Name: stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window
Uploaded: 2021-05-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window at JoVE.com

Este estudo foi apoiado pela subvenção nº 14-2020-002 do Fundo de Pesquisa snubh e pela Bolsa da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo governo da Coreia (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).

Todos os procedimentos descritos neste artigo foram realizados de acordo com a8ª edição do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (2011)26 e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Avançado de Ciência e Tecnologia da Coreia (KAIST) e do Hospital Bundang da Universidade Nacional de Seul (SNUBH).
1. Preparação da janela e outros materiais
<ol><li>Design personalizado a janela de imagem intravital pancreá...

<ol>
	<li>Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+pancreatic+disease.">Imaging in pancreatic disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).</li><li>Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+imaging+the+normal+and+diseased+pancreas.">Technologies for imaging the normal and diseased pancreas.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li><li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pancreatic+diabetes+(type+3c+diabetes)+underdiagnosed+and+misdiagnosed.">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed.</a> Diabetes Care. 31, 165-169 (2008).</li><li>Baetens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+islet+cell+populations+in+spontaneously+diabetic+mice.">Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice.</a> Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).</li><li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+pancreas:+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology.">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).</li><li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology.">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li><li>Ravier, M. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+pancreatic+islets+for+ex+vivo+imaging+studies+with+trappable+or+recombinant+fluorescent+probes.">Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).</li><li>Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vivo+imaging+method+for+individual+islets+across+the+mouse+pancreas+reveals+a+heterogeneous+insulin+secretion+response+to+glucose.">Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose.</a> Science Reports. 11 (1), 603 (2021).</li><li>Lee, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+resveratrol+treatment+on+graft+revascularization+after+islet+transplantation+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice.">Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Islets. 10 (1), 25-39 (2018).</li><li>Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+islet+transplantation.">In vivo imaging of islet transplantation.</a> Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).</li><li>Mojibian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanted+islets+in+the+anterior+chamber+of+the+eye+are+prone+to+autoimmune+attack+in+a+mouse+model+of+diabetes.">Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147 (5), 983-991 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+revealed+at+single-stem-cell+level+by+in+vivo+live+imaging.">Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging.</a> Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).</li><li>Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas.">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), 1024405 (2015).</li><li>Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+pancreatic+imaging+window+for+stabilized+longitudinal+in+vivo+observation+of+pancreatic+islets+in+murine+model.">A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model.</a> Diabetes &amp; Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury.">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+a+pulmonary+endothelial+surface+layer+in+a+murine+sepsis+model.">Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model.</a> Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).</li><li>Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantitation+of+injected+circulating+tumor+cells+from+great+saphenous+vein+based+on+video-rate+confocal+microscopy.">In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).</li><li>Moon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+longitudinal+imaging+of+hepatic+lipid+droplet+accumulation+in+a+murine+model+for+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease.</a> Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).</li><li>Hwang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cellular-level+real-time+pharmacokinetic+imaging+of+free-form+and+liposomal+indocyanine+green+in+liver.">In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver.</a> Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).</li><li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li><li>Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+tumor-cell+line+(panc-1)+from+a+human+carcinoma+of+the+exocrine+pancreas.">Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas.</a> International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).</li><li>National Institutes of Health. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.+Committee+for+the+Update+of+the+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).</li><li>Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+anesthesia+dramatically+alters+the+oral+glucose+tolerance+and+insulin+secretion+in+C57Bl/6+mice.">Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice.</a> Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).</li><li>Kim, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orthotopic+and+heterotopic+human+pancreatic+cancer+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).</li><li>Cichocki, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK3+inhibition+drives+maturation+of+NK+cells+and+enhances+their+antitumor+activity.">GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity.</a> Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+C-peptide+storage+and+secretion+in+islet+beta-cells+in+vitro+and+in+vivo.">Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li><li>Reissaus, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile,+portable+intravital+microscopy+platform+for+studying+beta-cell+biology+in+vivo.">A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo.</a> Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).</li><li>Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+animal+models+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).</li><li>Bisht, S., Feldmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+modeling+pancreatic+cancer+and+novel+drug+discovery.">Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).</li><li>Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+pancreatic+cancer.">Mouse models of pancreatic cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).</li><li>Feig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreas+cancer+microenvironment.">The pancreas cancer microenvironment.</a> Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).</li><li>Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models+of+pancreatic+cancer:+overview+and+comparison+with+other+types+of+models.">Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models.</a> Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).</li></ol>

O protocolo descrito aqui consiste em imagens intravitais do pâncreas usando uma nova base de suporte integrada janela de imagem intravital pancreática modificada de uma janela de imagem abdominal. Entre os protocolos descritos acima, o primeiro passo crítico é a implantação da janela de imagem pancreática intravital no camundongo. Para a aplicação da cola na janela, é importante aplicar a cola entre a margem da janela e o vidro de cobertura, mas não no tecido pancreático, pois pode interromper significativam...

O pâncreas é um órgão abdominal com uma função exócrina no trato digestivo e uma função endócrina de secretar hormônios na corrente sanguínea. Imagens celulares de alta resolução do pâncreas podem revelar a fisiopatologia de várias doenças envolvendo o pâncreas, incluindo pancreatite, câncer de pâncreas e diabetes mellitus1. Ferramentas convencionais de diagnóstico por imagem, como tomografia computadorizada, resolução magnética e ultrassonografia estão amplamente disponíveis no campo clínico1,2. No entanto, essas modalidades de imagem estão restritas à visualização apenas de alterações estruturais ou anatômicas, enquanto alterações no nível celular ou molecular não podem ser determinadas. Dado que alterações moleculares no diabetes mellitus ou câncer de pâncreas em humanos podem iniciar mais de 10 anos antes do diagnóstico3,4, a detecção de doenças pancreáticas de sua transição molecular durante o período latente tem o potencial de fornecer um diagnóstico precoce e uma intervenção oportuna. Assim, imagens que superarão as limitações da resolução e fornecerão insights valiosos sobre a função ganharão notavelmente atenção, fornecendo diagnóstico precoce de câncer de pâncreas ou identificação avançada da alteração das ilhotas durante a progressão do diabetes mellitus5.
Em particular com as ilhotas, imagens nucleares, imagens de bioluminescência e tomografia de coerência óptica têm sido sugeridas como técnicas de imagem de ilhotas não invasivas6. No entanto, a resolução desses métodos é substancialmente baixa, com valores típicos que variam de várias dezenas a centenas de micrômetros, oferecendo uma capacidade limitada para detectar alterações no nível celular nas ilhotas. Por outro lado, foram realizados estudos anteriores de alta resolução de ilhotas sob ex vivo7,8 (por exemplo, fatiamento ou digestão do pâncreas), não fisiológico9 (por exemplo, exteriorização do pâncreas) e condições heterotópicas10,11,12 (por exemplo, implantação sob a cápsula renal, dentro do fígado, e na câmara anterior do olho), o que restringe sua interpretação e implicações clínicas. Se in vivo,modelo fisiológico e ortotópico de imagem de alta resolução pode ser estabelecido, será uma plataforma crítica para a investigação de ilhotas pancreáticas.
A imagem intravital, que revela a fisiopatologia em um nível de resolução microscópica em um animal vivo, recebeu recentemente grande atenção13. Dos métodos de imagem in vivo, o desenvolvimento de uma janela de imagem abdominal14, que implanta uma janela no abdômen de um camundongo, permitiu a descoberta de novos achados (ou seja, um estágio pré-micrometastase da metástase hepática precoce15 e mecanismo de manutenção de células-tronco no epitélio intestinal16). Embora a janela de imagem abdominal forneça resultados valiosos, as aplicações desta janela para o pâncreas e a pesquisa de imagem intravital resultante baseada em doenças envolvendo pâncreas, não foram amplamente investigadas.
Ao contrário das características bem definidas do órgão sólido do pâncreas humano, o pâncreas de um camundongo é uma estrutura difusamente distribuída de tecido mole17. Portanto, é incessantemente afetada por movimentos fisiológicos, incluindo peristalse e respiração. Um estudo anterior sobre a aplicação de uma janela de imagem abdominal para o pâncreas demonstrou que a erração ocorreu devido a artefatos de movimento induzidos pelos movimentos intestinais18. A desfoca severa foi observada na imagem média resultante, o que impediu a visualização e identificação das estruturas de microescala.
Aqui, descrevemos o uso de uma nova base de apoio integrada janela de imagem intravital pancreática combinada com microscopia intravital19,20 para investigar os eventos longitudinais de nível celular em doenças envolvendo o pâncreas. Além de uma descrição detalhada da metodologia no estudo anterior18,a aplicação estendida da janela de imagem pancreática para diversas doenças envolvendo o pâncreas será abordada neste artigo. Neste protocolo, um sistema de microscopia confocal de varredura a laser de velocidade de vídeo personalizado foi utilizado como um sistema de microscopia intravital. Quatro módulos laser (comprimentos de onda em 405, 488, 561 e 640 nm) foram utilizados como fonte de excitação, e quatro canais de sinais de emissão foram detectados por tubos fotomultiplier (PMT) através de filtros de bandpass (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). A varredura a laser consistia em um espelho poligonal rotativo (eixo X) e um espelho de varredura galvanômetro (eixo Y) que permitia a digitalização da taxa de vídeo (30 quadros por segundo). Informações detalhadas sobre microscopia intravital foram descritas nos estudos anteriores10,18,19,20,21,22,23.
Em nosso estudo anteriorde ilhotas 18,nós com sucesso e imagem as ilhotas em camundongos vivos usando um modelo de rato transgênico (MIP-GFP)24 em que as ilhotas foram marcadas com GFP. O método possibilitou a visualização de alta resolução das alterações nas ilhotas durante um período de 1 semana. Também facilitou a imagem das mesmas ilhotas por até 3 semanas, o que sugere a viabilidade de estudos de longo prazo das ilhotas pancreáticas para o rastreamento ou monitoramento funcional durante a patogênese do diabetes mellitus18. Além disso, desenvolvemos um modelo ortotópico de câncer de pâncreas no qual células cancerígenas pancreáticas fluorescentes (PANC-1 NucLight Red)25 foram implantadas diretamente no pâncreas do camundongo. Com a aplicação da janela de imagem intravital pancreática, este modelo poderia ser utilizado como uma plataforma para investigar a fisiopatologia celular e molecular no microambiente tumoral do câncer de pâncreas e para o monitoramento terapêutico de novos candidatos a medicamentos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Fluorescent probe for conjugate with antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic polyethylene tubing</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>427401</td>
			<td>PE10 catheter for connection with needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>C57BL/6N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circular</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111520</td>
			<td>Cover glass for pancreatic imaging window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Dextran 2MDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>FD200S</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS 8.1</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Microscopy</td>
			<td>IVIM tech</td>
			<td>IVM-C</td>
			<td>Intravital Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>S-1107-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 401</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>401</td>
			<td>N-butyl cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle holder</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>H-1126-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro rectractor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>17004-03</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1034</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIP-GFP</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>006864</td>
			<td>B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon 4-0</td>
			<td>AILEE</td>
			<td>NB434</td>
			<td>Non-Absorbable Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican N 100 30G</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>FT9172220S</td>
			<td>For Vascular Catheter, Use only Needle part</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 NucLightRed</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Made in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatic imaging window</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Pancreatic imaging window - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiosuite</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>PS-02</td>
			<td>Homeothermic temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553708</td>
			<td>Antibody for in vivo vessel labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1090-3</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMR Dextran 65-85kDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>T1162</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window holder</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Window holder - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 100</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window

A imagem direta de resolução celular in vivo do pâncreas em um modelo animal pequeno vivo tem sido tecnicamente desafiadora. Um estudo recente de imagem intravital, com uma janela de imagem abdominal, possibilitou a visualização da dinâmica celular em órgãos abdominais in vivo. No entanto, devido à arquitetura macia do pâncreas do mouse que pode ser facilmente influenciada pelo movimento fisiológico (por exemplo, peristalse e respiração), foi difícil realizar imagens longitudinais estabilizadas ao longo de várias semanas no nível celular para identificar, rastrear e quantificar ilhotas ou células cancerígenas no pâncreas do rato. Aqui, descrevemos um método para implantar uma nova base de suporte, uma janela de imagem intravital pancreática integrada, que pode separar espacialmente o pâncreas do intestino para imagens intravitais longitudinal do pâncreas microestrutura. A imagem longitudinal in vivo com a janela de imagem permite a visualização estável, permitindo o rastreamento de ilhotas durante um período de 3 semanas e imagens tridimensionais de alta resolução da microestrutura, como evidenciado aqui em um modelo de câncer pancreático ortotópico. Com nosso método, novos estudos de imagem intravital podem elucidar a fisiopatologia de várias doenças envolvendo o pâncreas a nível celular.

A microscopia intravital combinada com a janela de imagem intravital pancreática integrada da base de suporte permite imagens longitudinal do nível celular do pâncreas em um rato. Este protocolo com a janela de imagem intravital pancreática fornece estabilidade tecidual de longo prazo que permite a aquisição de imagens de alta resolução para rastrear ilhotas individuais por até 3 semanas. Como resultado, imagens de mosaico para um campo de visão estendido, reconstrução tridimensional (3D) de imagens de pilha ...

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Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

A imagem in vivo de alta resolução do pâncreas foi facilitada com a janela de imagem intravital pancreática.

Visualização de nível celular longitudinal estabilizada do pâncreas em um modelo murino com uma janela de imagem intravital pancreática

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Este protocolo descreve imagens in vivo estabilizadas e repetitivas do pâncreas com uma nova janela de imagem intravital pancreática. A principal vantagem desta técnica é que é possível realizar imagens tridimensionais imóveis com resolução até o nível celular ao longo de três semanas no pâncreas de um rato vivo. Comece preparando a plataforma cirúrgica e desinfetando as superfícies com 70% de etanol.Após a anestesia, use uma sonda retal com uma almofada de aquecimento controlada por homeotermica para monitorar a temperatura corporal. Remova o cabelo do flanco esquerdo do mouse e aplique álcool e iodo alternativamente, girando do local da incisão para a superfície externa, nunca mais voltando ao local da incisão e terminando com iodo. Em seguida, faça uma incisão de 1,5 centímetros no flanco esquerdo do rato, dissecando a pele e o músculo.Use uma sutura 4-0 preta ou nylon para realizar uma sutura de corda de bolsa na margem de incisão. Puxe o baço cuidadosamente com fórceps do anel e identifique o pâncreas. Colocando a janela no flanco do mouse, passe o baço e o pâncreas pelo espaço aberto da janela.Em seguida, coloque suavemente o pâncreas na placa da janela de imagem enquanto coloca o baço no espaço aberto da janela. Injete panc-1 nuclite vermelho diretamente no pâncreas. Use uma agulha de cateter de calibre 31 para aplicar gotas de cola cianoacrilato n-Butyl à margem da janela de imagem, garantindo a aplicação de uma quantidade mínima de cola.Aplique suavemente um vidro redondo de cobertura de 12 milímetros à margem da janela de imagem. Em seguida, segure o laço de sutura para caber no sulco lateral da janela e amarrá-lo três vezes. Finalmente, para evitar a interrupção desses pontos apertados quando os ratos estiverem acordados, corte o local máximo proximal da gravata.Comece ligando o microscópio intravital, incluindo a potência do laser. Para inserir um cateter vascular, aplique pressão no lado proximal da cauda com o índice e o terceiro dedo. Se necessário, aqueça a cauda com uma lâmpada.Desinfete a veia traseira com um spray de 70% de etanol, em seguida, insira um cateter de calibre 30 na veia traseira lateral e visualize a regurgitação de sangue no tubo PE-10. Aplique fita de seda no cateter para estabilizá-la. Injete fitc dextran e dextran TMR, ou outras sondas fluorescentes conforme apropriado, de acordo com a combinação de sondas fluorescentes.Insira uma sonda retal para controlar automaticamente a temperatura corporal com um sistema de almofada de aquecimento homeotémico. Em seguida, insira a janela de imagem pancreática preparada durante a configuração da microscopia intravital no suporte da janela. Transfira o mouse da plataforma cirúrgica para o estágio de imagem.Para realizar imagens intravitais, comece com a imagem do pâncreas em uma baixa ampliação, como quatro vezes, para escanear toda a visão do pâncreas na janela de imagem pancreática. Uma vez determinada a região de interesse, mude para uma lente objetiva de ampliação mais alta, como 20 vezes ou 40 vezes, para realizar imagens de nível celular com resolução lateral e axial aproximadamente 0,5 micrômetros e 3 micrômetros, respectivamente. Execute imagens de pilha Z ou time-lapse para observar a estrutura 3D ou dinâmicas de nível celular, como migração celular.A microscopia intravital combinada com a janela de imagem intravital pancreática fornece estabilidade tecidual de longo prazo que permite a aquisição de imagens de alta resolução para rastrear ilhotas individuais por até três semanas. A janela implantada em um mouse C57 preto 6 N com anticorpo anti-CD31 injetado por via intravenosa, conjugado com um fluoróforo Alexa 647, facilitou imagens de ampla área e imagens 3D ampliadas do pâncreas. As células acinar foram identificadas nas imagens médias do tecido pancreático na vasculatura adjacente, visualizadas com autofluorescência e anticorpo anti-CD31, respectivamente.Usando o método de imagem de mosaico, que combina uma visão de campo largo com imagens de alta resolução, aproximadamente 40 a 50 ilhotas com a vasculatura adjacente foram visualizadas em um mouse MIP-GFP. Um estudo anterior mostrou que as ilhotas podem ser rastreadas por até três semanas usando este método de imagem estável. Para visualizar as células cancerígenas, as células vermelhas nuclites PANC-1 foram implantadas diretamente no pâncreas do rato durante a cirurgia e os vasos próximos foram manchados com anti-CD31 conjugado com Alexa 647.Usando este protocolo, foram geradas imagens de campo amplo do câncer de pâncreas. Isso ajudou a delinear a margem do tumor, bem como alcançar imagens 3D de alta resolução no nível de célula única. O passo mais crítico neste método é a implantação hábil da janela de imagem pancreática no mouse.Usando outras combinações das células fluorescentes do rato, e sondas de anticorpos, a interação dinâmica de células próximas com ilhotas ou células de cancelamento poderia ser identificada. Este método pode ser amplamente aplicado por aqueles que exploram a mudança da ilhota em várias condições fisiopatológicas e microambientais do câncer de pâncreas in situ.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Imagem Glioma Iniciação<em&gt; Em Vivo</em&gt; Através de um polido e reforçado Janela crânio-Thin craniana

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

Medicina

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Um modelo murino de implante de stent na artéria carótida para o Estudo da reestenose

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplante para a câmara anterior do olho para longitudinal, não-invasivo<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging com uma única célula de resolução em tempo real

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rosa Bengala Fototrombose por imageamento óptico confocal<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um Modelo de curso Veículo Individual

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagens do Cerebrovasculature: Relevância para doenças do SNC

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Visualização Quantitativa de Infiltrado de Leucócitos em um Modelo Murino de Miocardite Fulminante por Microscopia de Folha de Luz

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualização de complexos de Mitophagy endógenos in situ em células beta pancreáticas humanas utilizando o ensaio de ligadura de proximidade

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Robotic Lateral Pancreaticojejunostomy for Chronic Pancreatitis

Pancreaticojejuntomia lateral robótica para pancreatite crônica

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Precision-Cut Liver Slices como um modelo ex vivo de biologia hepática

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

A Doxorubicin-Induced Murine Model of Dilated Cardiomyopathy In Vivo

Um modelo de murina induzida por doxorubicina de cardiomiopatia dilatada em Vivo

Dilated cardiomyopathy (DCM) refers to a spectrum of heterogeneous myocardial disorders characterized by ventricular dilation and depressed cardiac ...