Name: isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting at JoVE.com

Vi liker å takke medlemmer i patologi og nevrokirurgi ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai for hjelp med anskaffelsen av avidentifisert hjernevev og ISMMS's Flow Cytometry CORE for ekspertråd. Studien ble delvis finansiert av NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (til N.M.T.) og R61DA048207 (til S.A.).

MERK: Programmet for beskyttelse av mennesker ved Icahn School of Medicine ved Mount Sinai (ISMMS) og dets Institutional Review Board (IRB) sikrer etisk gjennomføring av forskning og overholdelse av føderale, statlige og institusjonelle forskrifter. I denne studien ble alle postmortemprøver som ble brukt av identifisert, innhentet under passende samtykke gjennom biorepositorien, og ble unntatt fra "menneskelig forskning" betegnelse av ISMMS's IRB (HS # 14-01007).
1. Klargjøring av buffer...

<ol>
	<li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain.">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).</li><li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PsychENCODE+project.">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).</li><li>Tome-Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+isolation+and+transcriptomic+profiling+informs+glial+pathology+in+human+temporal+lobe+epilepsy.">Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse.">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+Is+an+astrocyte-specific+nuclear+marker+in+the+adult+brain+outside+the+neurogenic+regions.">SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).</li><li>Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebral+cortical+neurogenesis+by+the+Pax6+transcription+factor.">Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).</li><li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurogenesis-controlling+factor,+Pax6,+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes.">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li><li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus.">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li><li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development.">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li><li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX6:+25th+anniversary+and+more+to+learn.">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li><li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy.">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li><li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue:+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium.">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li><li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+&#945;A.">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin &#945;A.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li></ol>

Eksperimentell design etter den skisserte protokollen bør sluttføres etter å ha vurdert flere biologiske og tekniske faktorer. Startvevsprøver er ferskfryst, uten å ha blitt fikset, og har helst et kort postmortem samlingsintervall for å maksimere kjerner. Basert på erfaring gir en PMI på opptil 24 timer tilstrekkelig kjernegjenoppretting; En PMI på 12 timer eller mindre er imidlertid å foretrekke for å optimalisere intakt kjernegjenoppretting. Ytterligere faktorer bortsett fra PMI, inkludert temperatur på kr...

Den molekylære kompleksiteten til menneskelige astrocytter forblir dårlig definert i primærvev, og krever bedre verktøy for isolasjon og karakterisering ved høy oppløsning, både i helse og sykdom. Separasjon av intakte menneskelige nevroner og glia fra deres nisje har vist seg vanskelig på grunn av begrenset tilgang til ferske hjernevevsprøver, den sterkt sammenkoblede naturen til glial- og nevronale prosesser, og uunngåelig cellulær aktivering under behandling, som alle begrenser molekylær karakterisering av disse celletypene ex vivo1 . Fluorescensaktivert nuklei sortering (FANS) har dukket opp som et alternativ til levende celle sortering, slik at dissosiasjon og immunotagging av kjerner populasjoner fra frossent vev. I løpet av det siste tiåret har FANS blitt mye brukt til å isolere og molekylært karakterisere menneskelige nevronale (NeuN +) kjernepopulasjoner i en rekke hjerneprøver og anatomiske regioner 1,2,3,4.
Imidlertid har lignende metoder for å isolere spesifikke glial nuklei subpopulations fra human cortex vært begrenset, noe som fører til en relativ mangel på raffinement i forståelsen av astrocyttkompleksitet i både normalt og sykt vev. For dette formål ble en tidligere publisert protokoll tilpasset for å isolere menneskelige nevronale populasjoner ved hjelp av FANS4, og en metode ble validert for å berike astrocytter (og for oligodendrogliale forfedre) ved hjelp av en trippel-antistoffkombinasjon, og fanget astrocytter i både hvilende og reaktive forhold5. For å spesifikt berike astrocytter i NeuN-fraksjonen ble antistoffer brukt mot en av to transkripsjonsfaktorer som er kjent for å være differensialt uttrykt på tvers av astrocyttpopulasjoner, PAX6 eller SRY-boks transkripsjonsfaktor 9 (SOX9)6,7. PAX6 er sterkt uttrykt under tidlig fosterutvikling innen radial glia-lignende forfedre i germinal soner og bidrar til både nevrogenese og gliogenese 8,9,10,11 samt til retinal neuronal spesifikasjon 12. Hos voksne er PAX6 differensialt overekspressert i hvilende menneskelige astrocytter6 og viser proteinkouttrykk med glial fibrillært surt protein (GFAP) i humant epilepsivev astrocytter13.
Denne protokollen beskriver samtidig isolasjon av neokortiske nevronale og astrocyttberikede nukleipopulasjoner av FANS. Fersk (uløst) snapfrossen (dvs. ferskfryst) postmortemvev samlet fra voksen cortex blir først mekanisk og kjemisk dissosiert. Etter lysis og ultracentrifugation i en sukrose gradient, blir de cytoplasmatiske og ekstracellulære komponentene kassert mens kjernene beholdes. Nuclei blir deretter merket med fluorescerende konjugerte kjernefysiske antistoffer som tilsvarer de ønskede mållinjeformene og sorteres ved hjelp av FANS. Etter denne tilnærmingen er berikelse av astrocytter demonstrert i de innsamlede PAX6 + NeuN-populasjonene, validert både av et målrettet qPCR-panel så vel som ved nedstrøms kjernefysisk RNA-sekvensering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS pH 7.2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>70013073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377A5MI</td>
			<td>mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN50A4MI</td>
			<td>mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Counting Chamber</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C614-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 40 &#181;M</td>
			<td>SP Scienceware</td>
			<td>136800040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Library Kit</td>
			<td>Illumina, Nextera</td>
			<td>FC-121&#8211;1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>WHEATON</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>BD FACSAria III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M13-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP234705J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian</td>
			<td>Clontech Laboratories</td>
			<td>635005</td>
			<td>Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J22638AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>non-ionic surfactant in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>reagent for isolation of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter Optima XE-100</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td>referred to as distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting

Kompleksiteten til menneskelige astrocytter forblir dårlig definert i primært menneskelig vev, og krever bedre verktøy for isolasjon og molekylær karakterisering. Fluorescensaktivert nuklei sortering (FANS) kan brukes til å isolere og studere menneskelige nevronale kjerner (NeuN +) populasjoner fra frossent arkivvev, og dermed unngå problemer forbundet med håndtering av friskt vev. Imidlertid mangler innsats for å isolere astroglia fra det ikke-nevronale (NeuN-) elementet på samme måte. En nylig utviklet og validert immunotagging strategi bruker tre transkripsjon faktor antistoffer for samtidig å isolere beriket neuronal (NeuN +), astrocytt (parret boks protein 6 (PAX6)+NeuN-), og oligodendrocytt forfedre (OLIG2 +NeuN-) nuclei populasjoner fra ikke-syke, friske (unfixed) snap-frossen postmortem human temporal neocort vev.
Denne teknikken ble vist å være nyttig for karakterisering av celletypespesifikke transkripsjonsendringer i primær patologisk epilepsi neocortex. Transkripsjonsanalyser bekreftet at PAX6+NeuN-sorterte populasjoner er robust beriket for pan-astrocyttmarkører og fanger astrocytter under både hvilende og reaktive forhold. Dette dokumentet beskriver FANS-metodikken for isolering av astrocyttberikede kjerner fra ferskfrosset human cortex, inkludert vevsdissosiasjon til enkeltkjerne (sn) suspensjon; immunnagging av kjerner med anti-NeuN og anti-PAX6 fluorescerende konjugede antistoffer; FANS gating strategier og kvalitetskontroll beregninger for optimalisering følsomhet og spesifisitet under sortering og for å bekrefte astrocytt berikelse; anbefalte anskaffelser for nedstrøms transkripsjon og chromatin tilgjengelighet sekvensering ved bulk- eller sn-oppløsning. Denne protokollen gjelder for ikke-nekrotiske, ferskfryste, menneskelige kortikale prøver med ulike patologier og anbefalt postmortem vevsinnsamling innen 24 timer.

Nuclei ble samlet inn fra ferskt (uløst) snap-frossent temporalt neocortex vev med en postmortem samlingstid på 12 timer. Etter vevsdissosiasjon i nuklei suspensjon, ble prøver inkubert med antistoffer mot NeuN, PAX6 og OLIG2, og sortert i henhold til gating vist i figur 1 og figur 2. Nuklei ble samlet inn fra NeuN+, PAX6+NeuN- og OLIG2+NeuN-sorterte populasjoner (figur 1E,F og figur 2F</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting at JoVE.com

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

Vi har utviklet en metode som beriker og isolerer menneskelige astrocyttpopulasjoner fra ferskfrosset vev til bruk i nedstrøms molekylære analyser.

Isolering av voksne menneskelige astrocyttpopulasjoner fra ferskfrossen cortex ved hjelp av fluorescensaktivert nuklei-sortering

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

Denne protokollen kan hjelpe forskere som er interessert i å studere molekylær funksjon av menneskelige astrocytter i sin opprinnelige nisje. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater isolering og berikelse av en bestemt celletype, voksne astrocytter fra bulk menneskelige hjernevevsprøver ved hjelp av fluorescensaktivert kjernesortering. Denne metoden kan brukes til å isolere andre celletyper fra den menneskelige neocortex, som nevroner og oligodendrocytt stamceller ved hjelp av andre passende fluorescerende-konjugede antistoffer.Begynn å dissekere ca 200 til 400 milligram vev fra en fersk frossen human voksen cortex vevsprøve. Legg vevet i en syv milliliter glassvevsduncer som inneholder fire milliliter iskald lysisbuffer på is og slip vevet ca. 50 ganger. Overfør homogenatet til et 12 milliliter ultracentrifuge polypropylenrør.Bruk en pipette på fem milliliter til å tilsette 6,5 milliliter iskald sukrosebuffer til bunnen av ultracentrifugerøret uten å forstyrre grensesnittet mellom sukrose og vevshomogenat. For å samle kjernene, ultracentrifuge lysate i en time på 101, 814 ganger G og forsiktig aspirere supernatant og rusk uten å forstyrre pellet. Tilsett 0,1 % BSA i PBS i ultracentrifuge-røret for en 10-minutters inkubasjon på is før du bruker nuklei-pelletsen på nytt.Bruk deretter trypan blå for å visualisere de intakte kjernene under et lysmikroskop og for å sikre at konsentrasjonen er over 10 til den femte kjernen per milliliter For fluorescensaktivert sortering av de isolerte kjernene, tilsett omtrent 20 mikroliter av den resuspenderte prøven til en antistoffløsning som inneholder Alexa fluor 555 konjugert mus anti-NeuN antistoff. Tilsett ca. 20 mikroliter av den resuspenderte prøven til en antistoffløsning som inneholder APC-konjugert mus anti-PAX6 antistoff. Etter en times inkubasjon ved fire grader Celsius med risting, beskyttet mot lys, legg til DAPI med et 1:1000-forhold til alle prøvene og kontrollene.For å inkludere kjerner av riktig størrelse og for å utelukke røde blodlegemer og rusk, bruk et kontrollrør for å portere cellene ved deres fremover- og sidespredningsområder. Hvis du vil merke kjernepopulasjonen med én kjerner, kan du gate by forward scatter-området kontra fremover punktbredde eller høyde og sidespredningsområde kontra sidespredningsbredde eller -høyde. Gate by DAPI å inkludere bare intakte nuclei singlets og å utelukke eventuelle rusk og dobler.Etter å ha kneblet i henhold til eventuelle ekstra fluorescenskontroller, kjør dapi-bare kontrollprøven. Kjør NeuN Alexa fluor 555-only-kontrollen for å bestemme avskjæringen for NeuN-positiv farging i Alexa fluor 555-kanalen. Kjør pax6 APC-kontrollen for å fastslå avskjæringen for PAX6-positiv farging i APC-kanalen.Etter at alle kontrollene er kjørt, gate de NeuN-positive cellene for å samle nevronene og gate PAX6-positive celler med NeuN-negativ populasjonen for å samle astrocytter. Gate og samle eventuelle ekstra glial populasjoner av interesse fra NeuN-negativ PAX6-negativ befolkning. For bulk enkeltkjerne RNA-sekvensering, etter å ha samlet 50.000 til 500.000 kjernekjerner i 0,04% BSA-supplert PBS, tilsett to milliliter sukroseoppløsning, 50 mikroliter av en-molar kalsiumklorid og 30 mikroliter av en-molar magnesiumacetat til prøven.Ta med det endelige volumet av suspensjonen opp til 10 milliliter med PBS. Bland rørinnholdet ved inversjon og inkuber reaksjonen på is i 15 minutter. Pellet kjernen ved sentrifugering og resuspend kjernen i en milliliter av RNA ekstraherende reagens.Deretter vortex røret, fryse prøven på tørris, og lagre kjernen på minus 80 grader Celsius. For bulk single-nucleus transposase-akseptabel kromatin sekvensering, samle 50,000 til 75, 000 kjerner i 0,04%BSA-supplert PBS i et mikrocentrifuge rør belagt med 5%BSA og fryse kjernen til nedstrøms analyse. Neuronale, astrocytt og oligodendrocytt stamcellepopulasjoner kan sorteres fra en fersk frossen postmortem menneskelig temporal neocortex prøve som demonstrert.Single-nucleus RNA sekvensering studier ytterligere prioritert PAX6 som en topp differensialt uttrykt kjernefysisk transkripsjon faktor på tvers av både protoplasmatiske og fibrøse voksne astrocytter subpopulations. Etter sortering kan celletypespesifikke transkripsjonsendringer i den primære patologiske epilepsi neocortex karakteriseres. I denne analysen bekreftet transkripsjonsanalyser at de PAX6-positive NeuN-negative populasjonene var robust beriket for panastrocyttmarkører og utarmet for nevronmarkører.Immunfluorescensfarging kan brukes til å bekrefte samlokalisering av PAX6 med glial fibrillært surt protein i humane kortikale astrocytter. Kortere postmortem intervaller er forbundet med en større intakt nuclei utvinning fra friske vev prøver. Et høyt utbytte av intakte kjerner kan gjenopprettes fra frossent vev opptil 24 timer ettermortem, men på 30 timer kan svært få intakte kjerner gjenopprettes.Det viktigste å huske er å få DEN PAX6-positive befolkningen fra den NeuN-negative befolkningen, fordi det er nevroner som også uttrykker PAX6, og vi ønsker å ekskludere dem. Denne teknikken tillot også studiet av astrocytter i epilepsi kirurgiske hjerneprøver, og ytterligere belyse molekylær dysregulering av menneskelige astrocytter i sammenheng med en bestemt patologisk nisje.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

En Optimalisert Prosedyre for fluorescens-aktivert Cell Sorting (FACS) Isolering av Autonome Neural stamfedre fra Visceral organer Fetal Mus

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Funksjonell Imaging av auditive cortex hos voksne katter ved hjelp av høy-feltet fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Isolasjon av distinkte cellepopulasjoner fra utviklings Cerebellum av microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Bruke fluorescensaktivert Cell Sorting å undersøke Cell-Type-Specific genuttrykk i Rat hjernevev

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sortering (FACS) og Gene Expression Analyse av Fos-uttrykker Nerveceller fra fersk og fryst Rat hjernevev

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Optimalisering av Laser-fangst Microdissection for isolering av innstigning Ganglion fra frisk-frosne menneskelig vev

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolasjon av voksen ryggmargen kjerner for massivt parallelle Single-kjernen RNA sekvensering

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Primær Cell kultur renset GABAergic eller Glutamatergic neurons etablert gjennom fluorescens-aktivert Cell sortering

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Få humanmikroglia fra voksent menneskelig hjernevev

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescensaktivert cellesortering-radioligog behandlet vev (FACS-RTT) for å bestemme cellulær opprinnelse av radioaktivt signal

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...