Name: stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window
Uploaded: 2021-05-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענק מס '14-2020-002 מקרן המחקר SNUBH ועל ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).

כל ההליכים המתוארים במאמר זה נערכו בהתאם למהדורההשמינית של המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (2011)26 ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש במכון המתקדם למדע וטכנולוגיה בקוריאה (KAIST) ובאוניברסיטת סיאול הלאומית בונדאנג בית החולים (SNUBH).
1. הכנת ה?...

<ol>
	<li>Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+pancreatic+disease.">Imaging in pancreatic disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).</li><li>Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+imaging+the+normal+and+diseased+pancreas.">Technologies for imaging the normal and diseased pancreas.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li><li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pancreatic+diabetes+(type+3c+diabetes)+underdiagnosed+and+misdiagnosed.">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed.</a> Diabetes Care. 31, 165-169 (2008).</li><li>Baetens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+islet+cell+populations+in+spontaneously+diabetic+mice.">Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice.</a> Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).</li><li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+pancreas:+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology.">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).</li><li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology.">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li><li>Ravier, M. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+pancreatic+islets+for+ex+vivo+imaging+studies+with+trappable+or+recombinant+fluorescent+probes.">Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).</li><li>Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vivo+imaging+method+for+individual+islets+across+the+mouse+pancreas+reveals+a+heterogeneous+insulin+secretion+response+to+glucose.">Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose.</a> Science Reports. 11 (1), 603 (2021).</li><li>Lee, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+resveratrol+treatment+on+graft+revascularization+after+islet+transplantation+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice.">Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Islets. 10 (1), 25-39 (2018).</li><li>Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+islet+transplantation.">In vivo imaging of islet transplantation.</a> Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).</li><li>Mojibian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanted+islets+in+the+anterior+chamber+of+the+eye+are+prone+to+autoimmune+attack+in+a+mouse+model+of+diabetes.">Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147 (5), 983-991 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+revealed+at+single-stem-cell+level+by+in+vivo+live+imaging.">Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging.</a> Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).</li><li>Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas.">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), 1024405 (2015).</li><li>Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+pancreatic+imaging+window+for+stabilized+longitudinal+in+vivo+observation+of+pancreatic+islets+in+murine+model.">A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model.</a> Diabetes &amp; Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury.">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+a+pulmonary+endothelial+surface+layer+in+a+murine+sepsis+model.">Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model.</a> Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).</li><li>Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantitation+of+injected+circulating+tumor+cells+from+great+saphenous+vein+based+on+video-rate+confocal+microscopy.">In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).</li><li>Moon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+longitudinal+imaging+of+hepatic+lipid+droplet+accumulation+in+a+murine+model+for+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease.</a> Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).</li><li>Hwang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cellular-level+real-time+pharmacokinetic+imaging+of+free-form+and+liposomal+indocyanine+green+in+liver.">In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver.</a> Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).</li><li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li><li>Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+tumor-cell+line+(panc-1)+from+a+human+carcinoma+of+the+exocrine+pancreas.">Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas.</a> International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).</li><li>National Institutes of Health. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.+Committee+for+the+Update+of+the+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).</li><li>Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+anesthesia+dramatically+alters+the+oral+glucose+tolerance+and+insulin+secretion+in+C57Bl/6+mice.">Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice.</a> Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).</li><li>Kim, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orthotopic+and+heterotopic+human+pancreatic+cancer+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).</li><li>Cichocki, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK3+inhibition+drives+maturation+of+NK+cells+and+enhances+their+antitumor+activity.">GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity.</a> Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+C-peptide+storage+and+secretion+in+islet+beta-cells+in+vitro+and+in+vivo.">Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li><li>Reissaus, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile,+portable+intravital+microscopy+platform+for+studying+beta-cell+biology+in+vivo.">A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo.</a> Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).</li><li>Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+animal+models+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).</li><li>Bisht, S., Feldmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+modeling+pancreatic+cancer+and+novel+drug+discovery.">Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).</li><li>Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+pancreatic+cancer.">Mouse models of pancreatic cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).</li><li>Feig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreas+cancer+microenvironment.">The pancreas cancer microenvironment.</a> Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).</li><li>Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models+of+pancreatic+cancer:+overview+and+comparison+with+other+types+of+models.">Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models.</a> Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).</li></ol>

הפרוטוקול המתואר כאן מורכב מהדמיה תוך-וינטלית של הלבלב באמצעות חלון הדמיה תוך-וינטלי משולב בסיסי של הלבלב שונה מחלון הדמיה בבטן. בין הפרוטוקולים שתוארו לעיל, הצעד הקריטי הראשון הוא השתלת חלון הדמיית הלבלב התוך-וינטלי בעכבר. ליישום הדבק בחלון, חשוב להחיל את הדבק בין שולי החלון לבין זכוכית ?...

הלבלב הוא איבר בטן עם תפקוד אקסוקריני במערכת העיכול ותפקוד אנדוקריני של הפרשת הורמונים למחזור הדם. הדמיה תאית ברזולוציה גבוהה של הלבלב יכולה לחשוף את הפתופיזיולוגיה של מחלות שונות הקשורות ללבלב, כולל דלקת הלבלב, סרטן הלבלב, סוכרת1. כלי הדמיה אבחוניים קונבנציונליים כגון טומוגרפיה ממוחשבת, הדמיה ברזולוציה מגנטית ואולטרה סאונוגרפיה זמינים באופן נרחב בתחום הקליני1,2. עם זאת, שיטות הדמיה אלה מוגבלות להדמיה של שינויים מבניים או אנטומיים בלבד, בעוד שלא ניתן לקבוע שינויים ברמה התאית או המולקולרית. בהתחשב בכך שינויים מולקולריים בסוכרת או בסרטן הלבלב בבני אדם יכולים ליזום יותר מ -10 שנים לפני האבחון3,4, גילוי מחלות לבלב מהמעבר המולקולרי שלהם במהלך התקופה הסמויה יש פוטנציאל לספק אבחנה מוקדמת והתערבות בזמן. לכן, הדמיה שתתגבר על מגבלות הרזולוציה ותספק תובנות חשובות על הפונקציה תזכה לתשומת לב להפליא על ידי מתן אבחון מוקדם של סרטן הלבלב או זיהוי מתקדם של שינוי האיים במהלך התקדמות הסוכרת5.
בפרט עם האיים, הדמיה גרעינית, הדמיית ביולומינציה וטומוגרפיה קוהרנטית אופטית הוצעו בטכניקות הדמיה לא פולשניות של האי6. עם זאת, הרזולוציה של שיטות אלה נמוכה באופן משמעותי, עם ערכים אופייניים הנעים בין כמה עשרות למאות מיקרומטרים, המציע יכולת מוגבלת לזהות שינויים ברמה התאית באיים. מצד שני, מחקרים קודמים ברזולוציה גבוהה של איים בוצעו תחת ex vivo7,8 (למשל, חיתוך או עיכול של הלבלב), לא פיזיולוגי9 (למשל, חיצוניות של הלבלב), ותנאים הטרוטופסיים10,11,12 (למשל, השתלה מתחת לקפסולת הכליה, בתוך הכבד, ובתא השמאלי של העין), אשר מגביל את הפרשנות שלהם ואת ההשלכות הקליניות. אם ניתן להקים במודלפיזיולוגי ואורתוטופי של הדמיה ברזולוציה גבוהה, זו תהיה פלטפורמה קריטית לחקירת איי הלבלב.
הדמיה תוך-וינטלית, החושפת את הפתופיזיולוגיה ברמת רזולוציה מיקרוסקופית בחיה חיה, קיבלה לאחרונה תשומת לב רבה13. מתוך שיטות ההדמיה in vivo, התפתחות של חלון הדמיהבטן 14, אשר משתיל חלון לתוך הבטן של עכבר, אפשר גילוי של ממצאים חדשניים (כלומר, שלב טרום micrometastasis של גרורות כבד מוקדם15 ומנגנון של תחזוקת תאי גזע אפיתל המעי16). למרות שחלון הדמיית הבטן מספק תוצאות חשובות, היישומים של חלון זה עבור הלבלב וכתוצאה מכך מחקר הדמיה תוך-ויאלית המבוסס על מחלות הקשורות ללבלב, לא נחקרו בהרחבה.
שלא כמו מאפייני האיבר המוצק המוגדרים היטב של הלבלב האנושי, הלבלב של עכבר הוא מבנה רקמות רכות מופץ בצורה מפוזרת17. לכן, הוא מושפע ללא הרף על ידי תנועות פיזיולוגיות כולל פרייסטליזה ונשימה. מחקר קודם על יישום חלון הדמיה בטן עבור הלבלב הראה כי נדודים התרחשו עקב תנועה-חפצים הנגרמים על ידי תנועות מעיים18. טשטוש חמור נצפה בתמונה הממוצעת המתקבלת, אשר עכב את ההדמיה והזיהוי של המבנים microscale.
להלן, אנו מתארים את השימוש בחלון הדמיה תוך-ויטלי משולב של הלבלב בשילוב עם מיקרוסקופיה תוך-ויאלית19,20 כדי לחקור את אירועי רמת התא האורך במחלות המערבות את הלבלב. בנוסף לתיאור מפורט של המתודולוגיה במחקר הקודם18, היישום המורחב של חלון הדמיית הלבלב למחלות שונות הקשורות ללבלב יטופל במאמר זה. בפרוטוקול זה, מערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית לסרוק לייזר בקצב וידאו מותאם אישית שימשה כמערכת מיקרוסקופיה תוך-ויאלית. ארבעה מודולי לייזר (אורכי גל ב-405, 488, 561 ו-640 ננומטר) נוצלו כמקור עירור, וארבעה ערוצים של אותות פליטה זוהו על ידי צינורות פוטומולטיפלייר (PMT) באמצעות מסנני פסים (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). סריקת לייזר כללה מראה מצולעת מסתובבת (ציר X) ומראה סריקת גלבנומטר (ציר Y) שאפשרה את סריקת קצב הווידאו (30 פריימים לשנייה). מידע מפורט על מיקרוסקופיה תוך-וינטלית תואר במחקרים הקודמים10,18,19,20,21,22,23.
במחקר האי הקודם שלנו18, צילמנו בהצלחה ובייצוב את האיים בעכברים חיים באמצעות מודל עכבר מהונדס (MIP-GFP)24 שבו האיים תויגו עם GFP. השיטה אפשרה תצוגה חזותית ברזולוציה גבוהה של השינויים באיים על פני תקופה של שבוע אחד. זה גם הקל הדמיה של אותם איים עד 3 שבועות, אשר מציע את ההיתכנות של מחקרים ארוכי טווח של איי הלבלב עבור מעקב פונקציונלי או ניטור במהלך הפתוגנזה של סוכרת18. יתר על כן, פיתחנו מודל סרטן לבלב אורתופופי שבו תאים סרטניים לבלב פלואורסצנטי (PANC-1 NucLight אדום)25 הושתלו ישירות לתוך הלבלב של העכבר. עם היישום של חלון הדמיה תוך-וינטלית הלבלב, מודל זה יכול לשמש כפלטפורמה לחקירת הפתופיזיולוגיה התאית והמולקולרית במיקרו-סביבה הגידולית של סרטן הלבלב ולניטור טיפולי של מועמדים חדשים לתרופה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Fluorescent probe for conjugate with antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic polyethylene tubing</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>427401</td>
			<td>PE10 catheter for connection with needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>C57BL/6N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circular</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111520</td>
			<td>Cover glass for pancreatic imaging window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Dextran 2MDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>FD200S</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS 8.1</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Microscopy</td>
			<td>IVIM tech</td>
			<td>IVM-C</td>
			<td>Intravital Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>S-1107-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 401</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>401</td>
			<td>N-butyl cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle holder</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>H-1126-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro rectractor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>17004-03</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1034</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIP-GFP</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>006864</td>
			<td>B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon 4-0</td>
			<td>AILEE</td>
			<td>NB434</td>
			<td>Non-Absorbable Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican N 100 30G</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>FT9172220S</td>
			<td>For Vascular Catheter, Use only Needle part</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 NucLightRed</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Made in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatic imaging window</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Pancreatic imaging window - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiosuite</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>PS-02</td>
			<td>Homeothermic temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553708</td>
			<td>Antibody for in vivo vessel labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1090-3</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMR Dextran 65-85kDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>T1162</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window holder</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Window holder - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 100</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window

הדמיה ישירה ברזולוציה תאית של הלבלב במודל של בעלי חיים קטנים וחיים הייתה מאתגרת מבחינה טכנית. מחקר הדמיה תוך-וינטלי שנערך לאחרונה, עם חלון הדמיה בבטן, איפשר הדמיה של הדינמיקה התאית באיברי הבטן ב- vivo. עם זאת, בשל הארכיטקטורה הרכה דמוית גיליון של לבלב העכבר שיכול להיות מושפע בקלות על ידי תנועה פיזיולוגית (למשל, פריסטלזיס ונשימה), היה קשה לבצע אורך מיוצב בהדמיית vivo במשך מספר שבועות ברמה התאית כדי לזהות, לעקוב, לכמת איים או תאים סרטניים בלבלב העכבר. כאן, אנו מתארים שיטה להשתלת בסיס תומך חדשני, חלון הדמיה תוך-ויטלי משולב של הלבלב, שיכול להפריד את הלבלב מהמעי להדמיה תוך-וינטלית של הלבלב. הדמיית vivo אורך עם חלון ההדמיה מאפשרת הדמיה יציבה, המאפשר מעקב אחר איים על פני תקופה של 3 שבועות והדמיה תלת ממדית ברזולוציה גבוהה של המיקרו- מבנה, כפי שניתן לראות כאן במודל סרטן הלבלב האורתופופי. בשיטה שלנו, מחקרי הדמיה תוך-וינטליים נוספים יכולים לברוח את הפתופיזיולוגיה של מחלות שונות המערבות את הלבלב ברמה התאית.

מיקרוסקופיה תוך-וינטלית בשילוב עם חלון ההדמיה התוך-ויטלי המשולב בבסיס הלבלב מאפשר הדמיה של רמת התא האורך של הלבלב בעכבר. פרוטוקול זה עם חלון ההדמיה התוך-וינטלי של הלבלב מספק יציבות רקמות לטווח ארוך המאפשרת רכישת הדמיה ברזולוציה גבוהה כדי לעקוב אחר איים בודדים עד 3 שבועות. כתוצאה מכך, ניתן ?...

Watch this Scientific Journal Video about Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window at JoVE.com

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

In vivo הדמיה ברזולוציה גבוהה של הלבלב היה קל עם חלון הדמיה תוך וינטלית הלבלב.

הדמיה מיוצבת של אורך ב-Vivo ברמה התאית של הלבלב במודל מורין עם חלון הדמיה תוך-וינטלית של הלבלב

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

פרוטוקול זה מתאר רמה תאית מייצבת וחוזרת על הנשימה בהדמיית ויוו של הלבלב עם חלון הדמיה תוך-וינטלית חדשנית בלבלב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע הדמיה תלת ממדית ללא תנועה עם רזולוציה עד לרמה התאית במשך שלושה שבועות בלבלב של עכבר חי. התחל על ידי הכנת הפלטפורמה הכירורגית וחיטוי המשטחים עם 70%אתנול.לאחר נשימה, השתמש בבדיקה רקטלית עם כרית חימום הנשלטת על ידי הומיאותרמיה כדי לפקח על טמפרטורת הגוף. הסר שיער מהאגף השמאלי של העכבר ולהחיל אלכוהול ויוד לחלופין, מסתובב מאתר החתכים אל המשטח החיצוני, לעולם לא חוזר לאתר החתירה, ומסתיים ביוד. לאחר מכן, לעשות 1.5 ס"מ חתכוך על האגף השמאלי של העכבר, לנתח את העור ואת השריר.השתמש בתבל שחור או ניילון 4-0 כדי לבצע תיל מחרוזת ארנק בשולי החתיכה. משוך את הטחול בזהירות עם מלקחיים טבעת ולזהות את הלבלב. הצבת החלון על אגף העכבר, להעביר את הטחול ואת הלבלב דרך המרחב הפתוח של החלון.לאחר מכן, הניחו בעדינות את הלבלב על צלחת חלון ההדמיה תוך הנחת הטחול על המרחב הפתוח של החלון. הזריקו פאנק-1 נוקליט אדום ישירות לתוך הלבלב. השתמש מחט קטטר 31-מד כדי להחיל טיפות של דבק ציאנואקרילט n-Butyl לשולי חלון ההדמיה, הבטחת כמות מינימלית של דבק מוחל.יש למרוח בעדינות זכוכית כיסוי עגולה 12 מ"מ על שולי חלון ההדמיה. לאחר מכן, החזק את לולאת התפר כך שתתאים לחריץ לרוחב של החלון וקשור אותו שלוש פעמים. לבסוף, כדי למנוע את ההפרעה של תפרים הדוקים אלה כאשר העכברים ערים, לחתוך את האתר הפרוקסימלי המרבי של העניבה.התחל על ידי הפעלת המיקרוסקופ התוך-וינטלי, כולל כוח הלייזר. כדי להכניס קטטר וסקולרי, להפעיל לחץ על הצד הפרוקסימלי של הזנב עם האינדקס והאצבע השלישית. במידת הצורך לחמם את הזנב עם מנורה.לחטא את וריד הזנב עם תרסיס אתנול 70%, ולאחר מכן להכניס קטטר 30-מד לתוך הווריד זנב לרוחב לדמיין את regurgitation של דם בצינור PE-10. יש למרוח סרט משי על הקטטר כדי לייצב אותו. הזרקת FITC dextran ו- TMR dextran, או בדיקות פלואורסצנטיות אחרות בהתאם לצורך, על פי השילוב של בדיקות פלואורסצנטיות.הכנס בדיקה רקטלית כדי לשלוט באופן אוטומטי בטמפרטורת הגוף באמצעות מערכת כרית חימום הומיאותרמית. לאחר מכן, הכנס את חלון הדמיית הלבלב שהוכן במהלך ההתקנה של מיקרוסקופיה תוך-וינטלית למחזיק החלון. העבר את העכבר מהפלטפורמה הכירורגית לשלב ההדמיה.כדי לבצע הדמיה תוך-ויאלית, התחל בהדמיית הלבלב בהגדלה נמוכה, כגון ארבע פעמים, כדי לסרוק את כל התצוגה של הלבלב בחלון הדמיית הלבלב. לאחר קביעת אזור העניין, עבור לעדשת יעד הגדלה גבוהה יותר, כמו 20 פעמים או 40 פעמים, כדי לבצע הדמיה ברמה התאית ברזולוציה רוחבית וצירית כ-0.5 מיקרומטר ו-3 מיקרומטרים בהתאמה. בצע הדמיה של Z-stack או זמן-לשגות כדי לבחון את המבנה התלת-ממדי או את הדינמיקה ברמה התאית, כגון העברת תאים.מיקרוסקופיה תוך-וינטלית בשילוב עם חלון ההדמיה התוך-וינטלי של הלבלב מספקת יציבות רקמות לטווח ארוך המאפשרת רכישת הדמיה ברזולוציה גבוהה למעקב אחר איים בודדים למשך עד שלושה שבועות. החלון מושתל בעכבר C57 שחור 6 N עם נוגדן נגד CD31 מוזרק תוך ורידי, מצומד עם פלואורופור Alexa 647, הקל על הדמיה רחבת היקף והדמיה תלת-ממדית מוגדלת של הלבלב. תאי Acinar זוהו בתמונות הממוצעות של רקמת הלבלב בכלי vasculature הסמוך, הדמו באמצעות autofluorescence ו נוגדן אנטי CD31 בהתאמה.באמצעות שיטת הדמיית הפסיפס, המשלבת תצוגה רחבת שדה עם הדמיה ברזולוציה גבוהה, כ-40 עד 50 איונים עם כלי ההשמדה הסמוך הוצגו באופן חזותי בעכבר MIP-GFP. מחקר קודם הראה כי איונים ניתן לעקוב עד שלושה שבועות באמצעות שיטת הדמיה יציבה זו. כדי לדמיין תאים סרטניים, תאים אדומים נוקליט PANC-1 הושתלו ישירות לתוך לבלב העכבר במהלך הניתוח וכלי הדם הסמוכים היו מוכתמים עם אנטי CD31 מצומד עם Alexa 647.באמצעות פרוטוקול זה, נוצרו תמונות רחבות של סרטן הלבלב. זה עזר לשייט את השוליים של הגידול, כמו גם להשיג תמונות 3D ברזולוציה גבוהה ברמת התא הבודד. השלב הקריטי ביותר בשיטה זו הוא ההשתלה המיומנת של חלון הדמיית הלבלב בעכבר.באמצעות שילובים אחרים של תאי עכבר פלואורסצנטיים, ובדיקות נוגדנים, ניתן לזהות אינטראקציה דינמית של תאים סמוכים עם איונים או תאים לבטל. שיטה זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על ידי אלה החוקרים את השינוי של האי בתנאים פתופיזיולוגיים שונים וסביבות מיקרו של סרטן הלבלב במקום.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

הדמית Glioma ייזום<em&gt; In Vivo</em&gt; דרך חלון גולגולתי מלוטש ומחוזק-גולגולת דקה

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

דגם Murine של השתלת תומכן בעורק הראשי לחקר restenosis

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

השתלה ללשכה הקדמית של העין לאורך, לא פולשני<em&gt; בחי</em&gt; הדמיה ברזולוצית תא בודד בזמן אמת

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

רוז בנגל Photothrombosis ידי דימות אופטי Confocal<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של שבץ כלי אחד

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

אֹרכִּי<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של Cerebrovasculature: רלוונטיות למחלות של מערכת העצבים המרכזית

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

ויזואליזציה כמותית של ליקוציטים לחדור במודל Murine של שריר הלב הדוקרני על ידי מיקרוסקופית גיליון אור

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Robotic Lateral Pancreaticojejunostomy for Chronic Pancreatitis

Pancreaticojejunostomy לרוחב רובוטיים עבור דלקת לבלב כרונית

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

מורנה דיוק-גזור פרוסות הכבד כמודל Vivo Ex של ביולוגיה של הכבד

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

A Doxorubicin-Induced Murine Model of Dilated Cardiomyopathy In Vivo

דגם מורין המושרה על ידי דוקסורוביצין של קרדיומיופתיה מונפשת ב- Vivo

Dilated cardiomyopathy (DCM) refers to a spectrum of heterogeneous myocardial disorders characterized by ventricular dilation and depressed cardiac ...