Name: stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window
Uploaded: 2021-05-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud nr. 14-2020-002 fra SNUBH Research Fund og af National Research Foundation of Korea (NRF) tilskud finansieret af Koreas regering (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).

Alle de procedurer, der er beskrevet i dette dokument, blev udført i overensstemmelse med den8. udgave af vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr (2011)26 og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) og Seoul National University Bundang Hospital (SNUBH).
1. Tilberedning af vinduet og andre materialer
<ol><li>Custom design bugspytkirtlen intravital billeddannelse vindue ti...

<ol>
	<li>Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+pancreatic+disease.">Imaging in pancreatic disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).</li><li>Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+imaging+the+normal+and+diseased+pancreas.">Technologies for imaging the normal and diseased pancreas.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li><li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pancreatic+diabetes+(type+3c+diabetes)+underdiagnosed+and+misdiagnosed.">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed.</a> Diabetes Care. 31, 165-169 (2008).</li><li>Baetens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+islet+cell+populations+in+spontaneously+diabetic+mice.">Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice.</a> Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).</li><li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+pancreas:+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology.">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).</li><li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology.">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li><li>Ravier, M. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+pancreatic+islets+for+ex+vivo+imaging+studies+with+trappable+or+recombinant+fluorescent+probes.">Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).</li><li>Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vivo+imaging+method+for+individual+islets+across+the+mouse+pancreas+reveals+a+heterogeneous+insulin+secretion+response+to+glucose.">Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose.</a> Science Reports. 11 (1), 603 (2021).</li><li>Lee, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+resveratrol+treatment+on+graft+revascularization+after+islet+transplantation+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice.">Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Islets. 10 (1), 25-39 (2018).</li><li>Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+islet+transplantation.">In vivo imaging of islet transplantation.</a> Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).</li><li>Mojibian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanted+islets+in+the+anterior+chamber+of+the+eye+are+prone+to+autoimmune+attack+in+a+mouse+model+of+diabetes.">Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147 (5), 983-991 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+revealed+at+single-stem-cell+level+by+in+vivo+live+imaging.">Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging.</a> Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).</li><li>Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas.">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), 1024405 (2015).</li><li>Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+pancreatic+imaging+window+for+stabilized+longitudinal+in+vivo+observation+of+pancreatic+islets+in+murine+model.">A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model.</a> Diabetes &amp; Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury.">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+a+pulmonary+endothelial+surface+layer+in+a+murine+sepsis+model.">Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model.</a> Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).</li><li>Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantitation+of+injected+circulating+tumor+cells+from+great+saphenous+vein+based+on+video-rate+confocal+microscopy.">In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).</li><li>Moon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+longitudinal+imaging+of+hepatic+lipid+droplet+accumulation+in+a+murine+model+for+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease.</a> Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).</li><li>Hwang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cellular-level+real-time+pharmacokinetic+imaging+of+free-form+and+liposomal+indocyanine+green+in+liver.">In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver.</a> Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).</li><li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li><li>Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+tumor-cell+line+(panc-1)+from+a+human+carcinoma+of+the+exocrine+pancreas.">Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas.</a> International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).</li><li>National Institutes of Health. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.+Committee+for+the+Update+of+the+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).</li><li>Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+anesthesia+dramatically+alters+the+oral+glucose+tolerance+and+insulin+secretion+in+C57Bl/6+mice.">Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice.</a> Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).</li><li>Kim, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orthotopic+and+heterotopic+human+pancreatic+cancer+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).</li><li>Cichocki, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK3+inhibition+drives+maturation+of+NK+cells+and+enhances+their+antitumor+activity.">GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity.</a> Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+C-peptide+storage+and+secretion+in+islet+beta-cells+in+vitro+and+in+vivo.">Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li><li>Reissaus, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile,+portable+intravital+microscopy+platform+for+studying+beta-cell+biology+in+vivo.">A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo.</a> Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).</li><li>Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+animal+models+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).</li><li>Bisht, S., Feldmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+modeling+pancreatic+cancer+and+novel+drug+discovery.">Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).</li><li>Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+pancreatic+cancer.">Mouse models of pancreatic cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).</li><li>Feig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreas+cancer+microenvironment.">The pancreas cancer microenvironment.</a> Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).</li><li>Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models+of+pancreatic+cancer:+overview+and+comparison+with+other+types+of+models.">Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models.</a> Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).</li></ol>

Protokollen er beskrevet her består af intravital billeddannelse af bugspytkirtlen ved hjælp af en ny støtte base integreret pancreas intravital imaging vindue modificeret fra en abdominal billeddannelse vindue. Blandt de protokoller, der er beskrevet ovenfor, er det første kritiske skridt implantationen af det intravitale pancreas imaging vindue i musen. Til påføring af limen i vinduet er det vigtigt at anvende limen mellem vinduets margen og dækglasset, men ikke på bugspytkirtelvævet, da det kan afbryde intrav...

Bugspytkirtlen er et abdominalt organ med en exokrine funktion i fordøjelseskanalen og en endokrine funktion af udskille hormoner i blodbanen. Høj opløsning cellulære billeddannelse af bugspytkirtlen kunne afsløre patofysiologi af forskellige sygdomme, der involverer bugspytkirtlen, herunder pancreasitis, kræft i bugspytkirtlen, og diabetes mellitus1. Konventionelle diagnostiske billedbehandlingsværktøjer som computertomografi, magnetisk opløsningsbilleddannelse og ultralyd er bredt tilgængelige i det kliniske felt1,2. Disse billeddannelsesmetoder er dog begrænset til kun at visualisere strukturelle eller anatomiske ændringer, mens ændringer på cellulært eller molekylært niveau ikke kan bestemmes. I betragtning af at molekylære ændringer i diabetes mellitus eller kræft i bugspytkirtlen hos mennesker kan indlede mere end 10 år før diagnosen3,4, har påvisning af bugspytkirtelsygdomme fra deres molekylære overgang i den latente periode potentialet til at give en tidlig diagnose og en rettidig intervention. Således vil billeddannelse, der vil overvinde begrænsningerne i opløsningen og give værdifuld indsigt i funktionen bemærkelsesværdigt få opmærksomhed ved at give tidlig diagnose af kræft i bugspytkirtlen eller avanceret identifikation af ændringen af holmene under udviklingen af diabetes mellitus5.
Især med holme, nuklear billeddannelse, bioluminescens imaging, og optisk sammenhæng tomografi er blevet foreslået som ikke-invasive holm billeddannelse teknikker6. Opløsningen af disse metoder er imidlertid væsentligt lav med typiske værdier, der spænder fra flere tiere til hundreder af mikrometer, hvilket giver en begrænset evne til at opdage ændringer på celleniveau i holmene. På den anden side blev tidligere højopløsningsundersøgelser af holme udført under ex vivo7,8 (f.eks. udskæring eller fordøjelse af bugspytkirtlen), ikke-fysiologisk9 (f.eks ydrering af bugspytkirtlen), og heterotopiske tilstande10,11,12 (f.eks implantation under nyrekapslen, inde i leveren, og i den forreste kammer i øjet), som begrænser deres fortolkning og kliniske konsekvenser. Hvis in vivo, fysiologisk, og orthotopic model af høj opløsning billeddannelse kan etableres, vil det være en kritisk platform for undersøgelse af bugspytkirtel holme.
Intravital billeddannelse, som afslører patofysiologien på et mikroskopisk opløsningsniveau hos et levende dyr, har for nylig fået stor opmærksomhed13. Af in vivo imaging metoder, udvikling af en abdominal imaging vindue14, som implantater et vindue ind i maven af en mus, har gjort det muligt at opdage nye fund (dvs. en præ-micrometastase fase af tidlig levermetastase15 og mekanisme for stamcellevedligeholdelse i tarmepitelet16). Selv om abdominal billeddannelse vinduet giver værdifulde resultater, anvendelserne af dette vindue til bugspytkirtlen og den deraf følgende intravital billeddannelse forskning baseret på sygdomme, der involverer bugspytkirtel, er ikke blevet grundigt undersøgt.
I modsætning til de veldefinerede faste organegenskaber i den menneskelige bugspytkirtel er bugspytkirtlen hos en mus en diffust distribueret blødt vævslignende struktur17. Derfor påvirkes det uophørligt af fysiologiske bevægelser, herunder peristalsis og åndedræt. En tidligere undersøgelse af anvendelsen af en abdominal billeddannelse vindue til bugspytkirtlen viste, at vandrer fandt sted på grund af bevægelse-artefakter induceret af afføring18. Der blev observeret alvorlig sløring i det resulterende gennemsnitlige billede, som hindrede visualiseringen og identifikationen af mikroskalastrukturerne.
Heri beskriver vi brugen af en ny støtte base integreret pancreas intravital imaging vindue kombineret med intravital mikroskopi19,20 til at undersøge langsgående cellulære niveau begivenheder i sygdomme, der involverer bugspytkirtlen. Ud over en detaljeret beskrivelse af metoden i den foregående undersøgelse18, den udvidede anvendelse af pancreas imaging vindue for forskellige sygdomme, der involverer bugspytkirtlen vil blive behandlet i dette papir. I denne protokol blev et specialbygget video-rate laserscanningskonfokalt mikroskopisystem brugt som et intravitalt mikroskopisystem. Fire lasermoduler (bølgelængder ved 405, 488, 561 og 640 nm) blev brugt som en excitationskilde, og fire kanaler af emissionssignaler blev opdaget af fotomultiplier rør (PMT) gennem bandpass filtre (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Laserscanning bestod af et roterende polygonalt spejl (X-akse) og et galvanometerscanningsspejl (Y-akse), der muliggjorde videohastighedsscanningen (30 billeder i sekundet). Detaljerede oplysninger om intravital mikroskopi er beskrevet i de tidligere undersøgelser10,18,19,20,21,22,23.
I vores tidligere holmeundersøgelse18,vi med succes og stabilt afbildede holmene i levende mus ved hjælp af en transgen musemodel (MIP-GFP)24, hvor holmene blev mærket med GFP. Metoden muliggjorde visualisering i høj opløsning af ændringerne i holmene over en periode på 1 uge. Det lettede også billeddannelse af de samme holme i op til 3 uger, hvilket tyder på gennemførligheden af langsigtede undersøgelser af bugspytkirteløsehullerne til funktionel sporing eller overvågning under patogenese af diabetes mellitus18. Desuden har vi udviklet en orthotopic kræft i bugspytkirtlen model, hvor fluorescerende kræft i bugspytkirtlen celler (PANC-1 NucLight Red)25 blev direkte implanteret i bugspytkirtlen af musen. Med anvendelsen af bugspytkirtlen intravital billeddannelse vindue, denne model kunne bruges som en platform for at undersøge den cellulære og molekylære patofysiologi i tumor mikromiljø af kræft i bugspytkirtlen og for den terapeutiske overvågning af nye lægemiddel kandidater.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Fluorescent probe for conjugate with antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic polyethylene tubing</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>427401</td>
			<td>PE10 catheter for connection with needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>C57BL/6N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circular</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111520</td>
			<td>Cover glass for pancreatic imaging window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Dextran 2MDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>FD200S</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS 8.1</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Microscopy</td>
			<td>IVIM tech</td>
			<td>IVM-C</td>
			<td>Intravital Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>S-1107-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 401</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>401</td>
			<td>N-butyl cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle holder</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>H-1126-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro rectractor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>17004-03</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1034</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIP-GFP</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>006864</td>
			<td>B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon 4-0</td>
			<td>AILEE</td>
			<td>NB434</td>
			<td>Non-Absorbable Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican N 100 30G</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>FT9172220S</td>
			<td>For Vascular Catheter, Use only Needle part</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 NucLightRed</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Made in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatic imaging window</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Pancreatic imaging window - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiosuite</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>PS-02</td>
			<td>Homeothermic temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553708</td>
			<td>Antibody for in vivo vessel labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1090-3</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMR Dextran 65-85kDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>T1162</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window holder</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Window holder - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 100</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window

Direkte in vivo cellulær opløsning billeddannelse af bugspytkirtlen i en levende lille dyr model har været teknisk udfordrende. En nylig intravital billeddannelse undersøgelse, med en abdominal billeddannelse vindue, aktiveret visualisering af den cellulære dynamik i abdominal organer in vivo. Men på grund af den bløde ark-lignende arkitektur i musen bugspytkirtel, der let kan påvirkes af fysiologisk bevægelse (f.eks peristalsis og respiration), var det vanskeligt at udføre stabiliseret langsgående in vivo imaging over flere uger på cellulært niveau for at identificere, spore og kvantificere holme eller kræftceller i musen bugspytkirtel. Heri beskriver vi en metode til implantering af en ny understøttende base, en integreret pancreas intravital billeddannelse vindue, der kan rumligt adskille bugspytkirtlen fra tarmen for langsgående time-lapse intravital billeddannelse af bugspytkirtlen mikrostruktur. Langsgående in vivo billeddannelse med billeddannelse vinduet muliggør stabil visualisering, der giver mulighed for sporing af holme over en periode på 3 uger og høj opløsning tre-dimensionelle billeddannelse af mikrostrukturen, som det fremgår her i en orthotopic kræft i bugspytkirtlen model. Med vores metode kan yderligere intravitale billeddiagnostiske undersøgelser belyse patofysiologien af forskellige sygdomme, der involverer bugspytkirtlen på celleniveau.

Intravital mikroskopi kombineret med den understøttende base integreret pancreas intravital imaging vindue muliggør langsgående cellulære niveau billeddannelse af bugspytkirtlen i en mus. Denne protokol med pancreas intravital imaging vindue giver langsigtet væv stabilitet, der gør det muligt at erhverve høj opløsning billeddannelse til at spore de enkelte holme i op til 3 uger. Som et resultat kan mosaikbilleddannelse til et udvidet synsfelt, tredimensionel (3D) rekonstruktion af z-stack imaging og langsgående ...

Watch this Scientific Journal Video about Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window at JoVE.com

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

In vivo høj opløsning billeddannelse af bugspytkirtlen blev lettet med bugspytkirtlen intravital billeddannelse vindue.

Stabiliseret langsgående In Vivo Cellular-Niveau Visualisering af bugspytkirtlen i en Murine Model med en Pancreas Intravital Imaging Window

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Denne protokol beskriver stabiliseret og gentagne cellulære niveau in vivo billeddannelse af bugspytkirtlen med en ny pancreas intravital billeddannelse vindue. Den største fordel ved denne teknik er, at det er muligt at udføre ubevægelig, tredimensionel billeddannelse med opløsning op til det cellulære niveau over tre uger i bugspytkirtlen af en levende mus. Begynd med at forberede den kirurgiske platform og desinficere overfladerne med 70% ethanol.Efter bedøvelse skal du bruge en rektalsonde med en homeothermic-kontrolleret varmepude til at overvåge kropstemperaturen. Fjern hår fra venstre flanke af musen og anvende alkohol og jod alternativt, roterende fra indsnit site til den ydre overflade, aldrig går tilbage til indsnit site, og slutter med jod. Lav derefter et 1,5 centimeter snit på musens venstre flanke, dissekere huden og musklen.Brug en sort eller nylon 4-0 sutur til at udføre en pung streng sutur i snit margin. Træk milten forsigtigt med ring pincet og identificere bugspytkirtlen. Placering af vinduet på musens flanke, passere milten og bugspytkirtlen gennem det åbne rum i vinduet.Placer derefter forsigtigt bugspytkirtlen på pladen i billedvinduet, mens milten placeres på vinduets åbne rum. Injicere PANC-1 nuklite rød direkte ind i bugspytkirtlen. Brug en 31-gauge kateter nål til at anvende dråber af n-Butyl cyanoacrylat lim til kanten af billeddannelse vinduet, sikre en minimal mængde lim anvendes.Påfør forsigtigt et 12 millimeter rundt dækglas på margenen af billedvinduet. Hold derefter sutursløjfen for at passe ind i vinduets siderille og binde den tre gange. Endelig, for at forhindre afbrydelsen af disse stramme sting, når musene er vågne, skæres det maksimale proksimale sted for slipset.Begynd med at tænde det intravitale mikroskop, herunder lasereffekten. For at indsætte et vaskulært kateter skal du lægge pres på den proksimale side af halen med indekset og tredje finger. Om nødvendigt opvarmes halen med en lampe.Desinficere halen vene med en 70% ethanol spray, derefter indsætte en 30-gauge kateter i lateral hale vene og visualisere regurgitation af blod i PE-10 røret. Påfør silkebånd på kateteret for at stabilisere det. Injicere FITC dextran og TMR dextran, eller andre fluorescerende sonder efter behov, i henhold til kombinationen af fluorescerende sonder.Indsæt en rektal sonde for automatisk at styre kropstemperaturen med et homeothermic varmepudesystem. Sæt derefter vinduet til pancreas billedbehandling, der er forberedt under opsætningen af intravital mikroskopi, ind i vinduesholderen. Overfør musen fra den kirurgiske platform til billedbehandlingsstadiet.Hvis du vil udføre intravital billeddannelse, skal du starte med billedbehandling bugspytkirtlen ved en lav forstørrelse, såsom fire gange, for at scanne hele visningen af bugspytkirtlen i bugspytkirtlen billeddannelse vindue. Når interesseregionen er fastlagt, skal du skifte til en højere forstørrelsesmållinse, som 20 gange eller 40 gange, for at udføre cellulær billeddannelse med henholdsvis lateral og aksial opløsning ca. 0,5 mikrometer og 3 mikrometer. Udfør Z-stack- eller time-lapse-billedbehandling for at observere 3D-strukturen eller dynamikken på cellulært niveau, f.eks.Intravital mikroskopi kombineret med pancreas intravital billeddannelse vindue giver langsigtet væv stabilitet, der gør det muligt at erhverve høj opløsning billeddannelse til at spore de enkelte holme i op til tre uger. Vinduet implanteret i en C57 sort 6 N mus med intravenøst injiceres anti-CD31 antistof, konjugeret med en Alexa 647 fluorophore, lettet wide-area billeddannelse og forstørret 3D-billeddannelse af bugspytkirtlen. Acinar celler blev identificeret i den gennemsnitlige billeder af bugspytkirtelvæv i den tilstødende vaskulatur, visualiseret ved hjælp af autofluorescens og anti-CD31 antistof hhv.Ved hjælp af mosaikbilleddannelsesmetoden, der kombinerer et bredt feltbillede med billeddannelse med høj opløsning, blev ca. 40 til 50 holme med den tilstødende vaskulatur visualiseret i en MIP-GFP-mus. En tidligere undersøgelse viste, at holme kan spores i op til tre uger ved hjælp af denne stabile billeddannelsesmetode. For at visualisere kræftceller, PANC-1 nuklite røde celler blev direkte implanteret i musen bugspytkirtel under operationen og nærliggende fartøjer blev plettet med anti-CD31 konjugeret med Alexa 647.Ved hjælp af denne protokol, wide-field billeder af kræft i bugspytkirtlen blev genereret. Dette hjalp med at afgrænse tumorens margin samt opnå 3D-billeder i høj opløsning på enkeltcelleniveau. Det mest kritiske skridt i denne metode er den dygtige implantation af pancreas imaging vindue i musen.Ved hjælp af andre kombinationer af fluorescerende museceller og antistofsonder kan dynamisk interaktion mellem nærliggende celler med enten holme eller annullere celler identificeres. Denne metode kan anvendes bredt af dem, der udforsker ændringen af holmen i forskellige patofysiologiske tilstande og mikromiljøer af kræft i bugspytkirtlen på stedet.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Imaging gliom Indledning<em&gt; In Vivo</em&gt; Gennem en poleret og Reinforced Thin-kranium Cranial Window

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

En musemodel af Stent Implantation i halspulsåren for Studiet af Restenosis

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation ind i det forreste kammer i øjet til langsgående, ikke-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging med Single-celle Opløsning i realtid

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis ved Konfokal Optical Imaging<em&gt; In vivo</em&gt;: En model af Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging af Cerebrovasculature: Relevans til CNS-sygdomme

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kvantitativ visualisering af leukocytinfiltrat i en murin model af Fulminant Myocarditis ved lysarkmikroskopi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualisering af endogene Mitophagy komplekser in situ i humane bugspytkirtel beta celler udnytte nærhed ligation assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Robotic Lateral Pancreaticojejunostomy for Chronic Pancreatitis

Robot lateral Pancreaticojejunostomy for kronisk pancreatitis

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Precision-Cut Lever skiver som en Ex Vivo Model af leverbiologi

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

A Doxorubicin-Induced Murine Model of Dilated Cardiomyopathy In Vivo

En Doxorubicin-induceret Murine Model af udvidet kardiomyopati i Vivo

Dilated cardiomyopathy (DCM) refers to a spectrum of heterogeneous myocardial disorders characterized by ventricular dilation and depressed cardiac ...