Name: stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window
Uploaded: 2021-05-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window at JoVE.com

Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione n. 14-2020-002 del Fondo di ricerca SNUBH e dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).

Tutte le procedure descritte in questo documento sono state condotte in conformità conl'8a edizione della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (2011)26 e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) e il Seoul National University Bundang Hospital (SNUBH).
1. Preparazione della finestra e di altri materiali
<ol><li>Progettazione personalizzata de...

<ol>
	<li>Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+pancreatic+disease.">Imaging in pancreatic disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).</li><li>Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+imaging+the+normal+and+diseased+pancreas.">Technologies for imaging the normal and diseased pancreas.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li><li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pancreatic+diabetes+(type+3c+diabetes)+underdiagnosed+and+misdiagnosed.">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed.</a> Diabetes Care. 31, 165-169 (2008).</li><li>Baetens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+islet+cell+populations+in+spontaneously+diabetic+mice.">Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice.</a> Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).</li><li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+pancreas:+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology.">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).</li><li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology.">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li><li>Ravier, M. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+pancreatic+islets+for+ex+vivo+imaging+studies+with+trappable+or+recombinant+fluorescent+probes.">Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).</li><li>Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vivo+imaging+method+for+individual+islets+across+the+mouse+pancreas+reveals+a+heterogeneous+insulin+secretion+response+to+glucose.">Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose.</a> Science Reports. 11 (1), 603 (2021).</li><li>Lee, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+resveratrol+treatment+on+graft+revascularization+after+islet+transplantation+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice.">Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Islets. 10 (1), 25-39 (2018).</li><li>Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+islet+transplantation.">In vivo imaging of islet transplantation.</a> Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).</li><li>Mojibian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanted+islets+in+the+anterior+chamber+of+the+eye+are+prone+to+autoimmune+attack+in+a+mouse+model+of+diabetes.">Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147 (5), 983-991 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+revealed+at+single-stem-cell+level+by+in+vivo+live+imaging.">Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging.</a> Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).</li><li>Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas.">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), 1024405 (2015).</li><li>Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+pancreatic+imaging+window+for+stabilized+longitudinal+in+vivo+observation+of+pancreatic+islets+in+murine+model.">A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model.</a> Diabetes &amp; Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury.">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+a+pulmonary+endothelial+surface+layer+in+a+murine+sepsis+model.">Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model.</a> Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).</li><li>Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantitation+of+injected+circulating+tumor+cells+from+great+saphenous+vein+based+on+video-rate+confocal+microscopy.">In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).</li><li>Moon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+longitudinal+imaging+of+hepatic+lipid+droplet+accumulation+in+a+murine+model+for+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease.</a> Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).</li><li>Hwang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cellular-level+real-time+pharmacokinetic+imaging+of+free-form+and+liposomal+indocyanine+green+in+liver.">In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver.</a> Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).</li><li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li><li>Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+tumor-cell+line+(panc-1)+from+a+human+carcinoma+of+the+exocrine+pancreas.">Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas.</a> International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).</li><li>National Institutes of Health. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.+Committee+for+the+Update+of+the+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).</li><li>Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+anesthesia+dramatically+alters+the+oral+glucose+tolerance+and+insulin+secretion+in+C57Bl/6+mice.">Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice.</a> Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).</li><li>Kim, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orthotopic+and+heterotopic+human+pancreatic+cancer+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).</li><li>Cichocki, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK3+inhibition+drives+maturation+of+NK+cells+and+enhances+their+antitumor+activity.">GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity.</a> Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+C-peptide+storage+and+secretion+in+islet+beta-cells+in+vitro+and+in+vivo.">Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li><li>Reissaus, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile,+portable+intravital+microscopy+platform+for+studying+beta-cell+biology+in+vivo.">A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo.</a> Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).</li><li>Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+animal+models+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).</li><li>Bisht, S., Feldmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+modeling+pancreatic+cancer+and+novel+drug+discovery.">Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).</li><li>Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+pancreatic+cancer.">Mouse models of pancreatic cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).</li><li>Feig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreas+cancer+microenvironment.">The pancreas cancer microenvironment.</a> Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).</li><li>Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models+of+pancreatic+cancer:+overview+and+comparison+with+other+types+of+models.">Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models.</a> Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).</li></ol>

Il protocollo qui descritto consiste nell'imaging intravitale del pancreas utilizzando una nuova finestra di imaging intravitale pancreatico integrata nella base di supporto modificata da una finestra di imaging addominale. Tra i protocolli sopra descritti, il primo passo critico è l'impianto della finestra di imaging pancreatico intravitale nel topo. Per l'applicazione della colla nella finestra, è importante applicare la colla tra il margine della finestra e il vetro di copertura, ma non sul tessuto pancreatico, in q...

Il pancreas è un organo addominale con una funzione esocrina nel tratto digestivo e una funzione endocrina di secernere ormoni nel flusso sanguigno. L'imaging cellulare ad alta risoluzione del pancreas potrebbe rivelare la fisiopatologia di varie malattie che coinvolgono il pancreas, tra cui pancreatite, cancro del pancreas e diabete mellito1. Gli strumenti di diagnostica per immagini convenzionali come la tomografia computerizzata, l'imaging a risoluzione magnetica e l'ecografia sono ampiamente disponibili nel campo clinico1,2. Tuttavia, queste modalità di imaging sono limitate alla visualizzazione solo di cambiamenti strutturali o anatomici, mentre le alterazioni a livello cellulare o molecolare non possono essere determinate. Dato che i cambiamenti molecolari nel diabete mellito o nel cancro del pancreas nell'uomo possono iniziare più di 10 anni prima della diagnosi3,4, l'individuazione delle malattie pancreatiche dalla loro transizione molecolare durante il periodo latente ha il potenziale per fornire una diagnosi precoce e un intervento tempestivo. Pertanto, l'imaging che supererà i limiti della risoluzione e fornirà preziose informazioni sulla funzione guadagnerà notevolmente l'attenzione fornendo una diagnosi precoce del cancro del pancreas o l'identificazione avanzata dell'alterazione delle isole durante la progressione del diabete mellito5.
In particolare con le isole, l'imaging nucleare, l'imaging a bioluminescenza e la tomografia a coerenza ottica sono stati suggeriti come tecniche di imaging delle isole non invasive6. Tuttavia, la risoluzione di questi metodi è sostanzialmente bassa, con valori tipici che vanno da diverse decine a centinaia di micrometri, offrendo una capacità limitata di rilevare cambiamenti a livello cellulare negli isolotti. D'altra parte, precedenti studi ad alta risoluzione sulle isole sono stati eseguiti in condizioni ex vivo7,8 (ad esempio, affettamento o digestione del pancreas),9 non fisiologico (ad esempio, esteriorizzazione del pancreas) e condizioni eterotopiche10,11,12 (ad esempio, impianto sotto la capsula renale, all'interno del fegato e nella camera anteriore dell'occhio), che limita la loro interpretazione e le implicazioni cliniche. Se è possibile stabilire un modello in vivo,fisiologico e ortotopico di imaging ad alta risoluzione, sarà una piattaforma critica per lo studio delle isole pancreatiche.
L'imaging intravitale, che rivela la fisiopatologia a livello di risoluzione microscopica in un animale vivo, ha recentemente ricevuto grande attenzione13. Tra i metodi di imaging in vivo, lo sviluppo di una finestra di imaging addominale14, che impianta una finestra nell'addome di un topo, ha permesso la scoperta di nuovi risultati (cioè uno stadio di pre-micrometastasi delle metastasi epatiche precoci15 e meccanismo di mantenimento delle cellule staminali nell'epitelio intestinale16). Sebbene la finestra di imaging addominale fornisca risultati preziosi, le applicazioni di questa finestra per il pancreas e la conseguente ricerca di imaging intravitale basata su malattie che coinvolgono il pancreas, non sono state ampiamente studiate.
A differenza delle caratteristiche ben definite degli organi solidi del pancreas umano, il pancreas di un topo è una struttura simile ai tessuti molli diffusamente distribuita17. Pertanto, è incessantemente influenzato da movimenti fisiologici tra cui peristalsi e respirazione. Un precedente studio sull'applicazione di una finestra di imaging addominale per il pancreas ha dimostrato che il vagabondaggio si è verificato a causa di artefatti di movimento indotti da movimenti intestinali18. È stata osservata una grave sfocatura nell'immagine mediata risultante, che ha impedito la visualizzazione e l'identificazione delle strutture su microscala.
Qui, descriviamo l'uso di una nuova finestra di imaging intravitale pancreatico integrata di base di supporto combinata con la microscopia intravitale19,20 per indagare gli eventi di livello cellulare longitudinale nelle malattie che coinvolgono il pancreas. Oltre a una descrizione dettagliata della metodologia nel precedente studio18, l'applicazione estesa della finestra di imaging pancreatico per varie malattie che coinvolgono il pancreas sarà affrontata in questo documento. In questo protocollo, un sistema di microscopia confocale a scansione laser a velocità video personalizzato è stato utilizzato come sistema di microscopia intravitale. Quattro moduli laser (lunghezze d'onda a 405, 488, 561 e 640 nm) sono stati utilizzati come sorgente di eccitazione e quattro canali di segnali di emissione sono stati rilevati da tubi fotomoltiplicatori (PMT) attraverso filtri passa-banda (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). La scansione laser consisteva in uno specchio poligonale rotante (asse X) e uno specchio di scansione galvanometro (asse Y) che consentivano la scansione della velocità video (30 fotogrammi al secondo). Informazioni dettagliate sulla microscopia intravitale sono state descritte negli studi precedenti10,18,19,20,21,22,23.
Nel nostro precedente studio sulle isole18,abbiamo ripreso con successo e stabilmente le isole in topi vivi utilizzando un modello murino transgenico (MIP-GFP)24 in cui le isole sono state etichettate con GFP. Il metodo ha consentito la visualizzazione ad alta risoluzione dei cambiamenti negli isolotti per un periodo di 1 settimana. Ha anche facilitato l'imaging delle stesse isole per un massimo di 3 settimane, il che suggerisce la fattibilità di studi a lungo termine delle isole pancreatiche per il monitoraggio funzionale o il monitoraggio durante la patogenesi del diabete mellito18. Inoltre, abbiamo sviluppato un modello di carcinoma pancreatico ortotopico in cui le cellule tumorali pancreatiche fluorescenti (PANC-1 NucLight Red)25 sono state impiantate direttamente nel pancreas del topo. Con l'applicazione della finestra di imaging intravitale pancreatico, questo modello potrebbe essere utilizzato come piattaforma per studiare la fisiopatologia cellulare e molecolare nel microambiente tumorale del cancro del pancreas e per il monitoraggio terapeutico di nuovi farmaci candidati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Fluorescent probe for conjugate with antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic polyethylene tubing</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>427401</td>
			<td>PE10 catheter for connection with needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>C57BL/6N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circular</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111520</td>
			<td>Cover glass for pancreatic imaging window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Dextran 2MDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>FD200S</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS 8.1</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Microscopy</td>
			<td>IVIM tech</td>
			<td>IVM-C</td>
			<td>Intravital Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>S-1107-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 401</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>401</td>
			<td>N-butyl cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle holder</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>H-1126-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro rectractor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>17004-03</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1034</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIP-GFP</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>006864</td>
			<td>B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon 4-0</td>
			<td>AILEE</td>
			<td>NB434</td>
			<td>Non-Absorbable Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican N 100 30G</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>FT9172220S</td>
			<td>For Vascular Catheter, Use only Needle part</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 NucLightRed</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Made in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatic imaging window</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Pancreatic imaging window - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiosuite</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>PS-02</td>
			<td>Homeothermic temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553708</td>
			<td>Antibody for in vivo vessel labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1090-3</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMR Dextran 65-85kDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>T1162</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window holder</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Window holder - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 100</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window

L'imaging diretto in vivo a risoluzione cellulare del pancreas in un modello di piccolo animale vivo è stato tecnicamente impegnativo. Un recente studio di imaging intravitale, con una finestra di imaging addominale, ha permesso la visualizzazione delle dinamiche cellulari negli organi addominali in vivo. Tuttavia, a causa dell'architettura morbida del pancreas del topo che può essere facilmente influenzata dal movimento fisiologico (ad esempio, peristalsi e respirazione), è stato difficile eseguire l'imaging longitudinale in vivo stabilizzato per diverse settimane a livello cellulare per identificare, tracciare e quantificare isole o cellule tumorali nel pancreas del topo. Qui, descriviamo un metodo per impiantare una nuova base di supporto, una finestra di imaging intravitale pancreatica integrata, che può separare spazialmente il pancreas dall'intestino per l'imaging intravitale longitudinale time-lapse della microstruttura del pancreas. L'imaging longitudinale in vivo con la finestra di imaging consente una visualizzazione stabile, consentendo il tracciamento delle isole per un periodo di 3 settimane e l'imaging tridimensionale ad alta risoluzione della microstruttura, come evidenziato qui in un modello di cancro del pancreas ortotopico. Con il nostro metodo, ulteriori studi di imaging intravitale possono chiarire la fisiopatologia di varie malattie che coinvolgono il pancreas a livello cellulare.

La microscopia intravitale combinata con la finestra di imaging intravitale pancreatico integrata nella base di supporto consente l'imaging longitudinale a livello cellulare del pancreas in un topo. Questo protocollo con la finestra di imaging intravitale pancreatico fornisce stabilità tissutale a lungo termine che consente l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione per tracciare le singole isole per un massimo di 3 settimane. Di conseguenza, è possibile ottenere l'imaging a mosaico per un campo visivo esteso, la r...

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Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

L'imaging ad alta risoluzione in vivo del pancreas è stato facilitato con la finestra di imaging intravitale pancreatico.

Visualizzazione longitudinale stabilizzata a livello cellulare in vivo del pancreas in un modello murino con una finestra di imaging intravitale pancreatico

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Questo protocollo descrive l'imaging in vivo stabilizzato e ripetitivo a livello cellulare del pancreas con una nuova finestra di imaging intravitale pancreatico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile eseguire immagini tridimensionali immobili con risoluzione fino al livello cellulare per tre settimane nel pancreas di un topo vivo. Inizia preparando la piattaforma chirurgica e disinfettando le superfici con il 70% di etanolo.Dopo l'anestesia, utilizzare una sonda rettale con una piastra riscaldante controllata da omeotermico per monitorare la temperatura corporea. Rimuovere i peli dal fianco sinistro del mouse e applicare alcol e iodio in alternativa, ruotando dal sito di incisione alla superficie esterna, non tornando mai al sito di incisione e terminando con iodio. Quindi, fai un'incisione di 1,5 centimetri sul fianco sinistro del topo, sezionando la pelle e il muscolo.Utilizzare una sutura 4-0 nera o di nylon per eseguire una sutura della corda della borsa nel margine dell'incisione. Tirare accuratamente la milza con una pinza ad anello e identificare il pancreas. Posizionando la finestra sul fianco del mouse, passare la milza e il pancreas attraverso lo spazio aperto della finestra.Quindi, posizionare delicatamente il pancreas sulla piastra della finestra di imaging mentre si posiziona la milza sullo spazio aperto della finestra. Iniettare PANC-1 nuclite rosso direttamente nel pancreas. Utilizzare un ago per catetere calibro 31 per applicare gocce di colla cianoacrilato di n-butile al margine della finestra di imaging, assicurando che venga applicata una quantità minima di colla.Applicare delicatamente un vetro di copertura rotondo da 12 millimetri sul margine della finestra di imaging. Quindi, tenere premuto il circuito di sutura per adattarlo alla scanalatura laterale della finestra e legarlo tre volte. Infine, per evitare l'interruzione di questi punti stretti quando i topi sono svegli, tagliare il sito massimo prossimale della cravatta.Inizia accendendo il microscopio intravitale, compresa la potenza del laser. Per inserire un catetere vascolare, applicare una pressione sul lato prossimale della coda con l'indice e il terzo dito. Se necessario riscaldare la coda con una lampada.Disinfettare la vena della coda con uno spray al 70% di etanolo, quindi inserire un catetere calibro 30 nella vena laterale della coda e visualizzare il rigurgito di sangue nel tubo PE-10. Applicare del nastro di seta sul catetere per stabilizzarlo. Iniettare destrano FITC e destrano TMR o altre sonde fluorescenti a seconda dei casi, in base alla combinazione di sonde fluorescenti.Inserire una sonda rettale per controllare automaticamente la temperatura corporea con un sistema di termoforo omeotermico. Quindi, inserire la finestra di imaging pancreatico preparata durante la configurazione della microscopia intravitale nel supporto della finestra. Trasferire il mouse dalla piattaforma chirurgica alla fase di imaging.Per eseguire l'imaging intravitale, iniziare con l'imaging del pancreas a basso ingrandimento, ad esempio quattro volte, per scansionare l'intera vista del pancreas nella finestra di imaging pancreatico. Una volta determinata la regione di interesse, passare a un obiettivo a ingrandimento più elevato, come 20 volte o 40 volte, per eseguire l'imaging a livello cellulare con risoluzione laterale e assiale di circa 0,5 micrometri e 3 micrometri rispettivamente. Esegui l'imaging Z-stack o time-lapse per osservare la struttura 3D o le dinamiche a livello cellulare come la migrazione cellulare.La microscopia intravitale combinata con la finestra di imaging intravitale pancreatico fornisce stabilità tissutale a lungo termine che consente l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione per tracciare le singole isole per un massimo di tre settimane. La finestra impiantata in un topo C57 nero 6 N con anticorpo anti-CD31 iniettato per via endovenosa, coniugato con un fluoroforo Alexa 647, ha facilitato l'imaging ad ampia area e l'ingrandimento 3D del pancreas. Le cellule acinari sono state identificate nelle immagini medie del tessuto pancreatico nella vascolarizzazione adiacente, visualizzate utilizzando rispettivamente l'autofluorescenza e l'anticorpo anti-CD31.Utilizzando il metodo di imaging a mosaico, che combina una vista ad ampio campo con l'imaging ad alta risoluzione, circa 40-50 isole con la vascolarizzazione adiacente sono state visualizzate in un mouse MIP-GFP. Uno studio precedente ha dimostrato che le isole possono essere monitorate per un massimo di tre settimane utilizzando questo metodo di imaging stabile. Per visualizzare le cellule tumorali, i globuli rossi nuclite PANC-1 sono stati impiantati direttamente nel pancreas del topo durante l'intervento chirurgico e i vasi vicini sono stati colorati con anti-CD31 coniugato con Alexa 647.Utilizzando questo protocollo, sono state generate immagini ad ampio campo del cancro del pancreas. Ciò ha contribuito a delineare il margine del tumore, oltre a ottenere immagini 3D ad alta risoluzione a livello di singola cellula. Il passo più critico in questo metodo è l'abile impianto della finestra di imaging pancreatico nel topo.Utilizzando altre combinazioni di cellule di topo fluorescenti e sonde anticorpali, è stato possibile identificare l'interazione dinamica delle cellule vicine con isole o cellule cancel. Questo metodo può essere ampiamente applicato da coloro che esplorano il cambiamento dell'isolotto in varie condizioni fisiopatologiche e micro-ambienti del cancro del pancreas in situ.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Imaging Glioma Iniziazione<em&gt; In Vivo</em&gt; Attraverso un lucido e sottile rinforzato cranio finestra craniale

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

Ricerca

Medicina

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Un modello murino di impianto di stent a livello dell&#39;arteria carotidea per lo Studio della restenosi

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Trapianto nella camera anteriore dell&#39;occhio per longitudinale, non invasiva<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging con Single-cella di risoluzione in tempo reale

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rosa Bengala Photothrombosis da confocale Optical Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di singolo vaso Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging del Cerebrovasculature: Rilevanza per le malattie del sistema nervoso centrale

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Visualizzazione quantitativa di leucociti infiltrati in un modello di murina della miocardite fulminante mediante microscopia a foglio chiaro

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualizzazione di complessi mitogeni endogeni in Situ in cellule beta pancreatiche umane utilizzando la generazione di testdi di ligazione di prossimità

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Robotic Lateral Pancreaticojejunostomy for Chronic Pancreatitis

Pancreaticojejutostomia laterale robotica per la pancreatite cronica

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Precision-Cut Liver Slices come un modello Ex Vivo di biologia del fegato

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

A Doxorubicin-Induced Murine Model of Dilated Cardiomyopathy In Vivo

Un modello murino indotto da doxorubicina di cardiomiopatia dilatativa in vivo

Dilated cardiomyopathy (DCM) refers to a spectrum of heterogeneous myocardial disorders characterized by ventricular dilation and depressed cardiac ...