Name: investigating the phagocytosis of leishmania using confocal microscopy
Uploaded: 2021-07-29T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy at JoVE.com

Vi tackar Gonçalo Moniz Institute, Fiocruz Bahia, Brasilien och avdelningen för mikroskopi för hjälp. Detta arbete stöddes av INOVA-FIOCRUZ nummer 79700287000, P.S.T.V. har ett bidrag för produktivitet i forskning från CNPq (305235/2019-2). Plasmider tillhandahölls vänligen av Mauricio Terebiznik, University of Toronto, CA. Författarna vill tacka Andris K. Walter för engelskspråkig revision och hjälp med redigering av manuskript.

Celler erhölls från friska givare efter godkännande av förfaranden av de nationella forskningsetiska kommittéerna (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. Cellkulturer
<ol><li>Mänskliga monocyt-härledda makrofager OBS: För att erhålla humana monocyt-härledda makrofager för in vitro-differentiering till makrofager, samla blod från friska givare och rena mononukleära celler i perifert blod (PBMC) som beskrivs av D. English och B. R. Andersen21.<ol><li>Ef...

<ol>
	<li>Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+and+mucocutaneous+leishmaniasis.">Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+leishmaniases.">Control of the leishmaniases.</a> World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).</li><li>Alexander, J., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Leishmania+species+with+macrophages.">The interaction of Leishmania species with macrophages.</a> Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).</li><li>Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania-macrophage+interactions:+multiple+receptors,+multiple+ligands+and+diverse+cellular+responses.">Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses.</a> Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).</li><li>Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+Leishmania+infection.">Immune response to Leishmania infection.</a> Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).</li><li>Blackwell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophage+complement+and+lectin-like+receptors+in+binding+Leishmania+parasites+to+host+macrophages.">Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages.</a> Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).</li><li>Mosser, D. M., Edelson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+macrophage+receptor+for+C3bi+(CR3)+is+a+major+mechanism+in+the+phagocytosis+of+Leishmania+promastigotes.">The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes.</a> Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).</li><li>Gough, P. J., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+scavenger+receptors+in+the+innate+immune+system.">The role of scavenger receptors in the innate immune system.</a> Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).</li><li>Russell, D. G., Wilhelm, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+the+major+surface+glycoprotein+(gp63)+of+Leishmania+promastigotes+in+attachment+to+macrophages.">The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages.</a> Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).</li><li>Handman, E., Goding, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Leishmania+receptor+for+macrophages+is+a+lipid-containing+glycoconjugate.">The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate.</a> EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).</li><li>Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+donovani+lipophosphoglycan+causes+periphagosomal+actin+accumulation:+correlation+with+impaired+translocation+of+PKCalpha+and+defective+phagosome+maturation.">Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation.</a> Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).</li><li>Vergne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+phagolysosome+biogenesis+block+by+viable+Mycobacterium+tuberculosis.">Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).</li><li>Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intradermal+inoculations+of+low+doses+of+Leishmania+major+and+Leishmania+amazonensis+metacyclic+promastigotes+induce+different+immunoparasitic+processes+and+status+of+protection+in+BALB/c+mice.">Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice.</a> International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).</li><li>Gutierrez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+favours+the+generation+and+maturation+of+the+Coxiella-replicative+vacuoles.">Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles.</a> Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).</li><li>Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+promastigotes+require+lipophosphoglycan+to+actively+modulate+the+fusion+properties+of+phagosomes+at+an+early+step+of+phagocytosis.">Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).</li><li>Desjardins, M., Descoteaux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+phagolysosomal+biogenesis+by+the+Leishmania+lipophosphoglycan.">Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan.</a> Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).</li><li>Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis+and+properties+of+the+parasitophorous+vacuoles+that+harbour+Leishmania+in+murine+macrophages.">The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages.</a> Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).</li><li>Alexander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+IL-13+in+maintaining+a+non-healing+response+following+Leishmania+mexicana+infection.">An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection.</a> European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).</li><li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages.">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).</li><li>Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+mechanisms+by+which+Leishmania+parasites+can+escape+the+host+immune+response:+a+signaling+point+of+view.">Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view.</a> Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).</li><li>English, D., Andersen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+separation+of+red+blood+cells.+Granulocytes+and+mononuclear+leukocytes+on+discontinuous+density+gradients+of+Ficoll-Hypaque.">Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque.</a> Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).</li><li>Petersen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG+kills+intracellular+Leishmania+amazonensis+while+reducing+inflammatory+responses+in+infected+macrophages.">17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages.</a> PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).</li><li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection.">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).</li><li>Berges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-binding+1+protein+overexpression+correlates+with+glioblastoma+progression+and+sensitizes+to+Vinca-alkaloids+in+vitro+and+in+vivo.">End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo.</a> Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).</li><li>Franco, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Ligase+Smurf1+Functions+in+Selective+Autophagy+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+Anti-tuberculous+Host+Defense.">The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense.</a> Cell Host &amp; Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).</li><li>Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling-dependent+immobilization+of+acylated+proteins+in+the+inner+monolayer+of+the+plasma+membrane.">Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).</li><li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+activation+alters+inner+surface+potential+during+phagocytosis.">Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis.</a> Science. 313 (5785), 347-351 (2006).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Vieira, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Rab5+and+Rab7+recruitment+to+phagosomes+by+phosphatidylinositol+3-kinase.">Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).</li><li>Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+rab5+activation+in+endocytosis+and+phagocytosis.">Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).</li><li>Vitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+small+GTPase+Rab7+in+the+late+endocytic+pathway.">Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).</li><li>Matte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+major+Promastigotes+Evade+LC3-Associated+Phagocytosis+through+the+Action+of+GP63.">Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63.</a> PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).</li><li>Dias, B. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+Induction+Greatly+Enhances+Leishmania+major+Intracellular+Survival+Compared+to+Leishmania+amazonensis+in+CBA/j-Infected+Macrophages.">Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).</li><li>Babcock, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+phagocytosis+by+confocal+microscopy.">Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).</li><li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).</li><li>Lennartz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipases+and+phagocytosis:+the+role+of+phospholipid-derived+second+messengers+in+phagocytosis.">Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis.</a> International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).</li><li>Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+Early+Stages+of+Phagocytosis.">Visualizing the Early Stages of Phagocytosis.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).</li><li>Ramarao, N., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+resists+phagocytosis+by+macrophages:+quantitative+assessment+by+confocal+microscopy+and+fluorescence-activated+cell+sorting.">Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting.</a> Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).</li><li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging.">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).</li></ol>

Leishmania-makrofaginteraktion är en komplex process och involverar flera steg som kan påverka sjukdomsutveckling5. För att bättre förstå mekanismerna som är involverade i interaktionen mellan oopsoniserad leishmani och värdceller har vi beskrivit ett protokoll som använder konfokal fluorescensmikroskopi för att bedöma fagocytos från tidiga till sena stadier av Leishmania-infektion. Användningen av fluorescenstekniker som involverar två eller flera fluorofo...

Leishmaniasis är en försummad tropisk sjukdom orsakad av protozoa parasiter av släktet Leishmania, vilket resulterar i ett brett spektrum av kliniska manifestationer hos ryggradsdjurens värd, inklusive kutan leishmaniasis, mukokutan leishmaniasis och visceral leishmaniasis1. Världshälsoorganisationen (WHO) uppskattar att över en miljard människor är i riskzonen, med mer än en miljon nya fall rapporterade per år2.
är obligatoriska intracellulära protozoer som överlever inuti värdceller, inklusive monocyter, makrofager och dendritiska celler3. Leishmania-makrofaginteraktion är en komplex process som involverar flera värdcellreceptorer och parasitligander antingen genom direkt interaktion eller genom opsonisering som involverar komplementreceptorer 4,5. Klassiska ytreceptorer, såsom CR1, CR3, mannos-fukos, fibronektin, tollliknande och scavengerreceptorer, förmedlar parasitbindning till makrofager 6,7,8. Dessa receptorer känner igen molekyler på ytan av Leishmania, inklusive 63 kDa glykoprotein (gp63) och glykolipid lipophosphoglycan (LPG)9. Dessa är de vanligaste molekylerna på ytan av promastigotes och spelar en viktig roll i subversionen av värdimmunsvaret, vilket gynnar upprättandet av parasitinfektion i däggdjursceller10. Efter parasitytans ligander binder till makrofagreceptorer ackumuleras F-aktin på däggdjurscellytor, omgivande parasiter när de fagocytoseras. Därefter leder detta till bildandet av ett parasitinducerat fack som kallas parasitoforisk vakuol (PV), som presenterar fagolysosomala egenskaper11. En gång inuti dessa fagolysosomer genomgår parasiter flera förändringar som är väsentliga för överlevnad och multiplikation3.
Biogenesen av PVs är en starkt reglerad membranhandelsprocess som är kritisk för den intracellulära överlevnaden av denna patogen12. Bildandet av detta fack är resultatet av sekventiella fusionshändelser mellan fagosomer och fack i värdens endocytiska väg. Klassiska cellbiologiska studier har visat att mognad av PVs involverar förvärv av monomera G-protein Rab 5 och Rab 7-proteiner, som huvudsakligen är förknippade med tidig respektive sen endosommognad13. Dessutom förvärvar dessa fack lysosomassocierade membranproteiner 1 och 2 (LAMP 1, LAMP 2), de viktigaste proteinbeståndsdelarna i det lysosomala membranet och mikrotubuliassocierat protein 1A/1B-ljuskedja 3 (LC3), en autofagosommarkör14. Trots uppenbara likheter varierar kinetiken för PV-bildning15,16 och morfologin hos dessa fack beroende på Leishmania-arter. Till exempel inducerar infektion orsakad av L. mexicana eller L. amazonensis bildandet av stora fack som innehåller ett stort antal parasiter17. Däremot bildar andra arter, såsom L. braziliensis och L. infantum, mindre vakuoler som normalt bara innehåller en eller två parasiter i varje vakuol18.
Trots denna kunskap kring interaktionen mellan värdcell och leishmania har de initiala händelserna som utlösts av kontakt mellan värdreceptorer och parasitligander inte helt klarlagts. Dessa händelser är kända för att vara determinanter för resultatet av parasitinfektion och är beroende av parasitarter, typen av värdcellreceptorer som rekryteras för att känna igen parasiter och aktiveringen av makrofagsignalvägar19,20. Därför är det viktigt att identifiera de molekyler som är involverade i biogenesen av Leishmania-inducerade PVs och bestämma vilken eller vilka roller dessa molekyler spelar för infektionsetablering och resultat. Här beskriver vi en metod för att övervaka tidiga händelser som inträffar under fagocytosen av Leishmania, inklusive bindning, internalisering, fagosombildning och mognad. Detta arbete kan hjälpa till att klargöra deltagandet av PLC, Akt, Rab5, Rab7 och LC3 i bildandet av PVs inducerade av olika Leishmania-arter. Viktigt är att detta protokoll kan användas för att undersöka deltagandet av andra proteiner som är involverade i PV-mognad. Framtida studier kommer att utöka kunskapen kring mekanismer som är involverade i leishmania-värdcellsinteraktion och bidra till utformningen av nya kemoterapeutiska strategier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Tem varios no site</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LC3 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB600-1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellStripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red (CMTPX) Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centr&#237;fuga</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Isofarma</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscope (Leica SP8)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope (Olympus Lx73)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus Lx73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N&#8217;-2-ethane-sulfonic acid)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NS02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPA-1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol myristate acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer solution (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the phagocytosis of leishmania using confocal microscopy

Fagocytos är en orkestrerad process som involverar distinkta steg: erkännande, bindning och internalisering. Professionella fagocyter tar upp Leishmania-parasiter genom fagocytos, bestående av att känna igen ligander på parasitytor av flera värdcellreceptorer. Bindning av Leishmania till makrofagmembran sker genom komplementreceptortyp 1 (CR1) och komplementreceptortyp 3 (CR3) och mönsterigenkänningsreceptorer. Lipophosphoglycan (LPG) och 63 kDa glykoprotein (gp63) är de viktigaste liganderna som är involverade i makrofag-Leishmania-interaktioner . Efter det första erkännandet av parasitligander av värdcellreceptorer blir parasiter internaliserade, överlever och multipliceras inom parasitofora vakuoler. Mognadsprocessen av Leishmania-inducerade vakuoler involverar förvärv av molekyler från intracellulära vesiklar, inklusive monomert G-protein Rab 5 och Rab 7, lysosomalt associerat membranprotein 1 (LAMP-1), lysosomalt associerat membranprotein 2 (LAMP-2) och mikrotubuliassocierat protein 1A/1B-ljuskedja 3 (LC3).
Här beskriver vi metoder för att utvärdera de tidiga händelser som inträffar under Leishmania-interaktion med värdcellerna med hjälp av konfokalmikroskopi, inklusive (i) bindning (ii) internalisering och (iii) fagosommognad. Genom att lägga till kunskapen kring dessa determinanter för infektionsresultat hoppas vi kunna förbättra förståelsen för patogenesen av Leishmania-infektion och stödja den eventuella sökningen efter nya kemoterapeutiska mål.

Denna rapport syftar till att utvärdera de tidiga händelser som inträffar under fagocytosen av L. braziliensis isolerad från patienter som presenterar L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL form av CL. Med hjälp av konfokalmikroskopi undersökte vi de viktigaste händelserna i samband med parasiternas fagocytos: bindning, internalisering och fagosommognad. Vi utvärderade först L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL-bindning och fagocytos av humana monocyt-härledda ...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy at JoVE.com

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Mekanismen associerad med fagocytos vid Leishmania-infektion är fortfarande dåligt förstådd. Här beskriver vi metoder för att utvärdera de tidiga händelser som inträffar under Leishmania-interaktion med värdcellerna.

Undersökning av fagocytos av Leishmania med konfokalmikroskopi

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

Mekanismen associerad med fagocytos vid Leishmania-infektion är fortfarande dåligt förstådd. Här beskriver vi metoder för att utvärdera de tidiga tillstånden av härdning under Leishmania-interaktion med värdcellerna. Denna teknik presenterar som den största fördelen, vilket möjliggör studier av olika tillstånd av Leishmania phagocytos och deltagande av flera proteiner.Det är värt att notera att denna teknik också kan utvidgas till andra typer av studier, inklusive infektion med bakterier, jäst eller vare sig det är uppslukande av andra typer av celler. Människor som försöker denna teknik bör ta hand om cellernas exponeringstid för Nucleofector-lösningen. Dessutom föreslår vi att du börjar testa transfektion med högst två plasmider.Demonstrerande proceduren kommer att vara Amanda Reboucas, doktorand från vårt laboratorium. Till att börja med, frö 0,2 miljoner THP-1-celler, eller humana monocyt-härledda makrofager i 500 mikroliter RPMI per brunn på en 24-brunnsplatta med 13 millimeter glasskydd. Inkubera i 24 timmar vid 37 grader Celsius under 5% koldioxid, tvätta celler två gånger med 0,9% saltlösning och inkubera cellerna i ett komplett RPMI-medium.Lägg till stationär fas Leishmania-arter till cellerna vid en 10 parasit är till ett värdcellförhållande, och centrifugera sedan vid 720 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Efter inkubation av cellerna vid fyra grader Celsius i fem minuter, tvätta cellerna två gånger med 0,9% saltlösning för att avlägsna eventuella icke-internaliserade promastigotes. Inkubera cellerna i kompletterat RPMI Medium vid 37 grader Celsius i en timme och fixa sedan cellerna med 4% PFA i 15 minuter.Montera sedan täckglas med önskat monteringsmedium. Räkna sedan minst 400 celler i slumpmässiga fält under ett fluorescensmikroskop. För att undersöka den Leishmania-inducerade PV-biogenesen, börja transfektera THP-1-celler med plasmid genom att sådda 15 miljoner THP-1-celler i 75 kvadratcentimeter vävnadsodlingskolvar som innehåller 10 ml komplett RPMI-medium kompletterat med 100 nanogram per milliliter PMA och 50 mikromolar till merkaptoetanol i 48 timmar.Tvätta sedan cellerna en gång i 0,9% saltlösning och lossa cellerna med en icke-enzymatisk celldissociationslösning. Centrifugera sedan vid 250 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur. Därefter återsuspenderar du THP-1-cellerna i en milliliter RPMI Medium och utför räkningar i en Neubauer-kammare.Centrifugera cellerna igen vid 250 gånger g i 10 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten. Återsuspendera 2 miljoner celler i 100 mikroliter Nucleofector-lösning och inkubera med 0,5 mikrogram av plasmidbeläggningen för proteinet av intresse, märkt med ett fluorescerande protein. Överför suspensionen innehållande THP-1-celler och nukleinsyra till Nucleofector-kyvetten.Transfektera sedan cellerna med hjälp av Nucleofector-program Y one. Återvinn de transfekterade cellerna och frö i 500 mikroliter RPMI Medium på 24 brunnsplattor med 13 millimeter glaskåpor. Inkubera cellerna och Komplett RPMI-medium vid 37 grader Celsius i 0,5, 2, 4, 6, 12 och 24 timmar.Lämna 13 millimeter glasskydd vid rumstemperatur och skydda dem från ljuset minst 30 minuter före förvärvet. Rengör täckglasen med absorberande vävnad. Lägg sedan till en droppe nedsänkningsolja i målet och lägg sedan till bilden.Flytta målet uppåt tills oljan vidrör bilden. Observera och justera fokus på mikroskopet och välj alternativ 63x mål med olja. Öppna LIQA-programmet och justera lasrarna i våglängderna 488, 552 och 405.Välj bildupplösningen som 1024 x 1024. När du har klickat på live-knappen ställer du in Z-stacken och trycker på startalternativet. Vänta på bildförvärvet och välj sedan alternativet, maximal projektion, i verktygen.Spara experimentet och exportera bilder i TIFF-format till en dator. Resultaten visade att både Leishmania Braziliensis LCL, och Leishmania Braziliensis DL, på samma sätt binder till makrofager. Inga skillnader observerades också angående Leishmania Braziliensis LCL och Leishmania Braziliensis DL fagocytos av värdceller.Rekryteringen av LC3 till parasitoforvakuolen, eller PV: erna, inducerad av Leishmania Braziliensis LCL eller Leishmania Braziliensis DL, jämfördes i infekterade celler. Efter fyra timmars infektion observerades liknande procentandelar av LC3-dekorerade PV: er i Leishmania Braziliensis LCL och Leishmania Braziliensis DL-infekterade makrofager. Således visade resultaten att Leishmania Braziliensis LCL och Leishmania Braziliensis DL på liknande sätt interagerar med makrofager under bindning, fagocytos och biogenes av PV: er angående LC3-rekryteringen.Representativa mikroskopiska bilder visade effektiv transfektion av THP-1-celler med PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP-plasmider. Människor som försöker detta protokoll måste vara uppmärksamma på temperaturinkubation och skydda mikroskopproverna från ljuset, alla typer. Modulering av uttrycket av de identifierade proteinerna som utfäller Leishmania-fagocytos kommer att visa vikten av dessa proteiner i Leishmania-infektionsresultatet.Vi kan utvidga denna teknik mot olika typer av patologistudier och mekanismer associerade med parasitetablering och målidentifiering för utveckling av terapeutiska strategier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo avbildning av Transgena Leishmania parasiter i ett Live-värd

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Visualisera cell till cell överföring av hiv med fluorescerande kloner av hiv och Live konfokalmikroskopi

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Direkt observation av fagocytos och NET-bildande genom Neutrofiler i infekterade lungor med hjälp av två-photon Mikroskopi

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi av mjälte: Kvantitativ analys av Parasit Rörlighet och blodflöde

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Live-cell videomikroskopi av svamppatogen Fagocytos

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Undersöka effekterna av probiotika på Pneumococcal Colonization Använda en<em&gt; In Vitro</em&gt; Adherensanalysen

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Bedöma Antifungal aktivitet av isolerat alveolära makrofager av konfokalmikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Mikroskopi avbildning av levern efter<em&gt; Leishmania</em&gt; Infektion: En bedömning av lever Hemodynamik

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

En ny metod för kvalitativ Multi-skala Analys av bakteriell Biofilmer på rådiga svampkolonier Använda Confocal och elektronmikroskopi

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisera makrofag extracellulära fällor med konfokalmikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...