Name: isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00
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우리는 마운트 시나이 (Mount Sinai)의 이칸 의과 대학 (Icahn School of Medicine)의 병리학 및 신경 외과 회원들에게 비 식별 뇌 조직 조달과 ISMMS의 유세포 측정 CORE에 대한 전문가의 조언을 구해 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (N.M.T.), R61DA048207 (S.A.까지)에 의해 부분적으로 자금을 지원받았다.

참고 : 마운트 시나이 (ISMMS)의 이칸 의과 대학 (ISMMS)과 기관 검토위원회 (IRB)의 인간 과목 보호 프로그램은 연구의 윤리적 행위와 연방, 주 및 기관 규정 준수를 보장합니다. 이 연구에서, 사용된 모든 사후 표본은 비식별화되었고, 생물저장소를 통해 적절한 동의하에 획득되었으며, ISMMS의 IRB(HS#14-01007)에 의한 "인간 연구" 지정에서 면제되었다.
1. 완충액 준비
<p class="jove_content...

<ol>
	<li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain.">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).</li><li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PsychENCODE+project.">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).</li><li>Tome-Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+isolation+and+transcriptomic+profiling+informs+glial+pathology+in+human+temporal+lobe+epilepsy.">Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse.">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+Is+an+astrocyte-specific+nuclear+marker+in+the+adult+brain+outside+the+neurogenic+regions.">SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).</li><li>Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebral+cortical+neurogenesis+by+the+Pax6+transcription+factor.">Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).</li><li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurogenesis-controlling+factor,+Pax6,+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes.">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li><li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus.">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li><li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development.">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li><li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX6:+25th+anniversary+and+more+to+learn.">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li><li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy.">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li><li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue:+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium.">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li><li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+&#945;A.">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin &#945;A.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li></ol>

개략적인 프로토콜에 따른 실험 설계는 몇 가지 생물학적 및 기술적 요인을 고려한 후에 마무리되어야 한다. 출발 조직 샘플은 신선-고정되지 않고 신선하게 동결되고, 바람직하게는 핵 회복을 최대화하기 위해 짧은 사후 수집 간격을 갖는다. 경험에 비추어 볼 때, 최대 24 시간의 PMI는 적절한 핵 회복을 가능하게합니다. 그러나, 12 h 이하의 PMI는 무손상 핵 회복을 최적화하기 위해 바람직하다. 신?...

인간 성상세포의 분자 복잡성은 일차 조직에서 제대로 정의되지 않은 상태로 남아 있으며, 건강과 질병 모두에서 고해상도로 분리 및 특성화를위한 더 나은 도구가 필요합니다. 손상되지 않은 인간 뉴런과 글리아를 틈새 시장으로부터 분리하는 것은 신선한 뇌 조직 샘플의 제한된 접근, 신경교 및 신경 세포의 심하게 상호 연결된 특성, 처리 중 필연적 인 세포 활성화로 인해 어려운 것으로 입증되었으며, 이들 모두는 이러한 세포 유형의 분자 특성화를 제한합니다 생체 외1 . 형광 활성화 핵 분류 (FANS)는 살아있는 세포 분류의 대안으로 등장하여 동결 된 조직에서 핵 집단의 해리 및 면역 태깅을 가능하게합니다. 지난 10 년 동안 FANS는 다양한 뇌 표본 및 해부학 적 영역1,2,3,4에서 인간 신경 (NeuN +) 핵 집단을 분리하고 분자적으로 특성화하는 데 널리 사용되었습니다.
그러나, 인간 피질로부터 특정 신경교세포 하위집단을 분리하기 위한 유사한 방법들이 제한되어, 정상 및 병든 조직 둘 다에서 성상세포 복잡성에 대한 이해에서 정교함의 상대적 부족으로 이어졌다. 이를 위해, 이전에 발표된 프로토콜이 FANS4를 사용하여 인간 뉴런 집단을 단리하기 위해 채택되었고, 삼중-항체 조합을 사용하여 성상세포(및 올리고덴드로아교세포 전구인자)를 풍부하게 하는 방법이 검증되었고, 휴지 및 반응성 조건 모두에서 성상세포를 포획하였다5. NeuN-분획에서 성상세포에 대해 특이적으로 농축하기 위해, 성상세포 집단에 걸쳐 차등적으로 발현되는 것으로 알려진 두 개의 전사 인자 중 하나인 PAX6 또는 SRY-box 전사 인자 9 (SOX9)6,7에 대한 항체를 사용하였다. PAX6는 발아 영역에서 방사상 신경교세포 유사 전구물질 내에서 초기 태아 발달 동안 고도로 발현되며, 신경발생 및 교형성8,9,10,11 뿐만 아니라 망막 신경세포 사양 12에도 기여한다. 성인에서, PAX6는 휴지 인간 성상세포(6)에서 차별적으로 과발현되고, 인간 간질 조직 성상세포(13)에서 신경교모세서 산성 단백질(GFAP)과 단백질 공동발현을 나타낸다.
이 프로토콜은 FANS에 의한 신피질 뉴런 및 성상세포 풍부 핵 집단의 동시 분리를 기술한다. 성인 피질로부터 수집된 신선한(고정되지 않은) 스냅-냉동(즉, 신선한-냉동된) 사후 조직은 먼저 기계적으로 그리고 화학적으로 해리된다. 수크로오스 구배에서 용해 및 초원심분리 후, 핵이 유지되는 동안 세포질 및 세포외 성분은 폐기된다. 그런 다음 핵을 원하는 표적 혈통에 상응하는 형광 접합된 핵 항체로 표지하고 FANS를 사용하여 분류한다. 이 접근법에 따라, 성상세포의 농축은 수집된 PAX6+NeuN-집단에서 입증되며, 표적화된 qPCR 패널뿐만 아니라 하류 핵 RNA 시퀀싱에 의해 모두 검증된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS pH 7.2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>70013073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377A5MI</td>
			<td>mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN50A4MI</td>
			<td>mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Counting Chamber</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C614-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 40 &#181;M</td>
			<td>SP Scienceware</td>
			<td>136800040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Library Kit</td>
			<td>Illumina, Nextera</td>
			<td>FC-121&#8211;1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>WHEATON</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>BD FACSAria III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M13-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP234705J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian</td>
			<td>Clontech Laboratories</td>
			<td>635005</td>
			<td>Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J22638AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>non-ionic surfactant in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>reagent for isolation of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter Optima XE-100</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td>referred to as distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting

인간 성상세포의 복잡성은 일차 인간 조직에서 제대로 정의되지 않은 상태로 남아 있으며, 격리 및 분자 특성화를위한 더 나은 도구가 필요합니다. 형광 활성화 핵 분류(FANS)는 동결된 보관 조직에서 인간 뉴런 핵(NeuN+) 집단을 성공적으로 분리하고 연구하는 데 사용할 수 있으므로 신선한 조직 취급과 관련된 문제를 피할 수 있습니다. 그러나, 유사하게 비신경세포(NeuN-) 요소로부터 아스트로아교세포를 분리하려는 노력은 결여되어 있다. 최근에 개발되고 검증된 면역태깅 전략은 세 개의 전사인자 항체를 사용하여 농축된 뉴런(NeuN+), 성상세포(쌍을 이룬 박스 단백질 6(PAX6)+NeuN-) 및 희소돌기아교세포 전구세포(OLIG2+NeuN-) 핵 집단을 병에 걸리지 않은, 신선한(고정되지 않은) 스냅 냉동 사후 인간 측두엽 신피질 조직으로부터 동시에 분리한다.
이 기술은 원발성 병리학적 간질 신피질에서 세포 유형 특이적 전사체 변경의 특성화에 유용한 것으로 나타났다. 전사체 분석은 PAX6+NeuN-분류된 집단이 범성상세포 마커에 대해 견고하게 풍부해지고 휴식 및 반응성 조건 모두에서 성상세포를 포획한다는 것을 확인했다. 이 논문은 단일 핵 (sn) 현탁액으로의 조직 해리를 포함하여 신선하고 냉동 된 인간 피질로부터 성상 세포가 풍부한 핵 집단을 분리하기위한 FANS 방법론을 설명합니다. 항-NeuN 및 항-PAX6 형광 접합된 항체를 사용한 핵의 면역태깅; 분류 중 민감도와 특이성을 최적화하고 성상세포 농축을 확인하기 위한 FANS 게이팅 전략 및 품질 관리 지표; 그리고 대량 또는 sn 해상도에서 다운스트림 전사체 및 크로마틴 접근성 시퀀싱에 대한 조달을 권장한다. 이 프로토콜은 다양한 병리를 가진 비 괴사성, 신선하고 냉동 된 인간 피질 표본에 적용 가능하며 24 시간 이내에 사후 조직 수집을 권장합니다.

핵은 12 h의 사후 수집 시간을 갖는 신선한(고정되지 않은) 스냅-냉동 측두엽 신피질 조직으로부터 수집되었다. 핵 현탁액 내로 조직을 해리시킨 후, 샘플을 NeuN, PAX6 및 OLIG2에 대한 항체와 함께 인큐베이션하고, 도 1 및 도 2에 도시된 게이팅에 따라 분류하였다. 핵은 NeuN+, PAX6+NeuN-, 및 OLIG2+NeuN-분류된 집단으로부터 수집되었다(도 1E<...

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Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

우리는 하류 분자 분석에 사용하기 위해 인간 성상 세포 집단을 신선하게 냉동 된 조직으로부터 풍부하게하고 분리하는 방법을 개발했습니다.

형광 활성화 핵 분류를 사용하여 신선 냉동 피질로부터 성인 인간 성상세포 집단의 분리

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

이 프로토콜은 네이티브 틈새 시장에서 인간 성상 세포의 분자 기능을 연구하는 데 관심이있는 과학자들을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 형광 활성화 핵 분류를 사용하여 벌크 인간 뇌 조직 표본으로부터 특정 세포 유형, 성인 성상세포의 분리 및 농축을 허용한다는 것이다. 이 방법론은 다른 적절한 형광-접합된 항체를 사용하여 뉴런 및 희소돌기아교세포 전구 세포와 같은 인간 신피질로부터 다른 세포 유형을 단리하는데 적용될 수 있다.신선한 냉동 인간 성인 피질 조직 샘플로부터 대략 200 내지 400 밀리그램의 조직을 해부하기 시작한다. 조직을 얼음 위에 얼음 차가운 용해 완충액 네 밀리리터가 들어있는 일곱 밀리리터 유리 조직 douncer에 넣고 조직을 약 50 번 갈아냅니다. 균질액을 12-밀리리터 초원심분리 폴리프로필렌 튜브로 옮긴다.5 밀리리터 피펫을 사용하여 6.5 밀리리터의 얼음처럼 차가운 수크로오스 버퍼를 수크로오스와 조직 균질물 사이의 계면을 방해하지 않고 초원심분리 튜브의 바닥에 첨가하십시오. 핵을 수집하기 위해, 용해물을 101, 814배 G에서 1시간 동안 초원심분리하고, 펠렛을 방해하지 않고 상청액 및 파편을 조심스럽게 흡인한다. PBS 중 0.1%BSA를 초원심분리 튜브에 첨가하여 핵 펠릿을 재현탁시키기 전에 얼음 상에서 10분간 인큐베이션한다.그런 다음 트리판 블루를 사용하여 광학 현미경으로 무손상 핵을 시각화하고 농도가 밀리리터 당 5 번째 핵보다 10 이상 있는지 확인하기 위해 분리 된 핵의 형광 활성화 분류를 위해 Alexa fluor 555 접합 마우스 항-NeuN 항체를 포함하는 항체 용액에 재현탁 된 샘플을 약 20 마이크로 리터를 첨가하십시오. 약 20 마이크로리터의 재현탁된 샘플을 APC 컨쥬게이션된 마우스 항-PAX6 항체를 함유하는 항체 용액에 첨가한다. 진탕으로 섭씨 네 도에서 1시간 배양한 후, 빛으로부터 보호하고, 모든 샘플 및 대조군에 1:1000 비율로 DAPI를 첨가한다.적절한 크기의 핵을 포함하고 적혈구와 파편을 배제하려면 제어 튜브를 사용하여 전방 및 측면 산란 영역으로 세포를 게이트하십시오. 일중항 핵 집단을 선택하려면, 전방 산란 영역 대 전방 산란 폭 또는 높이 및 측면 산란 영역 대 측면 산란 폭 또는 높이에 의한 게이트. DAPI에 의한 게이트는 손상되지 않은 핵 일중항 만 포함하고 파편과 이중을 배제합니다.임의의 추가적인 형광 대조군에 따라 게이팅한 후, DAPI 전용 대조군 샘플을 실행한다. NeuN 알렉사 플루오르 555 전용 대조군을 실행하여 알렉사 플루오르 555 채널에서 NeuN 양성 염색에 대한 컷오프를 결정한다. PAX6 APC 전용 대조군을 실행하여 APC 채널에서 PAX6 양성 염색에 대한 컷오프를 결정한다.모든 대조군이 실행된 후, NeuN 양성 세포를 게이트하여 뉴런을 수집하고 PAX6 양성 세포를 NeuN 음성 집단과 함께 게이트하여 성상세포를 수집한다. NeuN 음성 PAX6 음성 개체군으로부터 관심있는 임의의 추가 신경교 집단을 게이트하고 수집한다. 벌크 단일 핵 RNA 시퀀싱을 위해, 0.04%BSA가 보충된 PBS에서 50, 000 내지 500, 000 핵을 수집한 후, 두 밀리리터의 수크로오스 용액, 50 마이크로리터의 원몰 염화칼슘 및 30 마이크로리터의 원몰 마그네슘 아세테이트를 샘플에 첨가한다.PBS로 현탁액의 최종 부피를 최대 10 밀리리터까지 가져 오십시오. 튜브 내용물을 역전시켜 혼합하고 15분 동안 얼음 상에서 반응물을 인큐베이션한다. 원심분리에 의해 핵을 펠릿화하고, 핵을 RNA 추출 시약의 한 밀리리터에 재현탁시킨다.그런 다음 튜브를 와류하고 샘플을 드라이 아이스 위에 동결시키고 핵을 영하 80도에서 저장합니다. 벌크 단일 핵 트랜스포제-허용 크로마틴 시퀀싱을 위해, 50, 000 내지 75, 000 핵을 5%BSA로 코팅된 마이크로원심분리 튜브에서 0.04%BSA가 보충된 PBS로 수집하고, 이들의 하류 분석까지 핵을 동결시킨다. 뉴런, 성상세포, 및 올리고수지상세포 전구 핵 집단은 입증된 바와 같이 신선한 냉동 사후 인간 측두엽 신피질 샘플로부터 분류될 수 있다.단일 핵 RNA 시퀀싱 연구는 PAX6를 원형질 및 섬유성 성상세포 하위집단 둘 다에 걸쳐 차등적으로 발현된 핵 전사 인자로서 더욱 우선시하였다. 분류 후, 원발성 병리학적 간질 신피질에서의 세포 유형 특이적 전사체 변경이 특성화될 수 있다. 이 분석에서, 전사체 분석은 PAX6 양성 NeuN 음성 집단이 범성세포 마커에 대해 견고하게 풍부해지고 뉴런 마커에 대해 고갈되었음을 확인했다.면역형광 염색은 인간 피질 성상세포에서 아교세포 세동 산성 단백질과 PAX6의 공동국소화를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 더 짧은 사후 간격은 신선한 조직 샘플로부터의 더 큰 온전한 핵 회복과 관련된다. 무손상 핵의 높은 수율은 사후 24 시간까지 동결 된 조직에서 회복 될 수 있지만, 30 시간에는 손상되지 않은 핵을 거의 회복 할 수 없습니다.기억해야 할 가장 중요한 것은 PAX6를 발현하는 뉴런이 있기 때문에 NeuN 음성 개체군에서 PAX6 양성 집단을 얻는 것입니다. 이 기술은 또한 간질 외과 적 뇌 표본에서 성상 세포에 대한 연구를 허용하여 특정 병리학 적 틈새 시장의 맥락에서 인간 성상 세포의 분자 조절 장애를 더욱 해명했습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

태아 쥐의 내장 장기에서 자율 신경 Progenitors의 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS) 절연을위한 최적화된 절차

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

연구

신경과학

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

하이 필드의 fMRI를 사용하여 성인 고양이의 청각 피질의 기능적 이미징

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

이외에 Microdissection에 의해 개발 소뇌 차별화 된 세포 집단의 분리

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

쥐 뇌 조직 검사 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 셀 타입 별 유전자 발현

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)와 신선한 및 냉동 쥐 뇌 조직 FOS를 발현하는 신경 세포의 유전자 발현 분석

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

신선한 냉동 인간 조직에서 장의 중추의 격리에 대 한 레이저 캡처 서의 최적화

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

형광 활성 세포 선별을 통해 확립 된 정제 GABAergic 또는 Glutamatergic 뉴런의 일차 세포 배양

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

성인 인간 뇌 조직에서 인간 마이크로글리아 획득

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

형광-활성화된 세포 분류-방사성 신호의 세포 기원을 결정하기 위한 방사성리간드 처리조직(FACS-RTT)

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...