Name: isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting at JoVE.com

Vi vill tacka medlemmar i patologi och neurokirurgi vid Icahn School of Medicine vid Mount Sinai för hjälp med upphandling av avidentifierad hjärnvävnad och ISMMS: s Flow Cytometry CORE för expertråd. Studien finansierades delvis av NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (till N.M.T.) och R61DA048207 (till S.A.).

OBS: Programmet för skydd av mänskliga ämnen vid Icahn School of Medicine vid Mount Sinai (ISMMS) och dess Institutionella granskningsnämnd (IRB) säkerställer det etiska genomförandet av forskning och efterlevnad av federala, statliga och institutionella bestämmelser. I denna studie avidentifierades alla använda postmortemprover, erhölls under lämpligt samtycke genom biorepositoriet och var undantagna från "mänsklig forskning" -beteckning av ISMMS: s IRB (HS # 14-01007).
1. Förbere...

<ol>
	<li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain.">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).</li><li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PsychENCODE+project.">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).</li><li>Tome-Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+isolation+and+transcriptomic+profiling+informs+glial+pathology+in+human+temporal+lobe+epilepsy.">Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse.">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+Is+an+astrocyte-specific+nuclear+marker+in+the+adult+brain+outside+the+neurogenic+regions.">SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).</li><li>Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebral+cortical+neurogenesis+by+the+Pax6+transcription+factor.">Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).</li><li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurogenesis-controlling+factor,+Pax6,+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes.">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li><li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus.">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li><li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development.">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li><li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX6:+25th+anniversary+and+more+to+learn.">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li><li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy.">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li><li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue:+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium.">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li><li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+&#945;A.">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin &#945;A.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li></ol>

Experimentell design enligt det skisserade protokollet bör slutföras efter att ha beaktat flera biologiska och tekniska faktorer. Startvävnadsprover är färskfrysta, utan att ha fixats, och har helst ett kort insamlingsintervall efter döden för att maximera kärnåtervinningen. Baserat på erfarenhet möjliggör ett PMI på upp till 24 timmar tillräcklig kärnåtervinning; emellertid är ett PMI på 12 h eller mindre att föredra för att optimera intakt kärnåtervinning. Ytterligare faktorer förutom PMI, inklus...

Den molekylära komplexiteten hos humana astrocyter förblir dåligt definierad i primär vävnad, vilket kräver bättre verktyg för deras isolering och karakterisering vid hög upplösning, både i hälsa och sjukdom. Separation av intakta mänskliga neuroner och glia från deras nisch har visat sig vara svårt på grund av begränsad tillgång till färska hjärnvävnadsprover, den starkt sammankopplade naturen hos glial- och neuronala processer och oundviklig cellulär aktivering under bearbetningen, som alla begränsar den molekylära karakteriseringen av dessa celltyper ex vivo1 . Fluorescensaktiverad kärnsortering (FANS) har dykt upp som ett alternativ till levande cellsortering, vilket möjliggör dissociation och immunotagging av kärnor från frusen vävnad. Under det senaste decenniet har FANS blivit allmänt använt för att isolera och molekylärt karakterisera mänskliga neuronala (NeuN+) kärnorpopulationer i en mängd olika hjärnprover och anatomiska regioner 1,2,3,4.
Liknande metoder för att isolera specifika glialkärnor subpopulationer från human cortex har dock begränsats, vilket leder till en relativ brist på sofistikering i förståelsen av astrocytkomplexitet i både normala och sjuka vävnader. För detta ändamål anpassades ett tidigare publicerat protokoll för att isolera humana neuronala populationer med hjälp av FANS4, och en metod validerades för att berika för astrocyter (och för oligodendrogliala förfäder) med hjälp av en trippel-antikroppskombination, som fångar astrocyter i både vilande och reaktiva förhållanden5. För att specifikt berika för astrocyter i NeuN-fraktionen användes antikroppar mot en av två transkriptionsfaktorer som är kända för att uttryckas differentiellt över astrocytpopulationer, PAX6 eller SRY-box transkriptionsfaktor 9 (SOX9)6,7. PAX6 uttrycks starkt under tidig fosterutveckling inom radiella glialiknande förfäder i germinalzoner och bidrar till både neurogenes och gliogenes 8,9,10,11 samt till retinal neuronal specifikation 12. Hos vuxna är PAX6 differentiellt överuttryckt i vilande humana astrocyter6 och visar proteinsamuttryck med glialfibrillärt surt protein (GFAP) i humana epilepsivävnadsastrocyter13.
Detta protokoll beskriver samtidig isolering av neokortikala neuronala och astrocytberikade kärnorpopulationer av FANS. Färsk (ofixerad) snapfryst (dvs. färskfryst) postmortemvävnad som samlats in från vuxen cortex dissocieras först mekaniskt och kemiskt. Efter lys och ultracentrifugering i en sackarosgradient kasseras de cytoplasmatiska och extracellulära komponenterna medan kärnorna behålls. Kärnor märks sedan med fluorescerande konjugerade kärnantikroppar som motsvarar de önskade mållinjerna och sorteras med hjälp av FANS. Efter detta tillvägagångssätt demonstreras anrikning av astrocyter i de insamlade PAX6 + NeuN-populationerna, validerade både av en riktad qPCR-panel och genom nedströms kärn-RNA-sekvensering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS pH 7.2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>70013073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377A5MI</td>
			<td>mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN50A4MI</td>
			<td>mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Counting Chamber</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C614-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 40 &#181;M</td>
			<td>SP Scienceware</td>
			<td>136800040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Library Kit</td>
			<td>Illumina, Nextera</td>
			<td>FC-121&#8211;1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>WHEATON</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>BD FACSAria III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M13-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP234705J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian</td>
			<td>Clontech Laboratories</td>
			<td>635005</td>
			<td>Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J22638AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>non-ionic surfactant in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>reagent for isolation of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter Optima XE-100</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td>referred to as distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting

Komplexiteten hos humana astrocyter förblir dåligt definierad i primär mänsklig vävnad, vilket kräver bättre verktyg för deras isolering och molekylära karakterisering. Fluorescensaktiverad kärnsortering (FANS) kan användas för att framgångsrikt isolera och studera humana neuronala kärnor (NeuN+) populationer från frusen arkivvävnad och därigenom undvika problem i samband med hantering av färsk vävnad. Emellertid saknas ansträngningar för att på liknande sätt isolera astroglia från det icke-neuronala (NeuN-) elementet. En nyligen utvecklad och validerad immuntaggningsstrategi använder tre transkriptionsfaktorantikroppar för att samtidigt isolera berikade neuronala (NeuN+), astrocyt (parat lådprotein 6 (PAX6)+NeuN-) och oligodendrocytförfäder (OLIG2+NeuN-) kärnor från icke-sjuka, färska (ofixerade) snapfrysta human temporal neocortexvävnader.
Denna teknik visade sig vara användbar för karakterisering av celltypspecifika transkriptomförändringar vid primär patologisk epilepsi neocortex. Transkriptomiska analyser bekräftade att PAX6+NeuN-sorterade populationer är robust berikade för pan-astrocytmarkörer och fångar astrocyter under både vilande och reaktiva förhållanden. Detta dokument beskriver FANS-metoden för isolering av astrocytberikade kärnpopulationer från nyfryst mänsklig cortex, inklusive vävnadsdissociation till enkärnig (sn) suspension; immunotagging av kärnor med anti-NeuN och anti-PAX6 fluorescerande konjugerade antikroppar; FANS gating strategier och kvalitetskontroll mätvärden för att optimera känslighet och specificitet under sortering och för att bekräfta astrocytberikning; och rekommenderad upphandling för nedströms transkriptom- och kromatintillgänglighetssekvensering vid bulk- eller sn-upplösning. Detta protokoll är tillämpligt för icke-nekrotiska, färskfrysta, humana kortikala prover med olika patologier och rekommenderad vävnadsuppsamling efter döden inom 24 timmar.

Kärnor samlades in från färsk (ofixerad) snapfryst temporal neocortexvävnad med en uppsamlingstid efter döden på 12 timmar. Efter vävnadsdissociation till kärnorsuspension inkuberades prover med antikroppar mot NeuN, PAX6 och OLIG2 och sorterades enligt gating som visas i figur 1 och figur 2. Kärnor samlades in från NeuN+, PAX6+NeuN-, och OLIG2+NeuN-sorterade populationer (Figur 1E,F och <strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting at JoVE.com

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

Vi har utvecklat en metod som berikar för och isolerar humana astrocytpopulationer från färskfryst vävnad för användning i nedströms molekylära analyser.

Isolering av vuxna mänskliga astrocytpopulationer från färskfryst cortex med fluorescensaktiverad kärnsortering

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

Detta protokoll kan hjälpa forskare som är intresserade av att studera den molekylära funktionen hos humana astrocyter i sin inhemska nisch. Den största fördelen med denna teknik är att den möjliggör isolering och anrikning av en specifik celltyp, vuxna astrocyter från bulkprover av mänsklig hjärnvävnad med användning av fluorescensaktiverad kärnsortering. Denna metod kan tillämpas för att isolera andra celltyper från human neocortex, såsom neuroner och oligodendrocytprogenitorceller med användning av andra lämpliga fluorescerande konjugerade antikroppar.Börja dissekera cirka 200 till 400 milligram vävnad från ett nytt fryst mänskligt mänskligt cortexvävnadsprov. Placera vävnaden i en sju milliliter glasvävnad douncer som innehåller fyra milliliter iskall lysbuffert på is och slipa vävnaden cirka 50 gånger. Överför homogenatet till ett 12-milliliter ultracentrifug polypropenrör.Använd en pipett på fem milliliter för att tillsätta 6,5 ml iskall sackarosbuffert till botten av ultracentrifugröret utan att störa gränssnittet mellan sackaros och vävnadshomogenatet. För att samla kärnorna, ultracentrifugera lysaten i en timme vid 101, 814 gånger G och aspirera försiktigt supernatanten och skräpet utan att störa pelleten. Tillsätt 0,1% BSA i PBS till ultracentrifugröret för en 10-minuters inkubation på is innan du återanvänder kärnpelleten.Använd sedan trypanblått för att visualisera de intakta kärnorna under ett ljusmikroskop och för att säkerställa att koncentrationen är över 10 till de femte kärnorna per milliliter För fluorescensaktiverad sortering av de isolerade kärnorna, tillsätt cirka 20 mikroliter av det återsuspenderade provet till en antikroppslösning innehållande Alexa fluor 555 konjugerad musanti-NeuN-antikropp. Tillsätt cirka 20 mikroliter av det återsuspenderade provet till en antikroppslösning som innehåller APC-konjugerad anti-PAX6-antikropp från mus. Efter en timmes inkubation vid fyra grader Celsius med skakning, skyddad från ljus, tillsätt DAPI i förhållandet 1: 1000 till alla prover och kontroller.För att inkludera kärnor av lämplig storlek och för att utesluta röda blodkroppar och skräp, använd ett kontrollrör för att styra cellerna genom deras främre och sidospridningsområden. För att välja singlet-kärnpopulationen, gate by forward scatter area versus forward scatter width or height och side scatter area versus side scatter width or height. Gate av DAPI för att endast inkludera de intakta kärnorna singlets och för att utesluta skräp och dubbletter.Efter gating enligt eventuella ytterligare fluorescenskontroller, kör endast DAPI-kontrollprovet. Kör endast NeuN Alexa fluor 555-kontrollen för att bestämma avstängningen för neuN-positiv färgning i Alexa fluor 555-kanalen. Kör endast PAX6 APC-kontrollen för att fastställa gränsen för den PAX6-positiva färgningen i APC-kanalen.När alla kontroller har körts, gate de NeuN-positiva cellerna för att samla neuronerna och gate de PAX6-positiva cellerna med den NeuN-negativa populationen för att samla astrocyterna. Porta och samla in eventuella ytterligare glialpopulationer av intresse från den NeuN-negativa PAX6-negativa populationen. För bulk-enkärnig RNA-sekvensering, efter uppsamling av 50 000 till 500 000 kärnor i 0,04% BSA-kompletterad PBS, tillsätt två milliliter sackaroslösning, 50 mikroliter av en molär kalciumklorid och 30 mikroliter av en molar magnesiumacetat till provet.Ta den slutliga volymen av suspensionen upp till 10 ml med PBS. Blanda rörinnehållet genom inversion och inkubera reaktionen på is i 15 minuter. Pelletera kärnorna genom centrifugering och återsuspendera kärnorna i en milliliter RNA-extraktionsreagens.Virvla sedan röret, frys provet på torris och förvara kärnorna vid minus 80 grader Celsius. För bulk-single-nucleus transposase-acceptabel kromatinsekvensering, samla 50 000 till 75 000 kärnor i 0,04% BSA-kompletterad PBS i ett mikrocentrifugrör belagt med 5% BSA och frys kärnorna tills deras nedströmsanalys. Neuronala, astrocyt- och oligodendrocytprogenitorkärnor kan sorteras från ett färskt fryst humant temporalt neocortexprov efter döden som visat.Enkärniga RNA-sekvenseringsstudier prioriterade vidare PAX6 som en toppdifferentierat nukleär transkriptionsfaktor över både protoplasmiska och fibrösa vuxna astrocyter subpopulationer. Efter sortering kan celltypspecifika transkriptomförändringar i den primära patologiska epilepsi neocortex karakteriseras. I denna analys bekräftade transkriptomiska analyser att de PAX6-positiva NeuN-negativa populationerna var robust berikade för panastrocytmarkörer och utarmade för neuronala markörer.Immunofluorescensfärgning kan användas för att bekräfta samlokaliseringen av PAX6 med glialfibrillärt surt protein i humana kortikala astrocyter. Kortare postmortemintervaller är förknippade med en större intakt kärnåtervinning från färska vävnadsprover. Ett högt utbyte av intakta kärnor kan återvinnas från frusen vävnad upp till 24 timmar efter döden, men vid 30 timmar kan mycket få intakta kärnor återvinnas.Det viktigaste att komma ihåg är att få den PAX6-positiva befolkningen från den NeuN-negativa befolkningen, eftersom det finns neuroner som också uttrycker PAX6, och vi vill utesluta dem. Denna teknik möjliggjorde också studier av astrocyter i epilepsikirurgiska hjärnprover, vilket ytterligare belyser molekylär dysreglering av humana astrocyter i samband med en specifik patologisk nisch.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Ett optimerat förfarande för fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) Isolering av autonom neural progenitorer från viscerala organ för Fetala Möss

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Funktionell avbildning av hörselbarken hos vuxna katter med hjälp av hög-fält fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Isolering av Distinkta cellpopulationer från utvecklings Cerebellum från Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Använda Fluorescensaktiverad cellsortering för att Undersök Cell-Type-Specific Gene Expression i råtthjärnvävnad

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och Gene Expression Analys av Fos-uttryckande nervceller från färsk och fryst Rat hjärnvävnad

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Optimering av Laser-Capture lokalt för isolering av enteriska ganglier från färskfryst mänsklig vävnad

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolering av vuxna ryggmärgen kärnor för massivt parallella singel-nucleus RNA-sekvensering

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Primär cell kultur av renade GABAergic eller Glutamatergic nerv celler etablerad genom Fluorescence-aktive rad cell sortering

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Erhålla mänskliga Microglia från Vuxna mänskliga hjärnvävnaden

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescensaktiverad cellsortering-radioligandbehandlad vävnad (FACS-RTT) för att bestämma det cellulära ursprunget för radioaktiv signal

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...