Name: stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window
Uploaded: 2021-05-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window at JoVE.com

Denne studien ble støttet av grant No. 14-2020-002 fra SNUBH Research Fund og av National Research Foundation of Korea (NRF) stipend finansiert av Korea regjeringen (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).

Alle prosedyrer beskrevet i dette dokumentet ble utført i samsvar med den8. utgaven av Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (2011)26 og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) og Seoul National University Bundang Hospital (SNUBH).
1. Forberedelse av vinduet og andre materialer
<ol><li>Tilpasset design av vinduet for intravital bildebehandling i bukspyttkjertelen for ...

<ol>
	<li>Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+pancreatic+disease.">Imaging in pancreatic disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).</li><li>Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+imaging+the+normal+and+diseased+pancreas.">Technologies for imaging the normal and diseased pancreas.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li><li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pancreatic+diabetes+(type+3c+diabetes)+underdiagnosed+and+misdiagnosed.">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed.</a> Diabetes Care. 31, 165-169 (2008).</li><li>Baetens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+islet+cell+populations+in+spontaneously+diabetic+mice.">Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice.</a> Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).</li><li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+pancreas:+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology.">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).</li><li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology.">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li><li>Ravier, M. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+pancreatic+islets+for+ex+vivo+imaging+studies+with+trappable+or+recombinant+fluorescent+probes.">Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).</li><li>Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vivo+imaging+method+for+individual+islets+across+the+mouse+pancreas+reveals+a+heterogeneous+insulin+secretion+response+to+glucose.">Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose.</a> Science Reports. 11 (1), 603 (2021).</li><li>Lee, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+resveratrol+treatment+on+graft+revascularization+after+islet+transplantation+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice.">Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Islets. 10 (1), 25-39 (2018).</li><li>Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+islet+transplantation.">In vivo imaging of islet transplantation.</a> Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).</li><li>Mojibian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanted+islets+in+the+anterior+chamber+of+the+eye+are+prone+to+autoimmune+attack+in+a+mouse+model+of+diabetes.">Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147 (5), 983-991 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+revealed+at+single-stem-cell+level+by+in+vivo+live+imaging.">Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging.</a> Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).</li><li>Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas.">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), 1024405 (2015).</li><li>Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+pancreatic+imaging+window+for+stabilized+longitudinal+in+vivo+observation+of+pancreatic+islets+in+murine+model.">A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model.</a> Diabetes &amp; Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury.">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+a+pulmonary+endothelial+surface+layer+in+a+murine+sepsis+model.">Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model.</a> Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).</li><li>Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantitation+of+injected+circulating+tumor+cells+from+great+saphenous+vein+based+on+video-rate+confocal+microscopy.">In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).</li><li>Moon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+longitudinal+imaging+of+hepatic+lipid+droplet+accumulation+in+a+murine+model+for+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease.</a> Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).</li><li>Hwang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cellular-level+real-time+pharmacokinetic+imaging+of+free-form+and+liposomal+indocyanine+green+in+liver.">In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver.</a> Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).</li><li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li><li>Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+tumor-cell+line+(panc-1)+from+a+human+carcinoma+of+the+exocrine+pancreas.">Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas.</a> International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).</li><li>National Institutes of Health. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.+Committee+for+the+Update+of+the+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).</li><li>Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+anesthesia+dramatically+alters+the+oral+glucose+tolerance+and+insulin+secretion+in+C57Bl/6+mice.">Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice.</a> Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).</li><li>Kim, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orthotopic+and+heterotopic+human+pancreatic+cancer+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).</li><li>Cichocki, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK3+inhibition+drives+maturation+of+NK+cells+and+enhances+their+antitumor+activity.">GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity.</a> Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+C-peptide+storage+and+secretion+in+islet+beta-cells+in+vitro+and+in+vivo.">Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li><li>Reissaus, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile,+portable+intravital+microscopy+platform+for+studying+beta-cell+biology+in+vivo.">A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo.</a> Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).</li><li>Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+animal+models+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).</li><li>Bisht, S., Feldmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+modeling+pancreatic+cancer+and+novel+drug+discovery.">Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).</li><li>Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+pancreatic+cancer.">Mouse models of pancreatic cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).</li><li>Feig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreas+cancer+microenvironment.">The pancreas cancer microenvironment.</a> Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).</li><li>Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models+of+pancreatic+cancer:+overview+and+comparison+with+other+types+of+models.">Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models.</a> Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).</li></ol>

Protokollen som er beskrevet her består av intravital avbildning av bukspyttkjertelen ved hjelp av en ny støttebase integrert bukspyttkjertel intravital bildebehandling vindu modifisert fra et abdominal bildevindu. Blant protokollene beskrevet ovenfor er det første kritiske trinnet implantasjonen av det intravitale bukspyttkjertelavbildningsvinduet i musen. For påføring av limet i vinduet er det viktig å bruke limet mellom vinduets margin og dekkglasset, men ikke på bukspyttkjertelen vev, da det kan forstyrre intr...

Bukspyttkjertelen er et bukorgan med eksokrine funksjon i fordøyelseskanalen og en endokrine funksjon av utskillende hormoner i blodet. Høyoppløselig cellulær avbildning av bukspyttkjertelen kan avsløre patofysiologien til ulike sykdommer som involverer bukspyttkjertelen, inkludert pankreatitt, kreft i bukspyttkjertelen og diabetes mellitus1. Konvensjonelle diagnostiske bildebehandlingsverktøy som beregnet tomografi, magnetisk oppløsningsavbildning og ultrasonografi er allment tilgjengelig i det kliniske feltet1,2. Imidlertid er disse bildemodalitetene begrenset til å visualisere bare strukturelle eller anatomiske endringer, mens endringer på cellulært eller molekylært nivå ikke kan bestemmes. Gitt at molekylære endringer i diabetes mellitus eller bukspyttkjertelkreft hos mennesker kan initiere mer enn 10 år før diagnosen3,4, har påvisning av bukspyttkjertelsykdommer fra deres molekylære overgang i latent periode potensial til å gi en tidlig diagnose og en rettidig intervensjon. Dermed vil avbildning som vil overvinne oppløsningsbegrensningene og gi verdifull innsikt i funksjonen bemerkelsesverdig få oppmerksomhet ved å gi tidlig diagnose av bukspyttkjertelkreft eller avansert identifisering av endringen av holmene under progresjonen av diabetes mellitus5.
Spesielt med holmer, kjernefysisk avbildning, bioluminescensavbildning og optisk koherenstomografi har blitt foreslått som ikke-invasive holmeavbildningsteknikker6. Imidlertid er oppløsningen av disse metodene betydelig lav, med typiske verdier som spenner fra flere titalls til hundrevis av mikrometer, og tilbyr en begrenset evne til å oppdage endringer på mobilnivå i holmene. På den annen side ble tidligere høyoppløselige studier av holmer utført under ex vivo7,8 (f.eks. kutting eller fordøyelse av bukspyttkjertelen), ikke-fysiologisk9 (f.eks. eksteriørisering av bukspyttkjertelen) og heterotopiske forhold10,11,12 (f.eks. implantasjon under nyrekapselen, inne i leveren og i øyets fremre kammer), som begrenser deres tolkning og kliniske implikasjoner. Hvis in vivo, fysiologiske og ortotopiske modeller av høyoppløselig avbildning kan etableres, vil det være en kritisk plattform for undersøkelse av bukspyttkjertel holmer.
Intravital avbildning, som avslører patofysiologien på et mikroskopisk oppløsningsnivå i et levende dyr, har nylig fått stor oppmerksomhet13. Av in vivo-avbildningsmetodene har utviklingen av et abdominal bildevindu14, som implanterer et vindu inn i magen til en mus, tillatt oppdagelsen av nye funn (dvs. et pre-mikrometastasis stadium av tidlig levermetastase15 og mekanisme for stamcellevedlikehold i tarmepitelet16). Selv om abdominal avbildningsvinduet gir verdifulle resultater, har applikasjonene til dette vinduet for bukspyttkjertelen og den resulterende intravitale bildeforskningen basert på sykdommer som involverer bukspyttkjertelen, ikke blitt grundig undersøkt.
I motsetning til de veldefinerte faste organegenskapene til den menneskelige bukspyttkjertelen, er bukspyttkjertelen til en mus en diffust fordelt bløtvevslignende struktur17. Derfor påvirkes det uopphørlig av fysiologiske bevegelser, inkludert peristaltikk og åndedrett. En tidligere studie om anvendelsen av et abdominal bildevindu for bukspyttkjertelen viste at vandring skjedde på grunn av bevegelsesartefakter indusert av avføring18. Alvorlig uskarphet ble observert i det resulterende gjennomsnittlige bildet, noe som hindret visualisering og identifisering av mikroskalastrukturene.
Her beskriver vi bruken av en ny støttebase integrert bukspyttkjertel intravital bildebehandlingsvindu kombinert med intravital mikroskopi19,20 for å undersøke langsgående cellulære nivå hendelser i sykdommer som involverer bukspyttkjertelen. I tillegg til en detaljert beskrivelse av metodikken i forrige studie18, vil den utvidede anvendelsen av bukspyttkjertelavbildningsvindu for ulike sykdommer som involverer bukspyttkjertelen bli adressert i dette dokumentet. I denne protokollen ble et spesialbygd laserskanningssystem for videohastighet brukt som et intravitalt mikroskopisystem. Fire lasermoduler (bølgelengder ved 405, 488, 561 og 640 nm) ble brukt som eksitasjonskilde, og fire kanaler med utslippssignaler ble oppdaget av fotomultiplierrør (PMT) gjennom bandpassfiltre (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Laserskanning besto av et roterende polygonalt speil (X-akse) og et galvanometerskanningsspeil (Y-akse) som aktiverte videohastighetsskanning (30 bilder per sekund). Detaljert informasjon om intravital mikroskopi er beskrevet i de tidligere studiene10,18,19,20,21,22,23.
I vår forrige holmestudie18, vi vellykket og stabilt avbildet holmene i levende mus ved hjelp av en transgen musemodell (MIP-GFP)24 der holmene ble merket med GFP. Metoden aktiverte høyoppløselig visualisering av endringene i holmene over en periode på 1 uke. Det forenklet også avbildning av de samme holmene i opptil 3 uker, noe som antyder muligheten for langsiktige studier av bukspyttkjertel holmer for funksjonell sporing eller overvåking under patogenesen av diabetes mellitus18. Videre utviklet vi en ortotopisk kreftmodell i bukspyttkjertelen der fluorescerende kreftceller i bukspyttkjertelen (PANC-1 NucLight Red)25 ble direkte implantert i musens bukspyttkjertel. Med anvendelsen av bukspyttkjertelen intravital avbildningsvindu, kan denne modellen brukes som en plattform for å undersøke cellulær og molekylær patofysiologi i tumormikromiljøet av bukspyttkjertelkreft og for terapeutisk overvåking av nye legemiddelkandidater.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Fluorescent probe for conjugate with antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic polyethylene tubing</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>427401</td>
			<td>PE10 catheter for connection with needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>C57BL/6N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circular</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111520</td>
			<td>Cover glass for pancreatic imaging window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Dextran 2MDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>FD200S</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS 8.1</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Microscopy</td>
			<td>IVIM tech</td>
			<td>IVM-C</td>
			<td>Intravital Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>S-1107-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 401</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>401</td>
			<td>N-butyl cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle holder</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>H-1126-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro rectractor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>17004-03</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1034</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIP-GFP</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>006864</td>
			<td>B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon 4-0</td>
			<td>AILEE</td>
			<td>NB434</td>
			<td>Non-Absorbable Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican N 100 30G</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>FT9172220S</td>
			<td>For Vascular Catheter, Use only Needle part</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 NucLightRed</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Made in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatic imaging window</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Pancreatic imaging window - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiosuite</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>PS-02</td>
			<td>Homeothermic temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553708</td>
			<td>Antibody for in vivo vessel labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1090-3</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMR Dextran 65-85kDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>T1162</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window holder</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Window holder - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 100</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window

Direkte in vivo cellulær oppløsningsavbildning av bukspyttkjertelen i en levende liten dyremodell har vært teknisk utfordrende. En nylig intravital avbildningsstudie, med et abdominal bildevindu, aktivert visualisering av cellulær dynamikk i bukorganer in vivo. På grunn av den myke arklignende arkitekturen til musens bukspyttkjertel som lett kan påvirkes av fysiologisk bevegelse (f.eks. peristaltikk og åndedrett), var det vanskelig å utføre stabiliserte langsgående in vivo-avbildning over flere uker på cellenivå for å identifisere, spore og kvantifisere holmer eller kreftceller i bukspyttkjertelen. Her beskriver vi en metode for implantering av en ny støttebase, et integrert intravitalt bildevindu i bukspyttkjertelen, som kan skille bukspyttkjertelen fra tarmen for langsgående tidsforløp intravital avbildning av bukspyttkjertelens mikrostruktur. Langsgående in vivo-avbildning med bildevinduet muliggjør stabil visualisering, noe som muliggjør sporing av holmer over en periode på 3 uker og høyoppløselig tredimensjonal bildebehandling av mikrostrukturen, som det fremgår her i en ortotopisk kreftmodell i bukspyttkjertelen. Med vår metode kan ytterligere intravitale avbildningsstudier belyse patofysiologien til ulike sykdommer som involverer bukspyttkjertelen på cellenivå.

Intravital mikroskopi kombinert med støttebasen integrert pankreas intravital bildebehandling vindu muliggjør langsgående cellulær nivå bildebehandling av bukspyttkjertelen i en mus. Denne protokollen med pankreas intravital bildebehandlingsvindu gir langsiktig vevsstabilitet som gjør det mulig å anskaffe høyoppløselig avbildning for å spore individuelle holmer i opptil 3 uker. Som et resultat kan mosaikkavbildning for et utvidet synsfelt, tredimensjonal (3D) rekonstruksjon av z-stack-avbildning og langsgående...

Watch this Scientific Journal Video about Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window at JoVE.com

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

In vivo høyoppløselig bildebehandling av bukspyttkjertelen ble tilrettelagt med bukspyttkjertelen intravital bildebehandling vinduet.

Stabilisert langsgående in vivo-mobilnivåvisualisering av bukspyttkjertelen i en murinemodell med et intravitalt bildevindu i bukspyttkjertelen

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Denne protokollen beskriver stabilisert og repeterende in vivo-avbildning av bukspyttkjertelen på cellenivå med et nytt intravitalt bildevindu i bukspyttkjertelen. Den største fordelen med denne teknikken er at det er mulig å utføre ubevegelig, tredimensjonal bildebehandling med oppløsning opp til cellenivå over tre uker i bukspyttkjertelen til en levende mus. Begynn med å forberede den kirurgiske plattformen og desinfisere overflatene med 70% etanol.Etter bedøvelse, bruk en rektal sonde med en homeothermic-kontrollert varmepute for å overvåke kroppstemperaturen. Fjern hår fra venstre flanke av musen og påfør alkohol og jod alternativt, roterer fra snittstedet til den ytre overflaten, går aldri tilbake til snittstedet og slutter med jod. Deretter gjør du et 1,5 centimeter snitt på venstre flanke av musen, dissekerer huden og muskelen.Bruk en svart eller nylon 4-0 sutur for å utføre en veskestreng sutur i snittmarginen. Trekk milten forsiktig med ring tang og identifiser bukspyttkjertelen. Plasser vinduet på flanken av musen, passere milten og bukspyttkjertelen gjennom det åpne rommet i vinduet.Plasser deretter bukspyttkjertelen forsiktig på platen i bildevinduet mens du plasserer milten på vinduets åpne plass. Injiser PANC-1 nuklidrød direkte i bukspyttkjertelen. Bruk en 31-gauge kateternål for å påføre dråper n-Butyl cyanoacrylat lim til margen på bildevinduet, og sørg for at en minimal mengde lim påføres.Påfør forsiktig et 12 millimeter rundt dekselglass på kanten av bildevinduet. Hold deretter suturløkken for å passe inn i vinduets laterale spor og bind den tre ganger. Til slutt, for å forhindre avbrudd av disse stramme masker når musene er våken, kutt det maksimale proksimale stedet for slipset.Begynn med å slå på det intravitale mikroskopet, inkludert laserkraften. For å sette inn et vaskulært kateter, trykk på den proksimale siden av halen med indeksen og tredje finger. Om nødvendig varme halen med en lampe.Desinfiser halevenen med en 70% etanolspray, sett deretter et 30-gauge kateter inn i sidehalevenen og visualiser oppblåstheten av blod i PE-10-røret. Påfør silkebånd på kateteret for å stabilisere det. Injiser FITC dextran og TMR dextran, eller andre fluorescerende sonder etter behov, i henhold til kombinasjonen av fluorescerende sonder.Sett inn en rektal sonde for automatisk å kontrollere kroppstemperaturen med et homeothermic varmeputesystem. Sett deretter inn vinduet for bukspyttkjertelavbildning som ble utarbeidet under det intravitale mikroskopioppsettet, i vindusholderen. Overfør musen fra den kirurgiske plattformen til bildestadiet.Hvis du vil utføre intravital avbildning, begynner du med å ta bilde av bukspyttkjertelen ved en lav forstørrelse, for eksempel fire ganger, for å skanne hele visningen av bukspyttkjertelen i bildevinduet i bukspyttkjertelen. Når interesseområdet er bestemt, bytt til en høyere forstørrelsesmållinse, som 20 ganger eller 40 ganger, for å utføre bildebehandling på cellenivå med lateral og aksial oppløsning omtrent 0,5 mikrometer og 3 mikrometer. Utfør Z-stack- eller tidsforløpavbildning for å observere 3D-strukturen eller dynamikken på cellenivå, for eksempel cellemigrering.Intravital mikroskopi kombinert med bukspyttkjertelen intravital bildebehandling vinduet gir langsiktig vev stabilitet som gjør det mulig å anskaffe høyoppløselig avbildning for å spore individuelle holmer i opptil tre uker. Vinduet implantert i en C57 svart 6 N mus med intravenøst injisert anti-CD31 antistoff, konjugert med en Alexa 647 fluorofor, tilrettelagt bred-området bildebehandling og forstørret 3D-bildebehandling av bukspyttkjertelen. Acinarceller ble identifisert i de gjennomsnittlige bildene av bukspyttkjertelvev i den tilstøtende vaskulaturen, visualisert ved hjelp av henholdsvis autofluorescence og anti-CD31 antistoff.Ved hjelp av mosaikkavbildningsmetoden, som kombinerer en vidvinkelvisning med høyoppløselig bildebehandling, ble omtrent 40 til 50 holmer med den tilstøtende vaskulaturen visualisert i en MIP-GFP-mus. En tidligere studie viste at holmer kan spores i opptil tre uker ved hjelp av denne stabile avbildningsmetoden. For å visualisere kreftceller ble PANC-1 nuklidrøde celler direkte implantert i musens bukspyttkjertel under operasjonen, og nærliggende kar ble farget med anti-CD31 konjugert med Alexa 647.Ved hjelp av denne protokollen ble det generert bredfeltsbilder av kreft i bukspyttkjertelen. Dette bidro til å avgrense svulstens margin, samt oppnå høyoppløselige 3D-bilder på enkeltcellenivå. Det mest kritiske trinnet i denne metoden er dyktig implantasjon av bukspyttkjertelavbildningsvinduet i musen.Ved hjelp av andre kombinasjoner av fluorescerende museceller og antistoffprober kan dynamisk interaksjon mellom nærliggende celler med enten holmer eller avbryte celler identifiseres. Denne metoden kan brukes mye av de som utforsker endringen av holmen i ulike patofysiologiske forhold og mikromiljøer av bukspyttkjertelen kreft in situ.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Imaging Glioma Initiation<em&gt; In Vivo</em&gt; Gjennom en polert og Forsterket Thin-skull Cranial Window

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

En murine modell av stent i halspulsåren for studier av Restenosis

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantasjon i fremre kammer av øyet for Longitudinal, Ikke-invasive<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging med encellede oppløsning i sanntid

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis av Confocal Optical Imaging<em&gt; I Vivo</em&gt;: En modell av enkelt Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

longitudinal<em&gt; I Vivo</em&gt; Imaging av Cerebrovasculature: Relevans til CNS sykdommer

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kvantitativ visualisering av leukocytinfiltrat i en murin modell av Fulminant myokarditt ved lysarkmikroskopi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualisering av endogene Mitophagy komplekser in situ i Human bukspyttkjertelen beta Cells utnytte nærhet ligation analysen

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Robotic Lateral Pancreaticojejunostomy for Chronic Pancreatitis

Robotic lateral Pancreaticojejunostomy for kronisk pankreatitt

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Precision-Cut Leverskiver som en Ex Vivo-modell av leverbiologi

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

A Doxorubicin-Induced Murine Model of Dilated Cardiomyopathy In Vivo

En Doxorubicin-indusert murine modell av utvidet kardiomyopati In Vivo

Dilated cardiomyopathy (DCM) refers to a spectrum of heterogeneous myocardial disorders characterized by ventricular dilation and depressed cardiac ...