Name: stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window
Uploaded: 2021-05-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par la subvention n ° 14-2020-002 du Fonds de recherche SNUBH et par la subvention de la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).

Toutes les procédures décrites dans le présent document ont été menées conformément à la 8e édition du Guide pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire (2011)26 et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut avancé coréen des sciences et de la technologie (KAIST) et de l’Hôpital Bundang de l’Université nationale de Séoul (SNUBH).
1. Préparation de la fenêtre et d’autre...

<ol>
	<li>Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+pancreatic+disease.">Imaging in pancreatic disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).</li><li>Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+imaging+the+normal+and+diseased+pancreas.">Technologies for imaging the normal and diseased pancreas.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li><li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pancreatic+diabetes+(type+3c+diabetes)+underdiagnosed+and+misdiagnosed.">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed.</a> Diabetes Care. 31, 165-169 (2008).</li><li>Baetens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+islet+cell+populations+in+spontaneously+diabetic+mice.">Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice.</a> Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).</li><li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+pancreas:+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology.">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).</li><li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology.">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li><li>Ravier, M. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+pancreatic+islets+for+ex+vivo+imaging+studies+with+trappable+or+recombinant+fluorescent+probes.">Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).</li><li>Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vivo+imaging+method+for+individual+islets+across+the+mouse+pancreas+reveals+a+heterogeneous+insulin+secretion+response+to+glucose.">Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose.</a> Science Reports. 11 (1), 603 (2021).</li><li>Lee, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+resveratrol+treatment+on+graft+revascularization+after+islet+transplantation+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice.">Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Islets. 10 (1), 25-39 (2018).</li><li>Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+islet+transplantation.">In vivo imaging of islet transplantation.</a> Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).</li><li>Mojibian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanted+islets+in+the+anterior+chamber+of+the+eye+are+prone+to+autoimmune+attack+in+a+mouse+model+of+diabetes.">Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147 (5), 983-991 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+revealed+at+single-stem-cell+level+by+in+vivo+live+imaging.">Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging.</a> Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).</li><li>Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas.">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), 1024405 (2015).</li><li>Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+pancreatic+imaging+window+for+stabilized+longitudinal+in+vivo+observation+of+pancreatic+islets+in+murine+model.">A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model.</a> Diabetes &amp; Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury.">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+a+pulmonary+endothelial+surface+layer+in+a+murine+sepsis+model.">Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model.</a> Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).</li><li>Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantitation+of+injected+circulating+tumor+cells+from+great+saphenous+vein+based+on+video-rate+confocal+microscopy.">In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).</li><li>Moon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+longitudinal+imaging+of+hepatic+lipid+droplet+accumulation+in+a+murine+model+for+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease.</a> Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).</li><li>Hwang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cellular-level+real-time+pharmacokinetic+imaging+of+free-form+and+liposomal+indocyanine+green+in+liver.">In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver.</a> Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).</li><li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li><li>Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+tumor-cell+line+(panc-1)+from+a+human+carcinoma+of+the+exocrine+pancreas.">Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas.</a> International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).</li><li>National Institutes of Health. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.+Committee+for+the+Update+of+the+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).</li><li>Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+anesthesia+dramatically+alters+the+oral+glucose+tolerance+and+insulin+secretion+in+C57Bl/6+mice.">Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice.</a> Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).</li><li>Kim, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orthotopic+and+heterotopic+human+pancreatic+cancer+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).</li><li>Cichocki, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK3+inhibition+drives+maturation+of+NK+cells+and+enhances+their+antitumor+activity.">GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity.</a> Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+C-peptide+storage+and+secretion+in+islet+beta-cells+in+vitro+and+in+vivo.">Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li><li>Reissaus, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile,+portable+intravital+microscopy+platform+for+studying+beta-cell+biology+in+vivo.">A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo.</a> Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).</li><li>Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+animal+models+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).</li><li>Bisht, S., Feldmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+modeling+pancreatic+cancer+and+novel+drug+discovery.">Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).</li><li>Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+pancreatic+cancer.">Mouse models of pancreatic cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).</li><li>Feig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreas+cancer+microenvironment.">The pancreas cancer microenvironment.</a> Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).</li><li>Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models+of+pancreatic+cancer:+overview+and+comparison+with+other+types+of+models.">Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models.</a> Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).</li></ol>

Le protocole décrit ici consiste en une imagerie intravitale du pancréas à l’aide d’une nouvelle fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique intégrée à la base de support modifiée à partir d’une fenêtre d’imagerie abdominale. Parmi les protocoles décrits ci-dessus, la première étape critique est l’implantation de la fenêtre d’imagerie pancréatique intravitale chez la souris. Pour l’application de la colle dans la fenêtre, il est important d’appliquer la colle entre la marge de la fenêt...

Le pancréas est un organe abdominal avec une fonction exocrine dans le tube digestif et une fonction endocrinienne de sécrétion d’hormones dans la circulation sanguine. L’imagerie cellulaire à haute résolution du pancréas pourrait révéler la physiopathologie de diverses maladies impliquant le pancréas, y compris la pancréatite, le cancer du pancréas et le diabète sucré1. Les outils d’imagerie diagnostique conventionnels tels que la tomodensitométrie, l’imagerie à résolution magnétique et l’échographie sont largement disponibles dans le domaine clinique1,2. Cependant, ces modalités d’imagerie se limitent à visualiser uniquement les changements structurels ou anatomiques, tandis que les altérations au niveau cellulaire ou moléculaire ne peuvent pas être déterminées. Étant donné que les changements moléculaires dans le diabète sucré ou le cancer du pancréas chez l’homme peuvent commencer plus de 10 ans avant le diagnostic3,4, la détection des maladies du pancréas à partir de leur transition moléculaire pendant la période de latence a le potentiel de fournir un diagnostic précoce et une intervention rapide. Ainsi, l’imagerie qui surmontera les limites de la résolution et fournira des informations précieuses sur la fonction attirera remarquablement l’attention en fournissant un diagnostic précoce du cancer du pancréas ou une identification avancée de l’altération des îlots au cours de la progression du diabète sucré5.
En particulier avec les îlots, l’imagerie nucléaire, l’imagerie par bioluminescence et la tomographie par cohérence optique ont été suggérées comme techniques d’imagerie non invasive des îlots6. Cependant, la résolution de ces méthodes est considérablement faible, avec des valeurs typiques allant de plusieurs dizaines à des centaines de micromètres, offrant une capacité limitée à détecter les changements au niveau cellulaire dans les îlots. D’autre part, des études antérieures à haute résolution sur les îlots ont été réalisées dans des conditions ex vivo7,8 (par exemple, tranchage ou digestion du pancréas), non physiologiques9 (par exemple, extériorisation du pancréas) et hétérotopiques10,11,12 (par exemple, implantation sous la capsule rénale, à l’intérieur du foie et dans la chambre antérieure de l’œil), ce qui limite leur interprétation et leurs implications cliniques. Si un modèle in vivo,physiologique et orthotopique d’imagerie à haute résolution peut être établi, ce sera une plate-forme critique pour l’étude des îlots pancréatiques.
L’imagerie intravitale, qui révèle la physiopathologie à un niveau de résolution microscopique chez un animal vivant, a récemment fait l’objet d’une grande attention13. Parmi les méthodes d’imagerie in vivo, le développement d’une fenêtre d’imagerie abdominale14,qui implante une fenêtre dans l’abdomen d’une souris, a permis de découvrir de nouvelles découvertes (c’est-à-dire un stade pré-micrométastase de la métastase hépatique précoce15 et un mécanisme de maintien des cellules souches dans l’épithélium intestinal16). Bien que la fenêtre d’imagerie abdominale fournisse des résultats précieux, les applications de cette fenêtre pour le pancréas et la recherche d’imagerie intravitale qui en résulte basée sur les maladies impliquant le pancréas n’ont pas été étudiées de manière approfondie.
Contrairement aux caractéristiques bien définies des organes solides du pancréas humain, le pancréas d’une souris est une structure semblable à des tissus mous distribués de manière diffuse17. Par conséquent, il est sans cesse affecté par les mouvements physiologiques, y compris le péristaltisme et la respiration. Une étude antérieure sur l’application d’une fenêtre d’imagerie abdominale pour le pancréas a démontré que l’errance se produisait en raison d’artefacts de mouvement induits par les selles18. Un flou sévère a été observé dans l’image moyenne résultante, ce qui a entravé la visualisation et l’identification des structures à l’échelle microscopique.
Ici, nous décrivons l’utilisation d’une nouvelle fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique intégrée à la base de soutien combinée à la microscopie intravitale19,20 pour étudier les événements au niveau cellulaire longitudinal dans les maladies impliquant le pancréas. En plus d’une description détaillée de la méthodologie de l’étude précédente18, l’application étendue de la fenêtre d’imagerie pancréatique pour diverses maladies impliquant le pancréas sera abordée dans cet article. Dans ce protocole, un système de microscopie confocale à balayage laser à débit vidéo sur mesure a été utilisé comme système de microscopie intravitale. Quatre modules laser (longueurs d’onde à 405, 488, 561 et 640 nm) ont été utilisés comme source d’excitation, et quatre canaux de signaux d’émission ont été détectés par des tubes photomultiplicateurs (PMT) à travers des filtres passe-bande (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Le balayage laser se composait d’un miroir polygonal rotatif (axe X) et d’un miroir à balayage galvanométrique (axe Y) qui permettait le balayage à débit vidéo (30 images par seconde). Des informations détaillées sur la microscopie intravitale ont été décrites dans les études précédentes10,18,19,20,21,22,23.
Dans notre étude précédente sur les îlots18,nous avons imagé avec succès et de manière stable les îlots chez des souris vivantes à l’aide d’un modèle murin transgénique (MIP-GFP)24 dans lequel les îlots ont été marqués avec GFP. La méthode a permis une visualisation haute résolution des changements dans les îlots sur une période de 1 semaine. Il a également facilité l’imagerie des mêmes îlots jusqu’à 3 semaines, ce qui suggère la faisabilité d’études à long terme des îlots pancréatiques pour le suivi fonctionnel ou la surveillance pendant la pathogenèse du diabète sucré18. De plus, nous avons développé un modèle de cancer du pancréas orthotopique dans lequel des cellules fluorescentes cancéreuses du pancréas (PANC-1 NucLight Red)25 ont été directement implantées dans le pancréas de la souris. Avec l’application de la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique, ce modèle pourrait être utilisé comme plate-forme pour étudier la physiopathologie cellulaire et moléculaire dans le microenvironnement tumoral du cancer du pancréas et pour la surveillance thérapeutique de nouveaux candidats médicaments.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Fluorescent probe for conjugate with antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic polyethylene tubing</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>427401</td>
			<td>PE10 catheter for connection with needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>C57BL/6N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circular</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111520</td>
			<td>Cover glass for pancreatic imaging window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Dextran 2MDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>FD200S</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS 8.1</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Microscopy</td>
			<td>IVIM tech</td>
			<td>IVM-C</td>
			<td>Intravital Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>S-1107-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 401</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>401</td>
			<td>N-butyl cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle holder</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>H-1126-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro rectractor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>17004-03</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1034</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIP-GFP</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>006864</td>
			<td>B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon 4-0</td>
			<td>AILEE</td>
			<td>NB434</td>
			<td>Non-Absorbable Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican N 100 30G</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>FT9172220S</td>
			<td>For Vascular Catheter, Use only Needle part</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 NucLightRed</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Made in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatic imaging window</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Pancreatic imaging window - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiosuite</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>PS-02</td>
			<td>Homeothermic temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553708</td>
			<td>Antibody for in vivo vessel labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1090-3</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMR Dextran 65-85kDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>T1162</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window holder</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Window holder - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 100</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window

L’imagerie directe in vivo à résolution cellulaire du pancréas dans un modèle vivant de petit animal a été techniquement difficile. Une étude récente d’imagerie intravitale, avec une fenêtre d’imagerie abdominale, a permis de visualiser la dynamique cellulaire dans les organes abdominaux in vivo. Cependant, en raison de l’architecture molle en forme de feuille du pancréas de la souris qui peut être facilement influencée par le mouvement physiologique (par exemple, le péristaltisme et la respiration), il était difficile d’effectuer une imagerie longitudinale in vivo stabilisée sur plusieurs semaines au niveau cellulaire pour identifier, suivre et quantifier les îlots ou les cellules cancéreuses dans le pancréas de la souris. Nous décrivons ici une méthode d’implantation d’une nouvelle base de support, une fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique intégrée, qui peut séparer spatialement le pancréas de l’intestin pour l’imagerie intravitale longitudinale time-lapse de la microstructure du pancréas. L’imagerie longitudinale in vivo avec la fenêtre d’imagerie permet une visualisation stable, permettant le suivi des îlots sur une période de 3 semaines et l’imagerie tridimensionnelle à haute résolution de la microstructure, comme en témoigne ici un modèle orthotopique de cancer du pancréas. Avec notre méthode, d’autres études d’imagerie intravitale peuvent élucider la physiopathologie de diverses maladies impliquant le pancréas au niveau cellulaire.

La microscopie intravitale combinée à la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique intégrée à la base de support permet une imagerie longitudinale au niveau cellulaire du pancréas chez une souris. Ce protocole avec la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique assure une stabilité tissulaire à long terme qui permet l’acquisition d’une imagerie à haute résolution pour suivre les îlots individuels jusqu’à 3 semaines. En conséquence, l’imagerie en mosaïque pour un champ de vision étendu, la...

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Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

L’imagerie in vivo à haute résolution du pancréas a été facilitée par la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique.

Visualisation longitudinale stabilisée au niveau cellulaire in vivo du pancréas dans un modèle murin avec une fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Ce protocole décrit l’imagerie in vivo stabilisée et répétitive au niveau cellulaire du pancréas avec une nouvelle fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique. Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible d’effectuer une imagerie tridimensionnelle immobile avec une résolution allant jusqu’au niveau cellulaire pendant trois semaines dans le pancréas d’une souris vivante. Commencez par préparer la plate-forme chirurgicale et désinfectez les surfaces avec de l’éthanol à 70%.Après l’anesthésie, utilisez une sonde rectale avec un coussin chauffant à commande homéotherme pour surveiller la température corporelle. Enlevez les poils du flanc gauche de la souris et appliquez de l’alcool et de l’iode alternativement, en tournant du site d’incision vers la surface externe, en ne revenant jamais au site d’incision et en terminant par de l’iode. Ensuite, faites une incision de 1,5 centimètre sur le flanc gauche de la souris, en disséquant la peau et le muscle.Utilisez une suture noire ou en nylon 4-0 pour effectuer une suture de cordon de bourse dans la marge d’incision. Tirez soigneusement la rate avec une pince annulaire et identifiez le pancréas. En plaçant la fenêtre sur le flanc de la souris, passez la rate et le pancréas à travers l’espace ouvert de la fenêtre.Ensuite, placez doucement le pancréas sur la plaque de la fenêtre d’imagerie tout en plaçant la rate sur l’espace ouvert de la fenêtre. Injecter PANC-1 nuclite rouge directement dans le pancréas. Utilisez une aiguille de cathéter de calibre 31 pour appliquer des gouttes de colle cyanoacrylate de n-butyle sur la marge de la fenêtre d’imagerie, en veillant à ce qu’une quantité minimale de colle soit appliquée.Appliquez doucement un verre de couverture rond de 12 millimètres sur la marge de la fenêtre d’imagerie. Ensuite, maintenez la boucle de suture pour l’insérer dans la rainure latérale de la fenêtre et attachez-la trois fois. Enfin, pour éviter l’interruption de ces points serrés lorsque les souris sont éveillées, coupez le site proximal maximal de la cravate.Commencez par allumer le microscope intravital, y compris la puissance laser. Pour insérer un cathéter vasculaire, appliquez une pression sur le côté proximal de la queue avec l’index et le troisième doigt. Si nécessaire, chauffez la queue avec une lampe.Désinfectez la veine caudale avec un spray à 70% d’éthanol, puis insérez un cathéter de calibre 30 dans la veine latérale de la queue et visualisez la régurgitation du sang dans le tube PE-10. Appliquez du ruban de soie sur le cathéter pour le stabiliser. Injecter fitc dextran et TMR dextran, ou d’autres sondes fluorescentes selon le cas, selon la combinaison de sondes fluorescentes.Insérez une sonde rectale pour contrôler automatiquement la température corporelle avec un système de coussin chauffant homéotherme. Ensuite, insérez la fenêtre d’imagerie pancréatique préparée lors de la configuration de la microscopie intravitale dans le porte-fenêtre. Transférez la souris de la plate-forme chirurgicale à l’étape d’imagerie.Pour effectuer une imagerie intravitale, commencez par imager le pancréas à un faible grossissement, par exemple quatre fois, pour scanner toute la vue du pancréas dans la fenêtre d’imagerie pancréatique. Une fois la région d’intérêt déterminée, passez à une lentille d’objectif à grossissement plus élevé, comme 20 fois ou 40 fois, pour effectuer une imagerie au niveau cellulaire avec une résolution latérale et axiale d’environ 0,5 micromètre et 3 micromètres respectivement. Effectuez une imagerie Z-stack ou time-lapse pour observer la structure 3D ou la dynamique au niveau cellulaire telle que la migration cellulaire.La microscopie intravitale combinée à la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique offre une stabilité tissulaire à long terme qui permet l’acquisition d’une imagerie à haute résolution pour suivre les îlots individuels jusqu’à trois semaines. La fenêtre implantée dans une souris C57 noire 6 N avec un anticorps anti-CD31 injecté par voie intraveineuse, conjugué avec un fluorophore Alexa 647, a facilité l’imagerie à grande échelle et l’imagerie 3D agrandie du pancréas. Des cellules acineuses ont été identifiées dans les images moyennes du tissu pancréatique dans le système vasculaire adjacent, visualisées à l’aide d’autofluorescence et d’anticorps anti-CD31 respectivement.En utilisant la méthode d’imagerie en mosaïque, qui combine une vue à grand champ avec une imagerie haute résolution, environ 40 à 50 îlots avec la vascularisation adjacente ont été visualisés dans une souris MIP-GFP. Une étude précédente a montré que les îlots peuvent être suivis jusqu’à trois semaines en utilisant cette méthode d’imagerie stable. Pour visualiser les cellules cancéreuses, les globules rouges nuclite PANC-1 ont été directement implantés dans le pancréas de la souris pendant la chirurgie et les vaisseaux voisins ont été colorés avec un anti-CD31 conjugué avec Alexa 647.À l’aide de ce protocole, des images à grand champ du cancer du pancréas ont été générées. Cela a permis de délimiter la marge de la tumeur, ainsi que d’obtenir des images 3D haute résolution au niveau de la cellule unique. L’étape la plus critique de cette méthode est l’implantation habile de la fenêtre d’imagerie pancréatique chez la souris.En utilisant d’autres combinaisons de cellules fluorescentes de souris et de sondes d’anticorps, l’interaction dynamique des cellules voisines avec les îlots ou les cellules annulaires a pu être identifiée. Cette méthode peut être largement appliquée par ceux qui explorent le changement de l’îlot dans diverses conditions physiopathologiques et micro-environnements du cancer du pancréas in situ.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Imagerie gliome Initiation<em&gt; In Vivo</em&gt; Grâce à une poli et renforcé mince crâne fenêtre crânienne

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

Recherche

Médecine

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Un modèle murin d&#39;implantation d&#39;une endoprothèse dans l&#39;artère carotide pour l&#39;étude de la resténose

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation dans la chambre antérieure de l&#39;oeil pour longitudinale, non-invasive<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie avec une seule cellule de résolution en temps réel

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Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

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Rose Bengale Photothrombosis par imagerie optique confocal<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modèle de l&#39;unité des maladies du navire

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Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie du Cerebrovasculature: Pertinence pour les maladies du système nerveux central

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