Name: isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00
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Gostamos de agradecer aos membros da Patologia e Neurocirurgia da Escola de Medicina Icahn do Monte Sinai pela ajuda na aquisição de tecido cerebral desidentifitado e no CORE de Citometria de Fluxo do ISMMS para aconselhamento especializado. O estudo foi parcialmente financiado pelo NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (para N.M.T.) e R61DA048207 (para S.A.).

NOTA: O Programa de Proteção de Sujeitos Humanos da Faculdade de Medicina Icahn do Monte Sinai (ISMMS) e seu Conselho de Revisão Institucional (IRB) assegura a conduta ética da pesquisa e do cumprimento das regulamentações federais, estaduais e institucionais. Neste estudo, todos os espécimes pós-morte utilizados foram desidentifitados, obtidos sob o consentimento adequado através do biorepositório, e foram isentos da designação de "pesquisa humana" pelo IRB do ISMMS (HS#14-01007).
1...

<ol>
	<li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain.">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).</li><li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PsychENCODE+project.">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).</li><li>Tome-Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+isolation+and+transcriptomic+profiling+informs+glial+pathology+in+human+temporal+lobe+epilepsy.">Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse.">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+Is+an+astrocyte-specific+nuclear+marker+in+the+adult+brain+outside+the+neurogenic+regions.">SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).</li><li>Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebral+cortical+neurogenesis+by+the+Pax6+transcription+factor.">Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).</li><li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurogenesis-controlling+factor,+Pax6,+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes.">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li><li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus.">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li><li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development.">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li><li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX6:+25th+anniversary+and+more+to+learn.">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li><li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy.">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li><li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue:+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium.">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li><li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+&#945;A.">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin &#945;A.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li></ol>

O desenho experimental seguindo o protocolo delineado deve ser finalizado após considerar vários fatores biológicos e técnicos. As amostras de tecido inicial são congeladas frescas, sem terem sido fixadas, e de preferência têm um curto intervalo de coleta pós-morte para maximizar a recuperação dos núcleos. Com base na experiência, um PMI de até 24 horas permite a recuperação adequada dos núcleos; no entanto, um PMI de 12 h ou menos é preferível para otimizar a recuperação de núcleos intactos. Fatores...

A complexidade molecular dos astrócitos humanos permanece pouco definida no tecido primário, exigindo melhores ferramentas para seu isolamento e caracterização em alta resolução, tanto na saúde quanto na doença. A separação de neurônios humanos intactos e glia de seu nicho tem se mostrado difícil devido ao acesso limitado de amostras de tecido cerebral fresco, à natureza fortemente interconectada dos processos gliais e neuronais, e à inevitável ativação celular durante o processamento, tudo isso limitando a caracterização molecular desses tipos celulares ex vivo1 . A classificação de núcleos ativados pela fluorescência (FANS) surgiu como uma alternativa à classificação de células vivas, permitindo a dissociação e o imunotagging das populações de núcleos a partir de tecido congelado. Na última década, o FANS tornou-se amplamente utilizado para isolar e caracterizar molecularmente populações de núcleos neuronais humanos (NeuN+) em uma variedade de espécimes cerebrais e regiões anatômicas 1,2,3,4.
No entanto, métodos semelhantes para isolar subpopulações específicas de núcleos gliais do córtex humano têm sido limitados, levando a uma relativa falta de sofisticação na compreensão da complexidade dos astrócitos em tecidos normais e doentes. Para isso, um protocolo publicado anteriormente foi adaptado para isolar populações neuronais humanas usando o FANS4, e um método foi validado para enriquecer para os astrócitos (e para progenitores oligodendroglial) usando uma combinação de anticorpos triplos, capturando astrócitos em condições de repouso e reativa5. Para enriquecer especificamente os astrócitos na fração de NeuN, anticorpos foram usados contra um dos dois fatores de transcrição conhecidos por serem expressos diferencialmente entre populações de astrócitos, pax6 ou fator de transcrição caixa de SRY 9 (SOX9)6,7. Pax6 é altamente expresso durante o desenvolvimento fetal precoce dentro de progenitores radiais semelhantes a glia em zonas germinais e contribui para neurogênese e gliogênese 8,9,10,11, bem como para especificação neuronal12. No adulto, pax6 é diferencialmente superexpresso em astrócitos humanosem repouso 6 e mostra co-expressão proteica com proteína ácida fibrilar gliana (GFAP) em astrócitos de tecido de epilepsia humana13.
Este protocolo descreve o isolamento simultâneo das populações de núcleos neocorticais e enriquecidos por astrócitos pelo FANS. O tecido pós-morte fresco (não fixado) (ou seja, congelado fresco) coletado do córtex adulto é primeiro dissociado mecanicamente e quimicamente. Após a lise e a ultracentrifugação em um gradiente de sacarose, os componentes citoplasmados e extracelulares são descartados enquanto os núcleos são retidos. Os núcleos são então rotulados com anticorpos nucleares fluorescentes conjugados correspondentes às linhagens alvo desejadas e classificados usando VENTILADORES. Após essa abordagem, o enriquecimento dos astrócitos é demonstrado nas populações PAX6+NeuN coletadas, validadas tanto por um painel qPCR direcionado quanto pelo sequenciamento nuclear de RNA a jusante.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS pH 7.2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>70013073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377A5MI</td>
			<td>mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN50A4MI</td>
			<td>mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Counting Chamber</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C614-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 40 &#181;M</td>
			<td>SP Scienceware</td>
			<td>136800040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Library Kit</td>
			<td>Illumina, Nextera</td>
			<td>FC-121&#8211;1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>WHEATON</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>BD FACSAria III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M13-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP234705J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian</td>
			<td>Clontech Laboratories</td>
			<td>635005</td>
			<td>Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J22638AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>non-ionic surfactant in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>reagent for isolation of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter Optima XE-100</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td>referred to as distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting

A complexidade dos astrócitos humanos permanece mal definida no tecido humano primário, exigindo melhores ferramentas para seu isolamento e caracterização molecular. A triagem de núcleos ativados pela fluorescência (FANS) pode ser usada para isolar e estudar com sucesso as populações de núcleos neuronais humanos (NeuN+) a partir de tecido arquivado congelado, evitando problemas associados ao manuseio de tecido fresco. No entanto, faltam esforços para isolar a astroglia da elemento não neuronal (NeuN-) Uma estratégia de imunotagging recentemente desenvolvida e validada usa três anticorpos fator de transcrição para isolar simultaneamente populações neuronais enriquecidas (NeuN+), astrócito (proteína de caixa emparelhada 6 (PAX6)+NeuN-), e progenitor de progenitor de oligodendrocite (OLIG2+NeuN-) populações de neocórtex temporal não-doente, fresco (não fixado)
Esta técnica mostrou-se útil para a caracterização de alterações transcriptome específicas do tipo celular no neocórtex da epilepsia patológica primária. Análises transcriômicas confirmaram que as populações classificadas por PAX6+NeuN são robustamente enriquecidas para marcadores pan-astrócitos e capturam astrócitos em condições de repouso e reativas. Este artigo descreve a metodologia FANS para o isolamento de populações de núcleos enriquecidos por astrócitos a partir de córtex humano congelado fresco, incluindo dissociação de tecido em suspensão de núcleo único (sn); imunotagging de núcleos com anticorpos anti-NeuN e anti-PAX6 fluorescentemente conjugados; Estratégias de gating do FANS e métricas de controle de qualidade para otimizar sensibilidade e especificidade durante a triagem e para confirmar o enriquecimento de astrócitos; e aquisição recomendada para sequenciamento de acessibilidade de transcriptome a jusante e cromatina em resolução a granel ou sn. Este protocolo é aplicável para amostras corticais não necróticas, congeladas e humanas com várias patologias e coleta recomendada de tecido pós-morte dentro de 24 h.

Os núcleos foram coletados de tecido neocórtex temporal fresco (não fixado) com um tempo de coleta pós-morte de 12 h. Após a dissociação do tecido em suspensão de núcleos, as amostras foram incubadas com anticorpos contra NeuN, PAX6 e OLIG2, e classificadas de acordo com o gating mostrado na Figura 1 e Figura 2. Os núcleos foram coletados de populações classificadas por NeuN+, PAX6+NeuN e OLIG2+NeuN (Figura 1E,F<...

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Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

Desenvolvemos um método que enriquece e isola populações de astrócitos humanos de tecido fresco congelado para uso em análises moleculares a jusante.

Isolamento de populações de astúcitos humanos adultos do córtex congelado fresco usando a classificação de núcleos ativados por fluorescência

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

Este protocolo pode ajudar cientistas interessados em estudar a função molecular dos astrócitos humanos em seu nicho nativo. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o isolamento e o enriquecimento de um tipo celular específico, astrócitos adultos de amostras de tecido cerebral humano em massa usando a triagem de núcleos ativados pela fluorescência. Essa metodologia pode ser aplicada à isolação de outros tipos celulares do neocórtex humano, como neurônios e células progenitoras de oligodendrocyte usando outros anticorpos conjugados fluorescentes apropriados.Comece a dissecar aproximadamente 200 a 400 miligramas de tecido de uma amostra de tecido córtex adulto adulto congelado. Coloque o tecido em um douncer de tecido de vidro de sete mililitros contendo quatro mililitros de tampão de lise gelada no gelo e triture o tecido aproximadamente 50 vezes. Transfira o homogeneizar para um tubo de polipropileno ultracentrifuge de 12 mililitros.Use uma pipeta de cinco mililitros para adicionar 6,5 mililitros de tampão de sacarose gelada ao fundo do tubo ultracentrífuga sem perturbar a interface entre a sacarose e o tecido homogeneizar. Para coletar os núcleos, ultracentrize o lysate por uma hora a 101, 814 vezes G e aspire cuidadosamente o supernascido e detritos sem perturbar a pelota. Adicione 0,1% BSA em PBS ao tubo de ultracentrícula para uma incubação de 10 minutos no gelo antes de reutilizar a pelota dos núcleos.Em seguida, use o azul trypan para visualizar os núcleos intactos sob um microscópio leve e para garantir que a concentração seja superior a 10 a 5 núcleos por mililitro Para a triagem ativada pela fluorescência dos núcleos isolados, adicione aproximadamente 20 microlitros da amostra resuspended a uma solução de anticorpo contendo o anticorpo anti-NeuN do flúor alexa 555. Adicione aproximadamente 20 microliters da amostra resuspended a uma solução de anticorpos contendo anticorpo anti-PAX6 conjugado pelo rato conjugado aPC. Após uma incubação de uma hora a quatro graus Celsius com agitação, protegido da luz, adicione DAPI a uma proporção de 1:1000 a todas as amostras e controles.Para incluir núcleos do tamanho apropriado e excluir glóbulos vermelhos e detritos, use um tubo de controle para gate as células por suas áreas de dispersão dianteira e lateral. Para selecionar a população de núcleos singlet, portão por área de dispersão dianteira versus largura de dispersão dianteira ou área de dispersão lateral versus largura ou altura de dispersão lateral. Portão da DAPI para incluir apenas os núcleos intactos e excluir quaisquer detritos e dobras.Depois de gating de acordo com quaisquer controles adicionais de fluorescência, execute a amostra de controle somente DAPI. Execute o controle apenas de fluor 555 da NeuN Alexa para determinar o corte para a mancha neun positiva no canal Alexa fluor 555. Execute o controle PAX6 somente APC para determinar o corte para a coloração PAX6-positive no canal APC.Depois de todos os controles terem sido executados, gate as células NeuN-positive para coletar os neurônios e gate as células PAX6 positivos com a população NeuN-negativo para coletar os astrócitos. Portão e coletar quaisquer populações gliais adicionais de interesse da população PAX6-negativa neun. Para sequenciamento de RNA de núcleo único a granel, depois de coletar 50.000 a 500.000 núcleos em PBS 0,04%BSA complementado, adicione dois mililitros de solução de sacarose, 50 microliters de cloreto de cálcio de um molar e 30 microlitres de acetato de magnésio de um molar à amostra.Leve o volume final da suspensão até 10 mililitros com PBS. Misture o conteúdo do tubo por inversão e incubar a reação no gelo por 15 minutos. Pellte os núcleos por centrifugação e resuspenda os núcleos em um mililitro de reagente extraindo RNA.Em seguida, vórtice do tubo, congele a amostra em gelo seco, e armazene os núcleos a menos 80 graus Celsius. Para sequenciamento de cromatina de núcleo único em massa, colete 50.000 a 75.000 núcleos em PBS 0,04% de BSA em um tubo de microcentrifuge revestido com 5%BSA e congele os núcleos até sua análise a jusante. Populações progenitoras neuronais, astrócitos e oligodendrocyte podem ser classificadas a partir de uma nova amostra de neocórtex temporal humano pós-morte congelada, como demonstrado.Estudos de sequenciamento de RNA de núcleo único priorizaram ainda mais o PAX6 como um fator de transcrição nuclear expresso diferencialmente em subpopulações de astrócitos adultos protoplasmáticos e fibrosos. Após a classificação, podem ser caracterizadas alterações de transcriptome específicas do tipo celular no neocórtex da epilepsia patológica primária. Nesta análise, análises transcriômicas confirmaram que as populações neun-negativas pax6-positivas foram robustamente enriquecidas para marcadores panastrocitis e esgotadas para marcadores neuronais.A coloração da imunofluorescência pode ser usada para confirmar a co-localização do PAX6 com proteína ácida fibrilar gliana em astrócitos cortical humanos. Intervalos pós-morte mais curtos estão associados a uma maior recuperação de núcleos intactos de amostras de tecido fresco. Um alto rendimento de núcleos intactos pode ser recuperado de tecido congelado até 24 horas após a morte, mas em 30 horas, muito poucos núcleos intactos podem ser recuperados.A coisa mais importante a se lembrar é obter a população PAX6-positiva da população NeuN-negativa, porque há neurônios que também expressam PAX6, e queremos excluir esses. Essa técnica também permitiu o estudo de astrócitos em amostras cerebrais cirúrgicas de epilepsia, elucidando ainda mais a desregulação molecular dos astrócitos humanos no contexto de um nicho patológico específico.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Um procedimento otimizado para fluorescência-ativado Isolamento classificação celular (FACS) da Autônomo progenitores neurais a partir de vísceras de ratos fetais

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Neurociência

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Imagem Funcional do Cortex Auditivo em gatos adultos usando de alta campo fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

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Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Usando fluorescência celular ativado Classificando a Examine-Cell-tipo específico Expressão Gênica em Tissue cérebro de um rato

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Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescência de células activadas (FACS) e Gene Análise da expressão de Fos-expressando neurônios de fresco e congelado cérebro de um rato Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Otimização de captura Laser Microdissection para o isolamento dos gânglios entéricos de tecido humano fresco congelado

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Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Cultura de células primárias de neurônios Gabaérgicos ou glutamatérgicos purificados estabelecidos através da triagem de células ativadas por fluorescência

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Obtenção de Microglia Humana de Tecido Cerebral Humano Adulto

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescência-Ativada Célula Desarmamento-Radiolige Tecido Tratado (FACS-RTT) para determinar a origem celular do sinal radioativo

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...