Name: stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window
Uploaded: 2021-05-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window at JoVE.com

Este estudio fue apoyado por la subvención No. 14-2020-002 del Fondo de Investigación SNUBH y por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).

Todos los procedimientos descritos en este documento se llevaron a cabo de acuerdo con la8ª edición de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (2011)26 y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Instituto Avanzado de Ciencia y Tecnología de Corea (KAIST) y el Hospital Bundang de la Universidad Nacional de Seúl (SNUBH).
1. Preparación de la ventana y otros materiales
<ol><li>Diseño personalizado de la ...

<ol>
	<li>Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+pancreatic+disease.">Imaging in pancreatic disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).</li><li>Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+imaging+the+normal+and+diseased+pancreas.">Technologies for imaging the normal and diseased pancreas.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li><li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pancreatic+diabetes+(type+3c+diabetes)+underdiagnosed+and+misdiagnosed.">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed.</a> Diabetes Care. 31, 165-169 (2008).</li><li>Baetens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+islet+cell+populations+in+spontaneously+diabetic+mice.">Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice.</a> Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).</li><li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+pancreas:+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology.">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).</li><li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology.">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li><li>Ravier, M. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+pancreatic+islets+for+ex+vivo+imaging+studies+with+trappable+or+recombinant+fluorescent+probes.">Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).</li><li>Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vivo+imaging+method+for+individual+islets+across+the+mouse+pancreas+reveals+a+heterogeneous+insulin+secretion+response+to+glucose.">Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose.</a> Science Reports. 11 (1), 603 (2021).</li><li>Lee, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+resveratrol+treatment+on+graft+revascularization+after+islet+transplantation+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice.">Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Islets. 10 (1), 25-39 (2018).</li><li>Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+islet+transplantation.">In vivo imaging of islet transplantation.</a> Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).</li><li>Mojibian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanted+islets+in+the+anterior+chamber+of+the+eye+are+prone+to+autoimmune+attack+in+a+mouse+model+of+diabetes.">Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147 (5), 983-991 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+revealed+at+single-stem-cell+level+by+in+vivo+live+imaging.">Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging.</a> Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).</li><li>Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas.">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), 1024405 (2015).</li><li>Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+pancreatic+imaging+window+for+stabilized+longitudinal+in+vivo+observation+of+pancreatic+islets+in+murine+model.">A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model.</a> Diabetes &amp; Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury.">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+a+pulmonary+endothelial+surface+layer+in+a+murine+sepsis+model.">Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model.</a> Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).</li><li>Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantitation+of+injected+circulating+tumor+cells+from+great+saphenous+vein+based+on+video-rate+confocal+microscopy.">In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).</li><li>Moon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+longitudinal+imaging+of+hepatic+lipid+droplet+accumulation+in+a+murine+model+for+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease.</a> Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).</li><li>Hwang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cellular-level+real-time+pharmacokinetic+imaging+of+free-form+and+liposomal+indocyanine+green+in+liver.">In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver.</a> Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).</li><li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li><li>Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+tumor-cell+line+(panc-1)+from+a+human+carcinoma+of+the+exocrine+pancreas.">Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas.</a> International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).</li><li>National Institutes of Health. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.+Committee+for+the+Update+of+the+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).</li><li>Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+anesthesia+dramatically+alters+the+oral+glucose+tolerance+and+insulin+secretion+in+C57Bl/6+mice.">Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice.</a> Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).</li><li>Kim, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orthotopic+and+heterotopic+human+pancreatic+cancer+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).</li><li>Cichocki, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK3+inhibition+drives+maturation+of+NK+cells+and+enhances+their+antitumor+activity.">GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity.</a> Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+C-peptide+storage+and+secretion+in+islet+beta-cells+in+vitro+and+in+vivo.">Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li><li>Reissaus, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile,+portable+intravital+microscopy+platform+for+studying+beta-cell+biology+in+vivo.">A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo.</a> Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).</li><li>Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+animal+models+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).</li><li>Bisht, S., Feldmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+modeling+pancreatic+cancer+and+novel+drug+discovery.">Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).</li><li>Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+pancreatic+cancer.">Mouse models of pancreatic cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).</li><li>Feig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreas+cancer+microenvironment.">The pancreas cancer microenvironment.</a> Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).</li><li>Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models+of+pancreatic+cancer:+overview+and+comparison+with+other+types+of+models.">Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models.</a> Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).</li></ol>

El protocolo descrito aquí consiste en imágenes intravitales del páncreas utilizando una nueva base de soporte integrada en la ventana de imágenes intravitales pancreáticas modificada desde una ventana de imágenes abdominales. Entre los protocolos descritos anteriormente, el primer paso crítico es la implantación de la ventana de imágenes pancreáticas intravitales en el ratón. Para la aplicación del pegamento en la ventana, es importante aplicar el pegamento entre el margen de la ventana y el vidrio de la cub...

El páncreas es un órgano abdominal con una función exocrina en el tracto digestivo y una función endocrina de secretar hormonas en el torrente sanguíneo. Las imágenes celulares de alta resolución del páncreas podrían revelar la fisiopatología de diversas enfermedades que involucran el páncreas, incluida la pancreatitis, el cáncer de páncreas y la diabetes mellitus1. Las herramientas de diagnóstico por imágenes convencionales, como la tomografía computarizada, las imágenes de resolución magnética y la ecografía, están ampliamente disponibles en el campo clínico1,2. Sin embargo, estas modalidades de imagen se limitan a visualizar solo cambios estructurales o anatómicos, mientras que las alteraciones a nivel celular o molecular no se pueden determinar. Dado que los cambios moleculares en la diabetes mellitus o el cáncer de páncreas en humanos pueden iniciarse más de 10 años antes del diagnóstico3,4,la detección de enfermedades pancreáticas a partir de su transición molecular durante el período latente tiene el potencial de proporcionar un diagnóstico temprano y una intervención oportuna. Por lo tanto, las imágenes que superarán las limitaciones de resolución y proporcionarán información valiosa sobre la función ganarán notablemente atención al proporcionar un diagnóstico temprano del cáncer de páncreas o la identificación avanzada de la alteración de los islotes durante la progresión de la diabetes mellitus5.
En particular con los islotes, la imagen nuclear, la imagen de bioluminiscencia y la tomografía de coherencia óptica se han sugerido como técnicas no invasivas de imagen de islotes6. Sin embargo, la resolución de estos métodos es sustancialmente baja, con valores típicos que van desde varias decenas hasta cientos de micrómetros, ofreciendo una capacidad limitada para detectar cambios a nivel celular en los islotes. Por otro lado, se realizaron estudios previos de alta resolución de islotes bajo condiciones ex vivo7,8 (por ejemplo, corte o digestión del páncreas), nofisiológicas 9 (por ejemplo, exteriorización del páncreas) y heterotópicas10,11,12 (por ejemplo, implantación debajo de la cápsula renal, dentro del hígado y en la cámara anterior del ojo), lo que restringe su interpretación e implicaciones clínicas. Si se puede establecer un modelo in vivo,fisiológico y ortotópico de imágenes de alta resolución, será una plataforma crítica para la investigación de los islotes pancreáticos.
Las imágenes intravitales, que revelan la fisiopatología a un nivel de resolución microscópica en un animal vivo, han recibido recientemente gran atención13. De los métodos de imagen in vivo, el desarrollo de una ventana de imagen abdominal14,que implanta una ventana en el abdomen de un ratón, ha permitido el descubrimiento de nuevos hallazgos (es decir, una etapa de pre-micrometástasis de metástasis hepática temprana15 y mecanismo de mantenimiento de células madre en el epitelio intestinal16). Aunque la ventana de imágenes abdominales proporciona resultados valiosos, las aplicaciones de esta ventana para el páncreas y la investigación de imágenes intravitales resultante basada en enfermedades que involucran el páncreas, no se han investigado ampliamente.
A diferencia de las características bien definidas de los órganos sólidos del páncreas humano, el páncreas de un ratón es una estructura similar a un tejido blando distribuida difusamente17. Por lo tanto, se ve afectado incesantemente por movimientos fisiológicos que incluyen peristalsis y respiración. Un estudio previo sobre la aplicación de una ventana de imagen abdominal para el páncreas demostró que la deambulación se produjo debido a artefactos de movimiento inducidos por los movimientos intestinales18. Se observó un desenfoque severo en la imagen promediada resultante, lo que impidió la visualización e identificación de las estructuras a microescala.
Aquí, describimos el uso de una nueva base de soporte integrada en la ventana de imágenes intravitales pancreáticas combinada con microscopía intravital19,20 para investigar los eventos a nivel celular longitudinal en enfermedades que involucran el páncreas. Además de una descripción detallada de la metodología en el estudio anterior18,en este trabajo se abordará la aplicación extendida de la ventana de imágenes pancreáticas para diversas enfermedades que involucran el páncreas. En este protocolo, se utilizó un sistema de microscopía confocal de escaneo láser de velocidad de video personalizado como un sistema de microscopía intravital. Se utilizaron cuatro módulos láser (longitudes de onda a 405, 488, 561 y 640 nm) como fuente de excitación, y se detectaron cuatro canales de señales de emisión mediante tubos fotomultiplicadores (PMT) a través de filtros de paso de banda (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). El escaneo láser consistió en un espejo poligonal giratorio (eje X) y un espejo de escaneo galvanómetro (eje Y) que permitió el escaneo de velocidad de video (30 cuadros por segundo). La información detallada sobre la microscopía intravital ha sido descrita en los estudios previos10,18,19,20,21,22,23.
En nuestro estudio anterior de islotes18,tomamos imágenes exitosas y estables de los islotes en ratones vivos utilizando un modelo de ratón transgénico (MIP-GFP)24 en el que los islotes fueron etiquetados con GFP. El método permitió la visualización de alta resolución de los cambios en los islotes durante un período de 1 semana. También facilitó la obtención de imágenes de los mismos islotes durante un máximo de 3 semanas, lo que sugiere la viabilidad de estudios a largo plazo de los islotes pancreáticos para el seguimiento o monitoreo funcional durante la patogénesis de la diabetes mellitus18. Además, desarrollamos un modelo de cáncer de páncreas ortotópico en el que las células fluorescentes de cáncer de páncreas (PANC-1 NucLight Red)25 se implantaron directamente en el páncreas del ratón. Con la aplicación de la ventana de imágenes intravitales pancreáticas, este modelo podría utilizarse como una plataforma para investigar la fisiopatología celular y molecular en el microambiente tumoral del cáncer de páncreas y para el monitoreo terapéutico de nuevos candidatos a fármacos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Fluorescent probe for conjugate with antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic polyethylene tubing</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>427401</td>
			<td>PE10 catheter for connection with needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>C57BL/6N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circular</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111520</td>
			<td>Cover glass for pancreatic imaging window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Dextran 2MDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>FD200S</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS 8.1</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Microscopy</td>
			<td>IVIM tech</td>
			<td>IVM-C</td>
			<td>Intravital Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>S-1107-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 401</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>401</td>
			<td>N-butyl cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle holder</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>H-1126-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro rectractor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>17004-03</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1034</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIP-GFP</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>006864</td>
			<td>B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon 4-0</td>
			<td>AILEE</td>
			<td>NB434</td>
			<td>Non-Absorbable Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican N 100 30G</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>FT9172220S</td>
			<td>For Vascular Catheter, Use only Needle part</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 NucLightRed</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Made in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatic imaging window</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Pancreatic imaging window - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiosuite</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>PS-02</td>
			<td>Homeothermic temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553708</td>
			<td>Antibody for in vivo vessel labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1090-3</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMR Dextran 65-85kDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>T1162</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window holder</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Window holder - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 100</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window

Las imágenes directas de resolución celular in vivo del páncreas en un modelo de animal pequeño vivo han sido técnicamente desafiantes. Un reciente estudio de imagen intravital, con una ventana de imagen abdominal, permitió la visualización de la dinámica celular en los órganos abdominales in vivo. Sin embargo, debido a la arquitectura blanda en forma de lámina del páncreas del ratón que puede ser fácilmente influenciada por el movimiento fisiológico (por ejemplo, peristalsis y respiración), fue difícil realizar imágenes longitudinales estabilizadas in vivo durante varias semanas a nivel celular para identificar, rastrear y cuantificar islotes o células cancerosas en el páncreas del ratón. Aquí, describimos un método para implantar una nueva base de soporte, una ventana de imágenes intravitales pancreáticas integradas, que puede separar espacialmente el páncreas del intestino para obtener imágenes intravitales longitudinales de lapso de tiempo de la microestructura del páncreas. La obtención de imágenes longitudinales in vivo con la ventana de imágenes permite una visualización estable, lo que permite el seguimiento de los islotes durante un período de 3 semanas y la obtención de imágenes tridimensionales de alta resolución de la microestructura, como se evidencia aquí en un modelo de cáncer de páncreas ortotópico. Con nuestro método, otros estudios de imágenes intravitales pueden dilucidar la fisiopatología de diversas enfermedades que involucran el páncreas a nivel celular.

La microscopía intravital combinada con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas integradas en la base de soporte permite obtener imágenes longitudinales a nivel celular del páncreas en un ratón. Este protocolo con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas proporciona estabilidad tisular a largo plazo que permite la adquisición de imágenes de alta resolución para rastrear islotes individuales durante un máximo de 3 semanas. Como resultado, se pueden lograr imágenes de mosaico para un campo de ...

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Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Las imágenes in vivo de alta resolución del páncreas se facilitaron con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas.

Visualización longitudinal estabilizada a nivel celular in vivo del páncreas en un modelo murino con una ventana de imágenes intravitales pancreáticas

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Este protocolo describe imágenes in vivo estabilizadas y repetitivas a nivel celular del páncreas con una nueva ventana de imágenes intravitales pancreáticas. La principal ventaja de esta técnica es que es posible realizar imágenes tridimensionales inmóviles con resolución hasta el nivel celular durante tres semanas en el páncreas de un ratón vivo. Comience por preparar la plataforma quirúrgica y desinfectar las superficies con etanol al 70%.Después de la anestesia, use una sonda rectal con una almohadilla térmica homeotérmica controlada para controlar la temperatura corporal. Retire el vello del flanco izquierdo del ratón y aplique alcohol y yodo alternativamente, girando desde el sitio de la incisión hasta la superficie externa, nunca volviendo al sitio de la incisión y terminando con yodo. Luego, haga una incisión de 1,5 centímetros en el flanco izquierdo del ratón, diseccionando la piel y el músculo.Use una sutura negra o de nylon 4-0 para realizar una sutura de cuerda de bolso en el margen de la incisión. Tire del bazo con cuidado con las pórceps anulares e identifique el páncreas. Colocando la ventana en el flanco del ratón, pase el bazo y el páncreas a través del espacio abierto de la ventana.Luego, coloque suavemente el páncreas en la placa de la ventana de imágenes mientras coloca el bazo en el espacio abierto de la ventana. Inyecte PANC-1 nuclite rojo directamente en el páncreas. Use una aguja de catéter de calibre 31 para aplicar gotas de pegamento de cianoacrilato de n-butilo en el margen de la ventana de imágenes, asegurando que se aplique una cantidad mínima de pegamento.Aplique suavemente un vidrio de cubierta redonda de 12 milímetros en el margen de la ventana de imágenes. Luego, sostenga el lazo de sutura para que quepa en la ranura lateral de la ventana y átelo tres veces. Finalmente, para evitar la interrupción de estos puntos apretados cuando los ratones están despiertos, corte el sitio proximal máximo de la corbata.Comience encendiendo el microscopio intravital, incluida la potencia del láser. Para insertar un catéter vascular, aplique presión en el lado proximal de la cola con el dedo índice y el tercero. Si es necesario, caliente la cola con una lámpara.Desinfecte la vena de la cola con un aerosol de etanol al 70%, luego inserte un catéter de calibre 30 en la vena lateral de la cola y visualice la regurgitación de sangre en el tubo DE PE-10. Aplique cinta de seda en el catéter para estabilizarlo. Inyecte dextrano FITC y dextrano TMR, u otras sondas fluorescentes según corresponda, de acuerdo con la combinación de sondas fluorescentes.Inserte una sonda rectal para controlar automáticamente la temperatura corporal con un sistema de almohadilla térmica homeotérmica. Luego, inserte la ventana de imágenes pancreáticas preparada durante la configuración de la microscopía intravital en el soporte de la ventana. Transfiera el ratón de la plataforma quirúrgica a la etapa de imagen.Para realizar imágenes intravitales, comience con imágenes del páncreas a un aumento bajo, como cuatro veces, para escanear toda la vista del páncreas en la ventana de imágenes pancreáticas. Una vez que se haya determinado la región de interés, cambie a una lente de objetivo de aumento más alto, como 20 veces o 40 veces, para realizar imágenes a nivel celular con resolución lateral y axial de aproximadamente 0,5 micrómetros y 3 micrómetros respectivamente. Realice imágenes de pila Z o de lapso de tiempo para observar la estructura 3D o la dinámica a nivel celular, como la migración celular.La microscopía intravital combinada con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas proporciona estabilidad tisular a largo plazo que permite la adquisición de imágenes de alta resolución para rastrear islotes individuales durante un máximo de tres semanas. La ventana implantada en un ratón C57 negro 6 N con anticuerpo anti-CD31 inyectado por vía intravenosa, conjugado con un fluoróforo Alexa 647, facilitó la obtención de imágenes de área amplia y magnificó las imágenes 3D del páncreas. Las células acinares se identificaron en las imágenes promediadas de tejido pancreático en la vasculatura adyacente, visualizadas utilizando autofluorescencia y anticuerpo anti-CD31 respectivamente.Utilizando el método de imágenes en mosaico, que combina una vista de campo amplio con imágenes de alta resolución, se visualizaron aproximadamente de 40 a 50 islotes con la vasculatura adyacente en un ratón MIP-GFP. Un estudio anterior mostró que los islotes se pueden rastrear durante hasta tres semanas utilizando este método de imagen estable. Para visualizar las células cancerosas, los glóbulos rojos de nuclita PANC-1 se implantaron directamente en el páncreas del ratón durante la cirugía y los vasos cercanos se tiñeron con anti-CD31 conjugado con Alexa 647.Usando este protocolo, se generaron imágenes de campo amplio de cáncer de páncreas. Esto ayudó a delinear el margen del tumor, así como a lograr imágenes 3D de alta resolución a nivel de una sola célula. El paso más crítico en este método es la hábil implantación de la ventana de imágenes pancreáticas en el ratón.Usando otras combinaciones de células de ratón fluorescentes y sondas de anticuerpos, se pudo identificar la interacción dinámica de las células cercanas con los islotes o las células de cancelación. Este método puede ser ampliamente aplicado por aquellos que exploran el cambio del islote en diversas condiciones fisiopatológicas y microambientes del cáncer de páncreas in situ.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Imágenes Glioma Iniciación<em&gt; En Vivo</em&gt; A través de un pulido y reforzado fina calavera ventana craneal

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

Investigación

Medicina

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Un modelo murino de la implantación de un stent en la arteria carótida para el Estudio de la reestenosis

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Trasplante en la cámara anterior del ojo para Longitudinal, no invasiva<em&gt; En vivo</em&gt; Imagen con una sola célula de resolución en tiempo real

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rosa de Bengala Photothrombosis por imagen óptica confocal<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un modelo de solo recipiente Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Obtención de imágenes de la vasculatura cerebral: Importancia de las enfermedades del sistema nervioso central

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Visualización Cuantitativa del Infiltrado de Leucocitos en un Modelo Murino de Miocarditis Fulminante por Microscopía de Hoja Ligera

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualización de complejos endógenos de mitophagy in Situ en células beta pancreáticas humanas que utilizan el ensayo de ligadura de proximidad

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Robotic Lateral Pancreaticojejunostomy for Chronic Pancreatitis

Pancreaticojejunostomía lateral robótica para la pancreatitis crónica

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Rebanadas de hígado cortadas con precisión de la murino como modelo Ex Vivo de biología hepática

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

A Doxorubicin-Induced Murine Model of Dilated Cardiomyopathy In Vivo

Un modelo murino inducido por doxorrubicina de miocardiopatía dilatada in vivo

Dilated cardiomyopathy (DCM) refers to a spectrum of heterogeneous myocardial disorders characterized by ventricular dilation and depressed cardiac ...