמו גם למפרט העצבי ברשתית 12. במבוגר, PAX6 מתבטא יתר על המידה במנוחה של אסטרוציטים אנושיים6 ומראה ביטוי משותף של חלבון עם חלבון חומצי פרפור גלי (GFAP) באסטרוציטים של רקמת אפילפסיה אנושית13.
פרוטוקול זה מתאר בידוד סימולטני של אוכלוסיות גרעינים ניאו-קורטיקליים עצביים ואסטרוציטים מועשרים על ידי FANS. רקמה טרייה (לא קפואה) (כלומר, קפואה-טרייה) לאחר המוות שנאספה מקליפת המוח הבוגרת מנותקת תחילה מכנית וכימית. לאחר תזה ואולטרה-צנטריפוגציה בשיפוע סוכרוז, הרכיבים הציטופלסמיים והחוץ-תאיים מושלכים בעוד הגרעינים נשמרים. לאחר מכן גרעינים מסומנים בנוגדנים גרעיניים מצומדים פלואורסצנטית המתאימים לשושלות המטרה הרצויות וממוינים באמצעות FANS. בעקבות גישה זו, העשרת האסטרוציטים מודגמת באוכלוסיות PAX6+NeuN שנאספו, ומאומתת הן על ידי לוח qPCR ממוקד והן על ידי ריצוף RNA גרעיני במורד הזרם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS pH 7.2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>70013073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377A5MI</td>
			<td>mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN50A4MI</td>
			<td>mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Counting Chamber</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C614-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 40 &#181;M</td>
			<td>SP Scienceware</td>
			<td>136800040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Library Kit</td>
			<td>Illumina, Nextera</td>
			<td>FC-121&#8211;1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>WHEATON</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>BD FACSAria III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M13-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP234705J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian</td>
			<td>Clontech Laboratories</td>
			<td>635005</td>
			<td>Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J22638AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>non-ionic surfactant in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>reagent for isolation of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter Optima XE-100</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td>referred to as distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting

המורכבות של האסטרוציטים האנושיים נותרה לא מוגדרת היטב ברקמה האנושית הראשונית, ודורשת כלים טובים יותר לבידוד ולאפיון המולקולרי שלהם. ניתן להשתמש במיון גרעינים המופעלים על-ידי פלואורסצנציה (FANS) כדי לבודד ולחקור בהצלחה אוכלוסיות גרעינים עצביים אנושיים (NeuN+) מרקמה ארכיונית קפואה, ובכך להימנע מבעיות הקשורות לטיפול ברקמות טריות. עם זאת, חסרים מאמצים לבודד באופן דומה את האסטרוגליה מהאלמנט הלא-עצבי (NeuN-). אסטרטגיית תיוג אימונולוג שפותחה ואומתה לאחרונה משתמשת בשלושה נוגדנים של גורמי שעתוק כדי לבודד בו זמנית אוכלוסיות של גרעינים מועשרים עצביים מועשרים (NeuN+), אסטרוציטים (חלבון קופסה מזווג 6 (PAX6)+NeuN-), וגרעיניטור אוליגודנדרוציטים (OLIG2+NeuN-) מאוכלוסיות גרעינים מועשרים (OLIG2+NeuN-) מרקמת ניאו-קורטקס טמפורלית אנושית לא חולה, טרייה (לא מנוקבת).
טכניקה זו הוכחה כיעילה לאפיון שינויים בתעתיק ספציפי לסוג התא בניאוקורטקס אפילפסיה פתולוגית ראשונית. ניתוחי תעתיק אישרו כי אוכלוסיות ממוינות PAX6+NeuN מועשרות היטב עבור סמני פאן-אסטרוציטים ולוכדות אסטרוציטים הן בתנאי מנוחה והן בתנאים תגובתיים. מאמר זה מתאר את מתודולוגיית FANS לבידוד של אוכלוסיות גרעינים מועשרים באסטרוציטים מקליפת המוח האנושית הקפואה טרייה, כולל דיסוציאציה של רקמות לתרחיף של גרעין יחיד (sn); אימונו-תיוג של גרעינים עם נוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים נגד NeuN ו-anti-PAX6; אוהדים מנצלים אסטרטגיות ומדדי בקרת איכות לאופטימיזציה של רגישות וספציפיות במהלך המיון ולאישור העשרת אסטרוציטים; ורכש מומלץ לריצוף תעתיק במורד הזרם ונגישות כרומטין ברזולוציית תפזורת או sn. פרוטוקול זה ישים עבור דגימות קליפת המוח האנושיות שאינן נמקיות, קפואות טריות, עם פתולוגיות שונות ואיסוף רקמות מומלץ לאחר המוות תוך 24 שעות.

גרעינים נאספו מרקמת ניאוקורטקס טמפורלית טרייה (לא מנוקבת) עם זמן איסוף לאחר המוות של 12 שעות. לאחר דיסוציאציה של רקמות לתרחיף גרעינים, הדגימות הודגמו עם נוגדנים נגד NeuN, PAX6 ו-OLIG2, ומוינו לפי הגידור המוצג באיור 1 ובאיור 2. גרעינים נאספו מאוכלוסיות ממוינות של NeuN+, P...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting at JoVE.com

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

פיתחנו שיטה המעשירה ומבודדת אוכלוסיות אסטרוציטים אנושיות מרקמה קפואה טרייה לשימוש בניתוחים מולקולריים במורד הזרם.

בידוד של אוכלוסיות אסטרוציטים אנושיות בוגרות מקורטקס קפוא טרי באמצעות מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

פרוטוקול זה יכול לסייע למדענים המעוניינים לחקור את התפקוד המולקולרי של אסטרוציטים אנושיים בנישה הטבעית שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת בידוד והעשרה של סוג תא מסוים, אסטרוציטים בוגרים מדגימות של רקמת מוח אנושית בתפזורת באמצעות מיון גרעינים המופעל על ידי פלואורסצנציה. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על בידוד סוגי תאים אחרים מהנאוקורטקס האנושי, כגון נוירונים ותאי אב של אוליגודנדרוציטים באמצעות נוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים מתאימים אחרים.התחילו לנתח כ-200 עד 400 מיליגרם של רקמות מדגימת רקמת קליפת המוח הבוגרת הטרייה והקפואה של האדם. מניחים את הרקמה בתוך רקמת זכוכית בת שבעה מיליליטר המכילה ארבעה מיליליטרים של חיץ ליזה קר כקרח על קרח וטוחנים את הרקמה כ-50 פעמים. מעבירים את ההומוגנאט לצינור פוליפרופילן אולטרה-צנטריפוג' של 12 מיליליטר.השתמשו בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי להוסיף 6.5 מיליליטרים של חיץ סוכרוז קר כקרח לתחתית הצינור האולטרה-צנטריפוג' מבלי להפריע לממשק בין הסוכרוז לרקמה הומוגנטית. כדי לאסוף את הגרעינים, אולטרה-סנטריפו את הליסאט למשך שעה אחת ב-101, 814 פעמים G ושאפו בזהירות את הסופרנטנט ואת הפסולת מבלי להפריע לכדור. הוסיפו 0.1% BSA ב-PBS לצינור האולטרה-צנטריפוג' לדגירה של 10 דקות על קרח לפני החייאה של גלולת הגרעינים.לאחר מכן, השתמש בכחול טריפאן כדי לדמיין את הגרעינים השלמים תחת מיקרוסקופ אור וכדי להבטיח שהריכוז יהיה מעל 10 עד הגרעינים החמישיים למיליליטר למיון המופעל על ידי פלואורסצנציה של הגרעינים המבודדים, הוסף כ-20 מיקרוליטרים של הדגימה המוחזרת לתמיסת נוגדנים המכילה נוגדן אלקסה פלואור 555 מצומד לעכבר אנטי-NeuN. הוסיפו כ-20 מיקרוליטרים של הדגימה המוחזרת לתמיסת נוגדנים המכילה נוגדן נגד PAX6 של עכבר מצומד APC. לאחר דגירה של שעה בארבע מעלות צלזיוס עם רעידות, מוגנות מפני אור, הוסיפו DAPI ביחס של 1:1000 לכל הדגימות והבקרות.כדי לכלול גרעינים בגודל המתאים וכדי לא לכלול תאי דם אדומים ופסולת, השתמש בצינור בקרה כדי לשער את התאים לפי אזורי הפיזור הקדמיים והצדדיים שלהם. כדי לבחור את אוכלוסיית גרעיני הסינגלט, שער לפי אזור פיזור קדימה לעומת רוחב פיזור קדימה או גובה ושטח פיזור צד לעומת רוחב או גובה פיזור צד. שער על ידי DAPI כך שיכלול רק את סינגלי הגרעינים השלמים ולא לכלול פסולת וכפולות.לאחר גידור על פי כל פקדי פלואורסצנציה נוספים, הפעל את דגימת הבקרה של DAPI בלבד. הפעל את בקרת ה-NeuN Alexa fluor 555 בלבד כדי לקבוע את הניתוק עבור הכתם החיובי של NeuN בערוץ אלקסה פלואור 555. הפעל את פקד ה-APC של PAX6 בלבד כדי לקבוע את הניתוק עבור הכתם החיובי של PAX6 בתעלת ה-APC.לאחר הפעלת כל הבקרות, שערו את התאים החיוביים ל-NeuN כדי לאסוף את הנוירונים ולשער את התאים החיוביים ל-PAX6 עם האוכלוסייה השלילית של NeuN כדי לאסוף את האסטרוציטים. שער ואסוף אוכלוסיות גליה נוספות בעלות עניין מאוכלוסיית PAX6-שלילית של NeuN. לריצוף RNA של גרעין יחיד בתפזורת, לאחר איסוף 50, 000 עד 500, 000 גרעינים ב-0.04% PBS בתוספת BSA, הוסיפו לדגימה שני מיליליטרים של תמיסת סוכרוז, 50 מיקרוליטרים של סידן כלוריד טוחן אחד, ו-30 מיקרוליטרים של אצטט מגנזיום טוחן אחד.הביאו את הנפח הסופי של המתלים עד 10 מיליליטר עם PBS. ערבבו את תכולת הצינור על ידי היפוך ודגרו את התגובה על הקרח במשך 15 דקות. גלול את הגרעינים על ידי צנטריפוגה ו resuspened הגרעינים במיליליטר אחד של RNA חילוץ מגיב.לאחר מכן, מערבולת את הצינור, מקפיאים את הדגימה על קרח יבש, ומאחסנים את הגרעינים במינוס 80 מעלות צלזיוס. עבור ריצוף כרומטין מקובל על גרעין יחיד בתפזורת, אספו 50, 000 עד 75, 000 גרעינים לתוך 0.04%PBS עם תוספת BSA בצינור מיקרו-צנטריפוגה המצופה ב-5%BSA והקפיאו את הגרעינים עד לניתוח במורד הזרם. ניתן למיין אוכלוסיות של גרעינים עצביים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים מדגימת ניאוקורטקס אנושית טמפורלית קפואה ורעננה לאחר המוות כפי שהודגם.מחקרי ריצוף RNA של גרעין יחיד נתנו עדיפות נוספת ל-PAX6 כגורם שעתוק גרעיני בעל ביטוי דיפרנציאלי עליון הן בתת-אוכלוסיות של אסטרוציטים בוגרים פרוטופלסמיים והן בסיביים. לאחר המיון, ניתן לאפיין שינויים בתעתיק ספציפי לסוג התא בניאוקורטקס האפילפסיה הפתולוגית הראשונית. בניתוח זה, ניתוחי תעתיק אישרו כי האוכלוסיות החיוביות ל-NeuN-negative של PAX6 הועשרו בחוזקה עבור סמני פאנאסטרוציטים והתרוקנו עבור סמנים עצביים.ניתן להשתמש בכתם אימונופלואורסצנטי כדי לאשר את הלוקליזציה המשותפת של PAX6 עם חלבון חומצי מפרבר גלי באסטרוציטים קליפתיים אנושיים. מרווחים קצרים יותר לאחר המוות קשורים להתאוששות גרעינים שלמים יותר מדגימות רקמות טריות. ניתן לשחזר תפוקה גבוהה של גרעינים שלמים מרקמה קפואה עד 24 שעות לאחר המוות, אך ב-30 שעות ניתן לשחזר מעט מאוד גרעינים שלמים.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא לקבל את האוכלוסייה החיובית PAX6 מאוכלוסיית NeuN-negative, מכיוון שיש נוירונים שמבטאים גם את PAX6, ואנחנו רוצים להחריג אותם. טכניקה זו גם אפשרה את המחקר של אסטרוציטים בדגימות מוח כירורגיות אפילפסיה, מה שהבהיר עוד יותר את הדיסרגולציה המולקולרית של אסטרוציטים אנושיים בהקשר של נישה פתולוגית ספציפית.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

נוהל אופטימליים עבור Fluorescence המופעל בידוד מיון (FACS) תא של אבות עצביות האוטונומית מאיברים בטן של עכברים עוברית

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

הדמיה תפקודית של השמיעתי Cortex בחתולים בוגרים באמצעות גבוהה שדה fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

בידוד של אוכלוסיות תאים שונות מהמוח הקטן פיתוח על ידי Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

רקמות קרינה הופעלו מיון תאים (FACS) וניתוח ביטוי גנים של נוירונים Fos להביע מ טרי קפוא מוח החולדה

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

אופטימיזציה של לכידת לייזר Microdissection עבור בידודו של הגרעינים המעית מרקמות אנושיות מוקפאות

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

בידוד של חוט השדרה למבוגרים גרעינים עבור רצפי RNA חד-גרעין בנפט מקבילים

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

התא הראשי תרבות של מטוהרים GABAergic או Glutamatergic נוירונים הוקמה באמצעות מיון תאים פלואורסצנטית מופעל

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

קבלת מיקרוליה אנושית רקמת מוח אנושית בוגרת

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה-רקמה מטופלת רדיוליגנד (FACS-RTT) כדי לקבוע את המקור התאי של אותות רדיואקטיביים

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...