Name: stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window
Uploaded: 2021-05-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window at JoVE.com

Diese Studie wurde durch den Zuschuss Nr. 14-2020-002 des SNUBH Research Fund und durch den von der koreanischen Regierung (MSIT) finanzierten Zuschuss der National Research Foundation of Korea (NRF) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694) unterstützt.

Alle in diesem Artikel beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der8. Ausgabe des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (2011)26 durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee am Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) und dem Seoul National University Bundang Hospital (SNUBH) genehmigt.
1. Vorbereitung des Fensters und anderer Materialien
<ol><li>Entwerfen Sie das intravitale Bildge...

<ol>
	<li>Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+pancreatic+disease.">Imaging in pancreatic disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).</li><li>Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+imaging+the+normal+and+diseased+pancreas.">Technologies for imaging the normal and diseased pancreas.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li><li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pancreatic+diabetes+(type+3c+diabetes)+underdiagnosed+and+misdiagnosed.">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed.</a> Diabetes Care. 31, 165-169 (2008).</li><li>Baetens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+islet+cell+populations+in+spontaneously+diabetic+mice.">Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice.</a> Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).</li><li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+pancreas:+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology.">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).</li><li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology.">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li><li>Ravier, M. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+pancreatic+islets+for+ex+vivo+imaging+studies+with+trappable+or+recombinant+fluorescent+probes.">Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).</li><li>Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vivo+imaging+method+for+individual+islets+across+the+mouse+pancreas+reveals+a+heterogeneous+insulin+secretion+response+to+glucose.">Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose.</a> Science Reports. 11 (1), 603 (2021).</li><li>Lee, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+resveratrol+treatment+on+graft+revascularization+after+islet+transplantation+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice.">Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Islets. 10 (1), 25-39 (2018).</li><li>Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+islet+transplantation.">In vivo imaging of islet transplantation.</a> Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).</li><li>Mojibian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanted+islets+in+the+anterior+chamber+of+the+eye+are+prone+to+autoimmune+attack+in+a+mouse+model+of+diabetes.">Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147 (5), 983-991 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+revealed+at+single-stem-cell+level+by+in+vivo+live+imaging.">Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging.</a> Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).</li><li>Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas.">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), 1024405 (2015).</li><li>Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+pancreatic+imaging+window+for+stabilized+longitudinal+in+vivo+observation+of+pancreatic+islets+in+murine+model.">A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model.</a> Diabetes &amp; Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury.">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+a+pulmonary+endothelial+surface+layer+in+a+murine+sepsis+model.">Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model.</a> Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).</li><li>Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantitation+of+injected+circulating+tumor+cells+from+great+saphenous+vein+based+on+video-rate+confocal+microscopy.">In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).</li><li>Moon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+longitudinal+imaging+of+hepatic+lipid+droplet+accumulation+in+a+murine+model+for+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease.</a> Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).</li><li>Hwang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cellular-level+real-time+pharmacokinetic+imaging+of+free-form+and+liposomal+indocyanine+green+in+liver.">In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver.</a> Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).</li><li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li><li>Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+tumor-cell+line+(panc-1)+from+a+human+carcinoma+of+the+exocrine+pancreas.">Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas.</a> International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).</li><li>National Institutes of Health. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.+Committee+for+the+Update+of+the+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).</li><li>Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+anesthesia+dramatically+alters+the+oral+glucose+tolerance+and+insulin+secretion+in+C57Bl/6+mice.">Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice.</a> Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).</li><li>Kim, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orthotopic+and+heterotopic+human+pancreatic+cancer+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).</li><li>Cichocki, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK3+inhibition+drives+maturation+of+NK+cells+and+enhances+their+antitumor+activity.">GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity.</a> Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+C-peptide+storage+and+secretion+in+islet+beta-cells+in+vitro+and+in+vivo.">Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li><li>Reissaus, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile,+portable+intravital+microscopy+platform+for+studying+beta-cell+biology+in+vivo.">A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo.</a> Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).</li><li>Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+animal+models+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).</li><li>Bisht, S., Feldmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+modeling+pancreatic+cancer+and+novel+drug+discovery.">Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).</li><li>Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+pancreatic+cancer.">Mouse models of pancreatic cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).</li><li>Feig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreas+cancer+microenvironment.">The pancreas cancer microenvironment.</a> Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).</li><li>Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models+of+pancreatic+cancer:+overview+and+comparison+with+other+types+of+models.">Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models.</a> Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).</li></ol>

Das hier beschriebene Protokoll besteht aus der intravitalen Bildgebung der Bauchspeicheldrüse unter Verwendung eines neuartigen unterstützenden integrierten pankreatischen intravitalen Bildgebungsfensters, das von einem abdominalen Bildgebungsfenster modifiziert wurde. Unter den oben beschriebenen Protokollen ist der erste kritische Schritt die Implantation des intravitalen Pankreas-Bildgebungsfensters in die Maus. Für das Auftragen des Klebstoffs im Fenster ist es wichtig, den Kleber zwischen dem Rand des Fensters u...

Die Bauchspeicheldrüse ist ein Bauchorgan mit einer exokrinen Funktion im Verdauungstrakt und einer endokrinen Funktion, Hormone in den Blutkreislauf zu sezernieren. Hochauflösende zelluläre Bildgebung der Bauchspeicheldrüse könnte die Pathophysiologie verschiedener Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse aufdecken, darunter Pankreatitis, Bauchspeicheldrüsenkrebs und Diabetes mellitus1. Herkömmliche diagnostische Bildgebungswerkzeuge wie Computertomographie, Bildgebung mit magnetischer Auflösung und Ultraschall sind im klinischen Bereich weit verbreitet1,2. Diese Bildgebungsmodalitäten beschränken sich jedoch darauf, nur strukturelle oder anatomische Veränderungen zu visualisieren, während Veränderungen auf zellulärer oder molekularer Ebene nicht bestimmt werden können. Da molekulare Veränderungen bei Diabetes mellitus oder Bauchspeicheldrüsenkrebs beim Menschen mehr als 10 Jahre vor der Diagnose3,4beginnenkönnen,hat die Erkennung von Pankreaserkrankungen aus ihrem molekularen Übergang während der Latenzzeit das Potenzial, eine frühzeitige Diagnose und eine rechtzeitige Intervention zu ermöglichen. So wird eine Bildgebung, die die Einschränkungen der Auflösung überwindet und wertvolle Einblicke in die Funktion liefert, bemerkenswert aufmerksamkeitserregen, indem sie eine frühzeitige Diagnose von Bauchspeicheldrüsenkrebs oder eine fortgeschrittene Identifizierung der Veränderung der Inseln während des Fortschreitens von Diabetes mellitus5ermöglicht.
Insbesondere bei den Inseln wurden die nukleare Bildgebung, die Biolumineszenzbildgebung und die optische Kohärenztomographie als nicht-invasive Inselbildgebungsverfahren vorgeschlagen6. Die Auflösung dieser Methoden ist jedoch im Wesentlichen niedrig, mit typischen Werten von mehreren zehn bis hunderten Mikrometern, die eine begrenzte Fähigkeit bieten, Veränderungen auf zellulärer Ebene in den Inseln zu erkennen. Auf der anderen Seite wurden frühere hochauflösende Studien von Inseln unter ex vivo7,8 (z. B. Schneiden oder Verdauung der Bauchspeicheldrüse), nicht-physiologischen9 (z. B. Exteriorisierung der Bauchspeicheldrüse) und heterotopenZuständen 10,11,12 (z. B. Implantation unter der Nierenkapsel, in der Leber und in der vorderen Augenkammer) durchgeführt, was ihre Interpretation und klinischen Auswirkungen einschränkt. Wenn in vivoein physiologisches und orthotopisches Modell der hochauflösenden Bildgebung etabliert werden kann, wird es eine kritische Plattform für die Untersuchung von Pankreasinseln sein.
Die intravitale Bildgebung, die die Pathophysiologie bei einer mikroskopischen Auflösung bei einem lebenden Tier aufzeigen, hat kürzlich große Aufmerksamkeit erhalten13. Von den in vivo bildgebenden Verfahren hat die Entwicklung eines abdominalen Bildgebungsfensters14, das ein Fenster in den Bauch einer Maus implantiert, die Entdeckung neuer Erkenntnisse ermöglicht (d.h. ein Prä-Mikrometastasierungsstadium der frühen Lebermetastasierung15 und Mechanismus der Stammzellerhaltung im Darmepithel16). Obwohl das abdominale Bildgebungsfenster wertvolle Ergebnisse liefert, wurden die Anwendungen dieses Fensters für die Bauchspeicheldrüse und die daraus resultierende intravitale Bildgebungsforschung auf der Grundlage von Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse nicht umfassend untersucht.
Im Gegensatz zu den gut definierten festen Organeigenschaften der menschlichen Bauchspeicheldrüse ist die Bauchspeicheldrüse einer Maus eine diffus verteilte weichteilartige Struktur17. Daher wird es unaufhörlich durch physiologische Bewegungen einschließlich Peristaltik und Atmung beeinflusst. Eine frühere Studie über die Anwendung eines abdominalen Bildgebungsfensters für die Bauchspeicheldrüse zeigte, dass das Wandern aufgrund von Bewegungsartefakten auftrat, die durch Stuhlgang induziert wurden18. Im resultierenden gemittelten Bild wurden starke Unschärfen beobachtet, die die Visualisierung und Identifizierung der mikroskaligen Strukturen behinderten.
Hierin beschreiben wir die Verwendung eines neuartigen unterstützenden basenintegrierten pankreasintevitalen intravitalen Bildgebungsfensters in Kombination mit der intravitalenMikroskopie 19,20, um die longitudinalen zellulären Ereignisse bei Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse zu untersuchen. Neben einer detaillierten Beschreibung der Methodik in der vorangegangenen Studie18wird in diesem Beitrag die erweiterte Anwendung des Pankreas-Bildgebungsfensters für verschiedene Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse behandelt. In diesem Protokoll wurde ein speziell angefertigtes videorates Laser-Scanning-konfokale Mikroskopiesystem als intravitale Mikroskopiesystem verwendet. Vier Lasermodule (Wellenlängen bei 405, 488, 561 und 640 nm) wurden als Anregungsquelle verwendet, und vier Kanäle von Emissionssignalen wurden durch Photomultiplierröhren (PMT) durch Bandpassfilter (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Laserscanning bestand aus einem rotierenden polygonalen Spiegel (X-Achse) und einem Galvanometer-Scanning-Spiegel (Y-Achse), der das Scannen der Videorate (30 Bilder pro Sekunde) ermöglichte. Detaillierte Informationen über die intravitalen Mikroskopie wurden in den vorherigen Studien10,18,19,20,21,22,23beschrieben.
In unserer vorherigen Inselstudie18haben wir die Inseln in lebenden Mäusen mit einem transgenen Mausmodell (MIP-GFP)24, in dem die Inseln mit GFP markiert wurden, erfolgreich und stabil abgebildet. Die Methode ermöglichte eine hochauflösende Visualisierung der Veränderungen in den Inseln über einen Zeitraum von 1 Woche. Es erleichterte auch die Bildgebung der gleichen Inseln für bis zu 3 Wochen, was auf die Machbarkeit von Langzeitstudien der Pankreasinseln für die funktionelle Verfolgung oder Überwachung während der Pathogenese von Diabetes mellitus18hindeutet. Des Weiteren entwickelten wir ein orthotopes Bauchspeicheldrüsenkrebsmodell, bei dem fluoreszierende Bauchspeicheldrüsenkrebszellen (PANC-1 NucLight Red)25 direkt in die Bauchspeicheldrüse der Maus implantiert wurden. Mit der Anwendung des pankreatischen intravitalen Bildgebungsfensters könnte dieses Modell als Plattform zur Untersuchung der zellulären und molekularen Pathophysiologie in der Tumormikroumgebung von Bauchspeicheldrüsenkrebs und zur therapeutischen Überwachung neuartiger Wirkstoffkandidaten genutzt werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Fluorescent probe for conjugate with antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic polyethylene tubing</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>427401</td>
			<td>PE10 catheter for connection with needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>C57BL/6N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circular</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111520</td>
			<td>Cover glass for pancreatic imaging window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Dextran 2MDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>FD200S</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS 8.1</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Microscopy</td>
			<td>IVIM tech</td>
			<td>IVM-C</td>
			<td>Intravital Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>S-1107-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 401</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>401</td>
			<td>N-butyl cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle holder</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>H-1126-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro rectractor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>17004-03</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1034</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIP-GFP</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>006864</td>
			<td>B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon 4-0</td>
			<td>AILEE</td>
			<td>NB434</td>
			<td>Non-Absorbable Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican N 100 30G</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>FT9172220S</td>
			<td>For Vascular Catheter, Use only Needle part</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 NucLightRed</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Made in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatic imaging window</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Pancreatic imaging window - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiosuite</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>PS-02</td>
			<td>Homeothermic temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553708</td>
			<td>Antibody for in vivo vessel labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1090-3</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMR Dextran 65-85kDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>T1162</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window holder</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Window holder - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 100</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window

Die direkte in vivo zelluläre Bildgebung der Bauchspeicheldrüse in einem lebenden Kleintiermodell war technisch anspruchsvoll. Eine kürzlich durchgeführte intravitale Bildgebungsstudie mit einem abdominalen Bildgebungsfenster ermöglichte die Visualisierung der zellulären Dynamik in Bauchorganen in vivo. Aufgrund der weichen blattartigen Architektur der Bauchspeicheldrüse der Maus, die leicht durch physiologische Bewegungen (z. B. Peristaltik und Atmung) beeinflusst werden kann, war es jedoch schwierig, eine stabilisierte longitudinale In-vivo-Bildgebung über mehrere Wochen auf zellulärer Ebene durchzuführen, um Inselchen oder Krebszellen in der Bauchspeicheldrüse der Maus zu identifizieren, zu verfolgen und zu quantifizieren. Hierin beschreiben wir eine Methode zur Implantation einer neuartigen Stützbasis, einem integrierten pankreatischen intravitalen Bildgebungsfenster, das die Bauchspeicheldrüse räumlich vom Darm trennen kann, um die intravitalen Bildgebung der Bauchspeicheldrüse in Längsschnitt zu drehen. Die longitudinale In-vivo-Bildgebung mit dem Bildgebungsfenster ermöglicht eine stabile Visualisierung, die die Verfolgung von Inseln über einen Zeitraum von 3 Wochen und eine hochauflösende dreidimensionale Abbildung der Mikrostruktur ermöglicht, wie hier in einem orthotopen Bauchspeicheldrüsenkrebsmodell gezeigt. Mit unserer Methode können weitere intravitalen bildgebenden Untersuchungen die Pathophysiologie verschiedener Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene aufklären.

Die Intravitalenmikroskopie in Kombination mit dem unterstützenden Basen-integrierten pankreasinen intravitalen Bildgebungsfenster ermöglicht die longitudinale zelluläre Bildgebung der Bauchspeicheldrüse in einer Maus. Dieses Protokoll mit dem intravitalen Bildgebungsfenster der Bauchspeicheldrüse bietet eine langfristige Gewebestabilität, die die Erfassung einer hochauflösenden Bildgebung ermöglicht, um einzelne Inseln für bis zu 3 Wochen zu verfolgen. Dadurch können Mosaikbilder für ein erweitertes Sichtfeld...

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Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

In vivo wurde die hochauflösende Bildgebung der Bauchspeicheldrüse mit dem pankreasinen intravitalen Bildgebungsfenster erleichtert.

Stabilisierte longitudinale In Vivo Visualisierung der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene in einem Murinenmodell mit einem Pankreas-Intravital-Bildgebungsfenster

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Dieses Protokoll beschreibt eine stabilisierte und sich wiederholende zelluläre In-vivo-Bildgebung der Bauchspeicheldrüse mit einem neuartigen intravitalen Bildgebungsfenster der Bauchspeicheldrüse. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es möglich ist, bewegungslose, dreidimensionale Bildgebung mit Auflösung bis zur zellulären Ebene über drei Wochen in der Bauchspeicheldrüse einer lebenden Maus durchzuführen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der chirurgischen Plattform und desinfizieren Sie die Oberflächen mit 70% Ethanol.Verwenden Sie nach der Betäubung eine rektale Sonde mit einem homöothermisch gesteuerten Heizkissen, um die Körpertemperatur zu überwachen. Entfernen Sie haare von der linken Flanke der Maus und tragen Sie alternativ Alkohol und Jod auf, rotieren Sie von der Inzisionsstelle zur äußeren Oberfläche, gehen Sie nie zurück zur Inzisionsstelle und enden Sie mit Jod. Machen Sie dann einen 1,5 Zentimeter genauen Schnitt an der linken Flanke der Maus und sezieren Sie die Haut und den Muskel.Verwenden Sie eine schwarze oder Nylon-4-0-Naht, um eine Geldbörsensaite am Schnittrand durchzuführen. Ziehen Sie die Milz vorsichtig mit einer Ringzette und identifizieren Sie die Bauchspeicheldrüse. Platzieren Sie das Fenster an der Flanke der Maus, führen Sie die Milz und die Bauchspeicheldrüse durch den offenen Raum des Fensters.Legen Sie dann die Bauchspeicheldrüse vorsichtig auf die Platte des Bildfensters, während Sie die Milz auf den offenen Raum des Fensters legen. PanC-1 nuclite red direkt in die Bauchspeicheldrüse injizieren. Verwenden Sie eine 31-Gauge-Katheternadel, um Tropfen n-Butyl-Cyanacrylat-Klebstoff auf den Rand des Bildgebungsfensters aufzutragen, um sicherzustellen, dass nur eine minimale Menge Klebstoff aufgetragen wird.Tragen Sie vorsichtig ein 12 Millimeter rundes Deckglas auf den Rand des Abbildungsfensters auf. Halten Sie dann die Nahtschlaufe, um in die seitliche Nut des Fensters zu passen, und binden Sie sie dreimal. Um die Unterbrechung dieser engen Stiche zu verhindern, wenn die Mäuse wach sind, schneiden Sie die maximale proximale Stelle der Krawatte ab.Beginnen Sie mit dem Einschalten des Intravitalenmikroskops einschließlich der Laserleistung. Um einen Gefäßkatheter einzuführen, drücken Sie mit dem Zeige- und dritten Finger auf die proximale Seite des Schwanzes. Bei Bedarf den Schwanz mit einer Lampe erhitzen.Desinfizieren Sie die Schwanzvene mit einem 70% Ethanolspray, führen Sie dann einen 30-Gauge-Katheter in die laterale Schwanzvene ein und visualisieren Sie das Aufstoßen von Blut im PE-10-Röhrchen. Tragen Sie Seidenband auf den Katheter auf, um ihn zu stabilisieren. Injizieren Sie FITC-Dextran und TMR-Dextran oder gegebenenfalls andere fluoreszierende Sonden entsprechend der Kombination von Fluoreszenzsonden.Setzen Sie eine Rektalsonde ein, um die Körpertemperatur automatisch mit einem homöothermischen Heizkissensystem zu steuern. Setzen Sie dann das pankreatische Bildgebungsfenster ein, das während der intravitalen Mikroskopie vorbereitet wurde, in den Fensterhalter. Übertragen Sie die Maus von der operationsigen Plattform in die bildgebungsgebende Phase.Um eine intravitalen Bildgebung durchzuführen, beginnen Sie mit der Bildgebung der Bauchspeicheldrüse bei einer geringen Vergrößerung, z. B. viermal, um die gesamte Ansicht der Bauchspeicheldrüse im Pankreasbildfenster zu scannen. Sobald der interessierende Bereich bestimmt wurde, wechseln Sie zu einem Objektiv mit höherer Vergrößerung, z. B. 20- oder 40-fach, um Eine Bildgebung auf zellulärer Ebene mit einer lateralen und axialen Auflösung von etwa 0,5 Mikrometern bzw. 3 Mikrometern durchzuführen. Führen Sie Z-Stack- oder Zeitrafferbilder durch, um die 3D-Struktur oder Dynamiken auf zellulärer Ebene wie Zellmigration zu beobachten.Die Intravitalenmikroskopie in Kombination mit dem intravitalen Bildgebungsfenster der Bauchspeicheldrüse bietet eine langfristige Gewebestabilität, die die Erfassung hochauflösender Bildgebung ermöglicht, um einzelne Inseln bis zu drei Wochen lang zu verfolgen. Das Fenster, das in eine C57 schwarze 6 N Maus mit intravenös injiziertem Anti-CD31-Antikörper implantiert wurde, konjugiert mit einem Alexa 647 Fluorophor, erleichterte die großflächige Bildgebung und vergrößerte die 3D-Bildgebung der Bauchspeicheldrüse. Acinarzellen wurden in den gemittelten Bildern von Pankreasgewebe im benachbarten Gefäß identifiziert, visualisiert mit Autofluoreszenz bzw. Anti-CD31-Antikörpern.Mit dem Mosaik-Bildgebungsverfahren, das eine Weitfeldansicht mit hochauflösender Bildgebung kombiniert, wurden etwa 40 bis 50 Inseln mit dem angrenzenden Gefäßsystem in einer MIP-GFP-Maus visualisiert. Eine frühere Studie zeigte, dass Inseln mit dieser stabilen Bildgebungsmethode bis zu drei Wochen lang verfolgt werden können. Um Krebszellen sichtbar zu machen, wurden PANC-1 Nuclite Rote Blutkörperchen während der Operation direkt in die Bauchspeicheldrüse der Maus implantiert und nahe gelegene Gefäße wurden mit Anti-CD31 gefärbt, konjugiert mit Alexa 647.Mit diesem Protokoll wurden Weitfeldbilder von Bauchspeicheldrüsenkrebs erzeugt. Dies trug dazu bei, den Rand des Tumors abzugrenzen und hochauflösende 3D-Bilder auf Einzelzellebene zu erzielen. Der kritischste Schritt bei dieser Methode ist die geschickte Implantation des Pankreas-Bildgebungsfensters in die Maus.Mit anderen Kombinationen der fluoreszierenden Mauszellen und Antikörpersonden konnte eine dynamische Interaktion benachbarter Zellen mit Entweder Inselchen oder Cancel-Zellen identifiziert werden. Diese Methode kann von denjenigen, die die Veränderung der Insel in verschiedenen pathophysiologischen Zuständen und Mikroumgebungen des Bauchspeicheldrüsenkrebses in situ untersuchen, weit verbreitet sein.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Imaging Gliom Initiation<em&gt; In Vivo</em&gt; Durch eine Poliert und Reinforced Thin-skull Cranial Fenster

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

Forschung

Medizin

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Ein Mausmodell der Stentimplantation in der Arteria carotis für das Studium der Restenose

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation in die Vorderkammer des Auges für Längs-, Non-invasive<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging mit Single-cell Auflösung in Echtzeit

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis von konfokalen optischen Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Ein Modell des Einzelfahrzeug Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

in Längsrichtung<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging des Cerebrovasculature: Bedeutung für ZNS-Erkrankungen

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualisierung von endogenen Mitophagie-Komplexen in Situ in menschlichen Pankreas-Betazellen unter Verwendung von Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Robotic Lateral Pancreaticojejunostomy for Chronic Pancreatitis

Roboter Lateral Pancreaticojejunostomie für chronische Pankreatitis

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Präzisionsgeschnittene Leberscheiben als Ex-Vivo-Modell der Leberbiologie

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

A Doxorubicin-Induced Murine Model of Dilated Cardiomyopathy In Vivo

Ein Doxorubicin-induziertes Murinmodell der dilatativen Kardiomyopathie in vivo

Dilated cardiomyopathy (DCM) refers to a spectrum of heterogeneous myocardial disorders characterized by ventricular dilation and depressed cardiac ...