Name: isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить членов в области патологии и нейрохирургии в Медицинской школе Икана на горе Синай за помощь в приобретении деидентифицированной мозговой ткани и ПРОточной цитометрии ISMMS CORE за советы экспертов. Исследование частично финансировалось NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (до N.M.T.) и R61DA048207 (до S.A.).

ПРИМЕЧАНИЕ: Программа защиты людей в Медицинской школе Икана на горе Синай (ISMMS) и ее Институциональный наблюдательный совет (IRB) обеспечивают этичное проведение исследований и соблюдение федеральных, государственных и институциональных правил. В этом исследовании все использованные ?...

<ol>
	<li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain.">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).</li><li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PsychENCODE+project.">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).</li><li>Tome-Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+isolation+and+transcriptomic+profiling+informs+glial+pathology+in+human+temporal+lobe+epilepsy.">Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse.">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+Is+an+astrocyte-specific+nuclear+marker+in+the+adult+brain+outside+the+neurogenic+regions.">SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).</li><li>Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebral+cortical+neurogenesis+by+the+Pax6+transcription+factor.">Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).</li><li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurogenesis-controlling+factor,+Pax6,+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes.">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li><li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus.">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li><li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development.">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li><li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX6:+25th+anniversary+and+more+to+learn.">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li><li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy.">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li><li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue:+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium.">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li><li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+&#945;A.">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin &#945;A.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li></ol>

Экспериментальный проект в соответствии с изложенным протоколом должен быть завершен после рассмотрения нескольких биологических и технических факторов. Исходные образцы тканей являются свежезамороженными, без фиксации и предпочтительно имеют короткий интервал посмертного сбора ?...

Молекулярная сложность астроцитов человека остается плохо определенной в первичной ткани, что требует лучших инструментов для их выделения и характеристики с высоким разрешением, как в здоровье, так и в болезни. Отделение неповрежденных человеческих нейронов и глии от их ниши оказалось затруднительным из-за ограниченного доступа к свежим образцам мозговой ткани, сильно взаимосвязанной природы глиальных и нейронных процессов и неизбежной клеточной активации во время обработки, все из которых ограничивают молекулярную характеристику этих типов клеток ex vivo1. . Флуоресцентно-активированная сортировка ядер (FANS) появилась в качестве альтернативы сортировке живых клеток, что позволяет диссоциировать и иммунотегировать популяции ядер из замороженной ткани. В последнее десятилетие FANS стал широко использоваться для выделения и молекулярной характеристики популяций нейронов человека (NeuN+) в различных образцах мозга и анатомических областях 1,2,3,4.
Однако аналогичные методы выделения специфических субпопуляций глиальных ядер из коры головного мозга человека были ограничены, что привело к относительному отсутствию сложности в понимании сложности астроцитов как в нормальных, так и в больных тканях. С этой целью был адаптирован ранее опубликованный протокол для выделения популяций нейронов человека с использованием FANS 4, и былутвержден метод обогащения астроцитов (и олигодендроглиальных предшественников) с использованием комбинации тройных антител, захватывающей астроциты как в состоянии покоя, так и в реактивных условиях5. Чтобы специфически обогатить астроциты в NeuN-фракции, антитела использовали против одного из двух факторов транскрипции, которые, как известно, дифференциально экспрессируются в популяциях астроцитов, PAX6 или фактор транскрипции SRY-box 9 (SOX9)6,7. PAX6 высоко экспрессируется во время раннего развития плода в радиальных глиоподобных предшественниках в зародышевых зонах и способствует как нейрогенезу, так и глиогенезу 8,9,10,11, а также спецификации нейронов сетчатки12. У взрослого человека PAX6 дифференциально сверхэкспрессируется в покоящихся астроцитах человека6 и проявляет коэкспрессию белка с глиальным фибриллярным кислым белком (GFAP) в астроцитах ткани эпилепсии человека13.
Этот протокол описывает одновременную изоляцию неокортикальных нейрональных и обогащенных астроцитами популяций ядер FAN. Свежая (нефиксированная) замороженная (т.е. свежезамороженная) посмертная ткань, собранная из коры головного мозга взрослого человека, сначала механически и химически диссоциируется. После лизиса и ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы цитоплазматический и внеклеточный компоненты отбрасываются, а ядра сохраняются. Затем ядра мечутся флуоресцентно конъюгированными ядерными антителами, соответствующими желаемым целевым линиям, и сортируются с помощью FANS. Следуя этому подходу, обогащение астроцитов демонстрируется в собранных популяциях PAX6 + NeuN-, подтвержденных как целевой панелью qPCR, так и последующим секвенированием ядерной РНК.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS pH 7.2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>70013073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377A5MI</td>
			<td>mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN50A4MI</td>
			<td>mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Counting Chamber</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C614-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 40 &#181;M</td>
			<td>SP Scienceware</td>
			<td>136800040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Library Kit</td>
			<td>Illumina, Nextera</td>
			<td>FC-121&#8211;1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>WHEATON</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>BD FACSAria III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M13-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP234705J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian</td>
			<td>Clontech Laboratories</td>
			<td>635005</td>
			<td>Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J22638AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>non-ionic surfactant in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>reagent for isolation of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter Optima XE-100</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td>referred to as distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting

Сложность астроцитов человека остается плохо определенной в первичной ткани человека, что требует лучших инструментов для их выделения и молекулярной характеристики. Флуоресцентно-активированная сортировка ядер (FANS) может быть использована для успешной изоляции и изучения популяций нейронов человека (NeuN+) из замороженной архивной ткани, тем самым избегая проблем, связанных с обработкой свежей ткани. Однако усилия по аналогичной изоляции астроглии от ненейронального (NeuN-) элемента отсутствуют. Недавно разработанная и валидированная стратегия иммунотегирования использует три антитела транскрипционного фактора для одновременного выделения обогащенных нейрональных (NeuN+), астроцитарных (парный бокс-белок 6 (PAX6) + NeuN-) и олигодендроцитарных предшественников (OLIG2 + NeuN-) популяций из небольшей, свежей (незафиксированной) замороженной посмертной височной неокортексной ткани человека.
Было показано, что этот метод полезен для характеристики специфических для типа клеток изменений транскриптома при первичной патологической эпилепсии неокортекса. Транскриптомные анализы подтвердили, что популяции, отсортированные PAX6 + NeuN, надежно обогащены панастроцитарными маркерами и захватывают астроциты как в условиях покоя, так и в реактивных условиях. В данной работе описана методология FANS по выделению обогащенных астроцитами популяций ядер из свежезамороженной коры головного мозга человека, включая диссоциацию тканей в одноядерную (sn) суспензию; иммунотегирование ядер анти-NeuN и анти-PAX6 флуоресцентно конъюгированными антителами; Стратегии сбора ФАН и метрики контроля качества для оптимизации чувствительности и специфичности при сортировке и для подтверждения обогащения астроцитов; и рекомендованные закупки для последующего секвенирования транскриптома и доступности хроматина при массовом разрешении или разрешении sn. Этот протокол применим для ненекротических, свежезамороженных, корковых образцов человека с различными патологиями и рекомендуемым посмертным забором тканей в течение 24 ч.

Ядра собирали из свежей (незафиксированной) замороженной височной ткани неокортекса со временем посмертного сбора 12 ч. После диссоциации тканей в суспензию ядер образцы инкубировали с антителами против NeuN, PAX6 и OLIG2 и сортировали в соответствии с гатой, показанной на рисунке ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting at JoVE.com

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

Мы разработали метод, который обогащает и изолирует человеческие популяции астроцитов из свежезамороженной ткани для использования в последующих молекулярных анализах.

Выделение популяций взрослых астроцитов человека из свежезамороженной коры с помощью флуоресцентно-активированной сортировки ядер

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

Этот протокол может помочь ученым, которые заинтересованы в изучении молекулярной функции астроцитов человека в своей родной нише. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет выделять и обогащать определенный тип клеток, взрослых астроцитов из объемных образцов мозговой ткани человека с использованием флуоресцентно-активированной сортировки ядер. Эта методология может быть применена для выделения других типов клеток из неокортекса человека, таких как нейроны и клетки-предшественники олигодендроцитов с использованием других соответствующих флуоресцентно-конъюгированных антител.Начните рассечение примерно от 200 до 400 миллиграммов ткани из свежезамороженного образца ткани коры головного мозга взрослого человека. Поместите ткань в семимиллилитровую стеклянную ткань, содержащую четыре миллилитра ледяного лизисного буфера на льду, и измельчите ткань примерно 50 раз. Перенесите гомогенат в 12-миллилитровую ультрацентрифужную полипропиленовую трубку.Используйте пятимиллилитровую пипетку, чтобы добавить 6,5 миллилитров ледяного буфера сахарозы на дно ультрацентрифужной трубки, не нарушая границу раздела между сахарозой и гомогенатом ткани. Чтобы собрать ядра, ультрацентрифугируйте лизат в течение одного часа при 101, 814 раз G и тщательно аспирируйте супернатант и мусор, не нарушая гранулу. Добавьте 0,1% BSA в PBS в ультрацентрифужную трубку для 10-минутной инкубации на льду перед повторным использованием гранулы ядер.Затем используйте трипан синий для визуализации интактных ядер под световым микроскопом и для обеспечения того, чтобы концентрация была выше 10 до пятого ядра на миллилитр Для флуоресцентно-активированной сортировки изолированных ядер добавьте примерно 20 микролитров повторно суспендированного образца к раствору антител, содержащему Alexa fluor 555 конъюгированного мышиного анти-NeuN антитела. Добавьте приблизительно 20 микролитров повторно суспендированного образца к раствору антител, содержащему APC-конъюгированное мышиное антитело против PAX6. После часовой инкубации при четырех градусах Цельсия с встряхиванием, защищенным от света, добавьте DAPI в соотношении 1:1000 ко всем образцам и контрольной группе.Чтобы включить ядра соответствующего размера и исключить эритроциты и мусор, используйте контрольную трубку, чтобы загнать клетки в их передние и боковые области рассеяния. Чтобы выбрать популяцию синглетных ядер, затвор по прямой области рассеяния против прямой ширины рассеяния или высоты и области бокового рассеяния против ширины или высоты бокового рассеяния. Gate by DAPI для включения только интактных ядер синглетов и для исключения любых обломков и дублетов.После обработки в соответствии с любыми дополнительными флуоресцентными элементами управления запустите контрольный образец, предназначенный только для DAPI. Запустите элемент управления NeuN Alexa fluor 555, чтобы определить отсечку для NeuN-положительного окрашивания в канале Alexa fluor 555. Запустите элемент управления PAX6 APC только для определения отсечки для PAX6-положительного окрашивания в канале APC.После того, как все контрольные элементы были запущены, затвор NeuN-положительные клетки для сбора нейронов и GATE PAX6-положительные клетки с NeuN-отрицательной популяцией для сбора астроцитов. Выйдите и соберите любые дополнительные глиальные популяции, представляющие интерес, из NeuN-отрицательной PAX6-отрицательной популяции. Для объемного одноядерного секвенирования РНК после сбора от 50 000 до 500 000 ядер в 0,04% PBS, дополненном BSA, добавляют в образец два миллилитра раствора сахарозы, 50 микролитров одномолярного хлорида кальция и 30 микролитров одномолярного ацетата магния.Доведите конечный объем суспензии до 10 миллилитров с PBS. Перемешайте содержимое пробирки путем инверсии и инкубируйте реакцию на льду в течение 15 минут. Гранулируют ядра центрифугированием и повторно суспендируют ядра в одном миллилитре реагента, экстрагирующего РНК.Затем вихрьте трубку, заморозьте образец на сухом льду и храните ядра при минус 80 градусах Цельсия. Для объемного одноядерного транспозазно-приемлемого секвенирования хроматина соберите от 50 000 до 75 000 ядер в 0,04% PBS, дополненный BSA, в микроцентрифужной трубке, покрытой 5% BSA, и заморозьте ядра до их последующего анализа. Популяции нейрональных, астроцитарных и олигодендроцитарных ядер-предшественников могут быть отсортированы из свежезамороженного посмертного образца височной неокортекса человека, как показано на рисунке.Исследования секвенирования одноядерной РНК дополнительно определили приоритет PAX6 в качестве верхнего дифференциально экспрессируемого фактора ядерной транскрипции как в протоплазматических, так и в волокнистых субпопуляциях взрослых астроцитов. После сортировки могут быть охарактеризованы специфические для типа клеток изменения транскриптома в первичной патологической эпилепсии неокортекса. В этом анализе транскриптомный анализ подтвердил, что PAX6-положительные NeuN-отрицательные популяции были надежно обогащены маркерами панастроцитов и истощены для нейронных маркеров.Иммунофлуоресцентное окрашивание может быть использовано для подтверждения совместной локализации PAX6 с глиальным фибриллярным кислым белком в корковых астроцитах человека. Более короткие посмертные интервалы связаны с большим восстановлением интактных ядер из свежих образцов тканей. Высокий выход интактных ядер может быть извлечен из замороженной ткани до 24 часов после вскрытия, но через 30 часов очень немногие интактные ядра могут быть восстановлены.Самое главное, что нужно помнить, это получить PAX6-положительную популяцию из NeuN-отрицательной популяции, потому что есть нейроны, которые также экспрессируют PAX6, и мы хотим исключить их. Этот метод также позволил изучить астроциты в хирургических образцах головного мозга эпилепсии, дополнительно выявив молекулярную дисрегуляцию астроцитов человека в контексте конкретной патологической ниши.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Оптимизирована процедура для флуоресцентной активированного сортировки клеток (FACS) Выделение вегетативной нервной прародителей из висцеральных органов плода мышей

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Функциональной визуализации из слуховой коры у взрослых кошек с использованием высокого поля МРТ

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Выделение различных клеточных популяций из развивающихся мозжечка микродиссекции

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Флуоресценция Активированный сортировки клеток (FACS) и экспрессии генов Анализ Fos-экспрессирующих Нейроны из свежих и замороженных крыс ткани головного мозга

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Оптимизации лазер захват Microdissection для изоляции кишечных ганглиев от свежемороженые тканей человека

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Изоляция взрослых спинной ядра для массивно параллельной сингл ядро РНК последовательности

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Первичная культура клеток очищенных ГАМК или глутамергических нейронов, созданных с помощью флуоресценции активированной сортировки клеток

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Получение человеческой микроглии от взрослых тканей мозга человека

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Флуоресцентно-активированная клеточная сортировка-радиолигандная обработанная ткань (FACS-RTT) для определения клеточного происхождения радиоактивного сигнала

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...