Name: stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window
Uploaded: 2021-05-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window at JoVE.com

Denna studie stöddes av bidrag nr 14–2020–002 från SNUBH:s forskningsfond och av det nationella forskningsstiftelse i Korea (NRF) som finansierades av Koreas regering (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).

Alla procedurer som beskrivs i detta dokument utfördes i enlighetmed den åttonde utgåvan av Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (2011)26 och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) och Seoul National University Bundang Hospital (SNUBH).
1. Förberedelse av fönstret och andra material
<ol><li>Specialdesigna bukspottskörteln intravital imaging fönster för att ...

<ol>
	<li>Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+pancreatic+disease.">Imaging in pancreatic disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).</li><li>Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+imaging+the+normal+and+diseased+pancreas.">Technologies for imaging the normal and diseased pancreas.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li><li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pancreatic+diabetes+(type+3c+diabetes)+underdiagnosed+and+misdiagnosed.">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed.</a> Diabetes Care. 31, 165-169 (2008).</li><li>Baetens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+islet+cell+populations+in+spontaneously+diabetic+mice.">Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice.</a> Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).</li><li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+pancreas:+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology.">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).</li><li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology.">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li><li>Ravier, M. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+pancreatic+islets+for+ex+vivo+imaging+studies+with+trappable+or+recombinant+fluorescent+probes.">Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).</li><li>Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vivo+imaging+method+for+individual+islets+across+the+mouse+pancreas+reveals+a+heterogeneous+insulin+secretion+response+to+glucose.">Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose.</a> Science Reports. 11 (1), 603 (2021).</li><li>Lee, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+resveratrol+treatment+on+graft+revascularization+after+islet+transplantation+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice.">Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Islets. 10 (1), 25-39 (2018).</li><li>Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+islet+transplantation.">In vivo imaging of islet transplantation.</a> Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).</li><li>Mojibian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanted+islets+in+the+anterior+chamber+of+the+eye+are+prone+to+autoimmune+attack+in+a+mouse+model+of+diabetes.">Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147 (5), 983-991 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+revealed+at+single-stem-cell+level+by+in+vivo+live+imaging.">Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging.</a> Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).</li><li>Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas.">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), 1024405 (2015).</li><li>Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+pancreatic+imaging+window+for+stabilized+longitudinal+in+vivo+observation+of+pancreatic+islets+in+murine+model.">A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model.</a> Diabetes &amp; Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury.">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+a+pulmonary+endothelial+surface+layer+in+a+murine+sepsis+model.">Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model.</a> Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).</li><li>Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantitation+of+injected+circulating+tumor+cells+from+great+saphenous+vein+based+on+video-rate+confocal+microscopy.">In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).</li><li>Moon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+longitudinal+imaging+of+hepatic+lipid+droplet+accumulation+in+a+murine+model+for+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease.</a> Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).</li><li>Hwang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cellular-level+real-time+pharmacokinetic+imaging+of+free-form+and+liposomal+indocyanine+green+in+liver.">In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver.</a> Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).</li><li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li><li>Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+tumor-cell+line+(panc-1)+from+a+human+carcinoma+of+the+exocrine+pancreas.">Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas.</a> International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).</li><li>National Institutes of Health. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.+Committee+for+the+Update+of+the+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).</li><li>Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+anesthesia+dramatically+alters+the+oral+glucose+tolerance+and+insulin+secretion+in+C57Bl/6+mice.">Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice.</a> Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).</li><li>Kim, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orthotopic+and+heterotopic+human+pancreatic+cancer+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).</li><li>Cichocki, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK3+inhibition+drives+maturation+of+NK+cells+and+enhances+their+antitumor+activity.">GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity.</a> Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+C-peptide+storage+and+secretion+in+islet+beta-cells+in+vitro+and+in+vivo.">Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li><li>Reissaus, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile,+portable+intravital+microscopy+platform+for+studying+beta-cell+biology+in+vivo.">A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo.</a> Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).</li><li>Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+animal+models+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).</li><li>Bisht, S., Feldmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+modeling+pancreatic+cancer+and+novel+drug+discovery.">Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).</li><li>Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+pancreatic+cancer.">Mouse models of pancreatic cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).</li><li>Feig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreas+cancer+microenvironment.">The pancreas cancer microenvironment.</a> Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).</li><li>Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models+of+pancreatic+cancer:+overview+and+comparison+with+other+types+of+models.">Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models.</a> Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).</li></ol>

Protokollet som beskrivs här består av intravital imaging av bukspottkörteln med hjälp av en ny stödjande bas integrerad bukspottskörteln intravital imaging fönster ändras från en buken imaging fönster. Bland de protokoll som beskrivs ovan är det första kritiska steget implantationen av det intravitala bukspottskörteln imaging fönstret i musen. För applicering av limet i fönstret är det viktigt att applicera limet mellan fönstrets marginal och täckglaset, men inte på bukspottskörtelvävnaden, efterso...

Bukspottkörteln är ett bukorgan med exokrin funktion i mag-tarmkanalen och en endokrin funktion av att utsöndra hormoner i blodomloppet. Högupplöst cellulär avbildning av bukspottkörteln kan avslöja patofysiologi av olika sjukdomar som omfattar bukspottkörteln, inklusive bukspottkörtelinflammation, bukspottskörtelcancer och diabetes mellitus1. Konventionella diagnostiska bildverktyg som datortomografi, magnetisk upplösning imaging och ultrasonography är allmänt tillgängliga inom det kliniska området1,2. Dessa bildframställningsmetoder är dock begränsade till att visualisera endast strukturella eller anatomiska förändringar, medan förändringar på cellulär eller molekylär nivå inte kan bestämmas. Med tanke på att molekylära förändringar i diabetes mellitus eller bukspottskörtelcancer hos människor kan initiera mer än 10 år före diagnosen3,4, har upptäckten av bukspottskörtelsjukdomar från deras molekylära övergång under den latenta perioden potential att ge en tidig diagnos och en snabb intervention. Således kommer avbildning som kommer att övervinna upplösningsbegränsningarna och ge värdefulla insikter i funktionen anmärkningsvärt få uppmärksamhet genom att ge tidig diagnos av bukspottskörtelcancer eller avancerad identifiering av förändringen av holmarna under utvecklingen av diabetes mellitus5.
Särskilt med holmar, kärnavbildning, bioluminescens imaging och optisk koherens tomografi har föreslagits som icke-invasiva holme imaging tekniker6. Upplösningen av dessa metoder är dock betydligt låg, med typiska värden som sträcker sig från flera tiotals till hundratals mikrometer, vilket ger en begränsad förmåga att upptäcka förändringar på cellnivå på holmarna. Å andra sidan utfördes tidigare högupplösta studier av holmar under ex vivo7,8 (t.ex. skivning eller matsmältning av bukspottkörteln), icke-fysiologiska9 (t.ex. utmattning av bukspottkörteln) och heterotopiskatillstånd 10,11,12 (t.ex. implantation under njurkapseln, inuti levern och i ögats främre kammare), vilket begränsar deras tolkning och kliniska konsekvenser. Om in vivo,fysiologisk och ortopisk modell av högupplöst bildbehandling kan fastställas, kommer det att vara en kritisk plattform för undersökning av bukspottskörtel holmar.
Intravital imaging, som avslöjar patofysiologin på mikroskopisk upplösningsnivå i ett levande djur, har nyligen fått stor uppmärksamhet13. Av in vivo-avbildningsmetoderna har utvecklingen av ett bukavbildningsfönster14, som implanterar ett fönster i musens buk, tillåtit upptäckten av nya fynd (dvs. ett pre-mikrometastasstadium av tidig levermetastas15 och mekanism för stamcellsunderhåll i tarmepiteel16). Även om buken imaging fönstret ger värdefulla resultat, har tillämpningarna av detta fönster för bukspottkörteln och den resulterande intravital imaging forskning baserat på sjukdomar som omfattar bukspottkörtel, inte undersökts i stor utsträckning.
Till skillnad från de väldefinierade fasta organegenskaperna hos den mänskliga bukspottkörteln är en mus bukspottkörtel en diffust fördelad mjukvävnadsliknande struktur17. Därför påverkas det oupphörligt av fysiologiska rörelser inklusive peristalsis och andning. En tidigare studie om tillämpningen av ett buken imaging fönster för bukspottkörteln visat att vandring inträffade på grund av rörelse-artefakter framkallas av tarm rörelser18. Allvarlig suddighet observerades i den resulterande genomsnittliga bilden, vilket hindrade visualisering och identifiering av mikroskala strukturer.
Häri beskriver vi användningen av en ny stödjande bas integrerad bukspottskörtel intravital bildframställning fönster kombinerat med intravital mikroskopi19,20 att undersöka longitudinella cellulära nivå händelser i sjukdomar som omfattar bukspottkörteln. Förutom en detaljerad beskrivning av metoden i den tidigare studien18kommer den utökade tillämpningen av avbildningsfönstret för bukspottskörteln för olika sjukdomar i bukspottkörteln att behandlas i detta dokument. I detta protokoll användes ett specialbyggt videohastighetslaserskanning confocal mikroskopi system som ett intravitalt mikroskopi system. Fyra lasermoduler (våglängder vid 405, 488, 561 och 640 nm) användes som excitationskälla, och fyra kanaler med emissionssignaler upptäcktes av fotomultiplierrör (PMT) genom bandpassfilter (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Laserskanning bestod av en roterande polygonspegel (X-axel) och en galvanometerskanningsspegel (Y-axel) som aktiverade videohastighetsskanningen (30 bilder per sekund). Detaljerad information om intravital mikroskopi har beskrivits i de tidigarestudierna 10,18,19,20,21,22,23.
I vår tidigare holmestudie18,vi framgångsrikt och stabilt avbildade holmarna i levande möss med hjälp av en transgen musmodell (MIP-GFP)24 där holmarna taggades med GFP. Metoden möjliggjorde högupplöst visualisering av förändringarna i holmarna under en period av 1 vecka. Det underlättade också avbildning av samma holmar i upp till 3 veckor, vilket tyder på genomförbarheten av långsiktiga studier av bukspottskörteln holmar för funktionell spårning eller övervakning under patogenesen vid diabetes mellitus18. Dessutom utvecklade vi en ortopisk bukspottskörtelcancer modell där fluorescerande bukspottskörteln cancerceller (PANC-1 NucLight Red)25 implanterades direkt i bukspottkörteln av musen. Med tillämpningen av bukspottskörteln intravital imaging fönster, denna modell kan användas som en plattform för att undersöka cellulära och molekylära patofysiologi i tumör microenvironment av bukspottskörteln cancer och för terapeutisk övervakning av nya läkemedelskandidater.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20006</td>
			<td>Fluorescent probe for conjugate with antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
			<td>BALB/C Nude</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic polyethylene tubing</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>427401</td>
			<td>PE10 catheter for connection with needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>OrientBio</td>
			<td>C57BL/6N</td>
			<td>C57BL/6N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circular</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111520</td>
			<td>Cover glass for pancreatic imaging window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Dextran 2MDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>FD200S</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS 8.1</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Microscopy</td>
			<td>IVIM tech</td>
			<td>IVM-C</td>
			<td>Intravital Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>S-1107-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 401</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>401</td>
			<td>N-butyl cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle holder</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>H-1126-10</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro rectractor</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>17004-03</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1034</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIP-GFP</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>006864</td>
			<td>B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon 4-0</td>
			<td>AILEE</td>
			<td>NB434</td>
			<td>Non-Absorbable Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican N 100 30G</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>FT9172220S</td>
			<td>For Vascular Catheter, Use only Needle part</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 NucLightRed</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Made in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatic imaging window</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Pancreatic imaging window - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiosuite</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>PS-02</td>
			<td>Homeothermic temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553708</td>
			<td>Antibody for in vivo vessel labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>JEUNGDO BIO &#38; PLANT CO, LTD</td>
			<td>F-1090-3</td>
			<td>This product can be replaced with the product from other company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMR Dextran 65-85kDa</td>
			<td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td>
			<td>T1162</td>
			<td>For vessel identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Window holder</td>
			<td>Geumto Engineering</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Window holder - custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 100</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stabilized longitudinal in vivo cellular-level visualization of the pancreas in a murine model with a pancreatic intravital imaging window

Direkt in vivo cellulär upplösning av bukspottkörteln i en levande liten djurmodell har varit tekniskt utmanande. En nyligen intravital imaging studie, med en buken imaging fönster, möjliggjorde visualisering av cellulära dynamiken i buken organ in vivo. Men på grund av den mjuka arkliknande arkitekturen hos mus bukspottkörteln som lätt kan påverkas av fysiologisk rörelse (t.ex. peristalsis och andning), var det svårt att utföra stabiliserad longitudinell in vivo imaging under flera veckor på cellulär nivå för att identifiera, spåra och kvantifiera holmar eller cancerceller i mus bukspottkörteln. Häri beskriver vi en metod för att implantera en ny stödjande bas, ett integrerat intravitalt avbildningsfönster i bukspottskörteln, som rumsligt kan separera bukspottkörteln från tarmen för longitudinell tidsfördröjning intravital avbildning av bukspottkörtelmikrostrukturen. Longitudinell in vivo imaging med bildframställning fönstret möjliggör stabil visualisering, vilket möjliggör spårning av holmar under en period av 3 veckor och högupplöst tredimensionell avbildning av mikrostrukturen, vilket framgår här i en ortopisk bukspottskörtelcancer modell. Med vår metod kan ytterligare intravitala avbildningsstudier belysa patofysiologin hos olika sjukdomar som involverar bukspottkörteln på cellnivå.

Intravital mikroskopi i kombination med den stödjande basen integrerad bukspottskörteln intravital imaging fönster möjliggör längsgående cellulär nivå imaging av bukspottkörteln i en mus. Detta protokoll med bukspottskörteln intravital imaging fönster ger långsiktiga vävnad stabilitet som gör det möjligt att förvärva högupplösta imaging för att spåra enskilda holmar i upp till 3 veckor. Som ett resultat kan mosaik imaging för ett utökat synfält, tredimensionell (3D) återuppbyggnad av z-stack ima...

Watch this Scientific Journal Video about Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window at JoVE.com

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

In vivo högupplösta imaging av bukspottkörteln underlättades med bukspottskörteln intravital imaging fönster.

Stabiliserad longitudinell in vivo-visualisering på cellulär nivå av bukspottkörteln i en murinmodell med ett intravitalt bildfönster i bukspottskörteln

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Detta protokoll beskriver stabiliserade och repetitiva cellulära nivå in vivo imaging av bukspottkörteln med en ny bukspottskörteln intravital imaging fönster. Den största fördelen med denna teknik är att det är möjligt att utföra orörlig, tredimensionell avbildning med upplösning upp till cellnivå under tre veckor i bukspottkörteln på en levande mus. Börja med att förbereda den kirurgiska plattformen och desinficera ytorna med 70% etanol.Efter bedövning, använd en rektal sond med en homeotermisk styrd värmedyna för att övervaka kroppstemperaturen. Ta bort håret från musens vänstra flank och applicera alkohol och jod alternativt, rotera från snittplatsen till den yttre ytan, gå aldrig tillbaka till snittplatsen och sluta med jod. Gör sedan ett 1,5-centimeters snitt på musens vänstra flank, dissekera huden och muskeln.Använd en svart eller nylon 4-0 sutur för att utföra en handväska sträng sutur i snitt marginalen. Dra mjälten försiktigt med ringtångor och identifiera bukspottkörteln. Placera fönstret på musens flank, passera mjälten och bukspottkörteln genom fönstrets öppna utrymme.Placera sedan försiktigt bukspottkörteln på bildfönstrets platta samtidigt som mjälten placeras på fönstrets öppna utrymme. Injicera PANC-1 nuclite röd direkt i bukspottkörteln. Använd en 31-gauge kateternål för att applicera droppar n-Butyl cyanoakrylatlim på avbildningsfönstrets marginal, vilket säkerställer att en minimal mängd lim appliceras.Applicera försiktigt ett 12 millimeters runt täckglas på bildfönstrets marginal. Håll sedan suturslingan för att passa in i fönstrets sidospår och bind den tre gånger. Slutligen, för att förhindra avbrott i dessa snäva stygn när mössen är vakna, skär den maximala proximala platsen för slipsen.Börja med att slå på det intravitala mikroskopet, inklusive lasereffekten. För att sätta in en vaskulär kateter, applicera tryck på svansens proximala sida med pek och tredje fingret. Värm vid behov svansen med en lampa.Desinficera svans venen med en 70%etanolspray, sätt sedan in en 30-gauge kateter i den laterala svans venen och visualisera uppstötningen av blod i PE-10-röret. Applicera silkestejp på katetern för att stabilisera den. Injicera FITC dextran och TMR dextran, eller andra fluorescerande sonder beroende på vad som är lämpligt, enligt kombinationen av fluorescerande sonder.Sätt i en rektal sond för att automatiskt styra kroppstemperaturen med ett hematermiskt värmedynasystem. Sätt sedan in det bukspottskörtelavbildningsfönster som förberetts under den intravitala mikroskopiinställningen i fönsterhållaren. Överför musen från den kirurgiska plattformen till bildfasen.För att utföra intravital avbildning, börja med att avbilda bukspottkörteln vid en låg förstoring, till exempel fyra gånger, för att skanna hela vyn av bukspottkörteln i bukspottskörteln imaging fönster. När intresseområdet har fastställts, byt till en högre förstoringsmållins, som 20 gånger eller 40 gånger, för att utföra cellulär nivå avbildning med lateral och axiell upplösning cirka 0,5 mikrometer respektive 3 mikrometer. Utför Z-stack- eller timelapse-avbildning för att observera 3D-strukturen eller dynamiken på cellnivå, till exempel cellmigrering.Intravital mikroskopi i kombination med bukspottskörteln intravital bildframställning fönster ger långsiktig vävnad stabilitet som gör det möjligt att förvärva högupplösta imaging för att spåra enskilda holmar i upp till tre veckor. Fönstret implanteras i en C57 svart 6 N mus med intravenöst injicerade anti-CD31 antikroppar, konjugerade med en Alexa 647 fluorophore, underlättade wide-area imaging och förstorade 3D-imaging av bukspottkörteln. Acinar celler identifierades i de genomsnittliga bilderna av bukspottskörteln vävnad i angränsande vaskulatur, visualiserades med autofluorescens och anti-CD31 antikroppar respektive.Med hjälp av mosaikavbildningsmetoden, som kombinerar en bred fältvy med högupplöst bildbehandling, visualiserades cirka 40 till 50 holmar med den intilliggande vaskulaturen i en MIP-GFP-mus. En tidigare studie visade att holmar kan spåras i upp till tre veckor med denna stabila bildmetod. För att visualisera cancerceller implanterades PANC-1 nuclite röda blodkroppar direkt i mus bukspottkörteln under kirurgi och närliggande fartyg var färgade med anti-CD31 konjugerade med Alexa 647.Med hjälp av detta protokoll genererades wide-field bilder av bukspottskörtelcancer. Detta hjälpte till att avgränsa tumörens marginal, samt uppnå högupplösta 3D-bilder på encellsnivå. Det mest kritiska steget i denna metod är den skickliga implantationen av bukspottskörtelns bildfönster i musen.Med hjälp av andra kombinationer av fluorescerande musceller och antikroppssonder kan dynamisk interaktion mellan närliggande celler med antingen holmar eller avbryta celler identifieras. Denna metod kan tillämpas i stor utsträckning av dem som utforskar förändringen av ön i olika patofysiologiska tillstånd och mikromiljöer av bukspottskörtelcancer på plats.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Imaging Gliom Inledande<em&gt; In Vivo</em&gt; Genom en polerad och förstärkt Thin-skalle Kranial fönster

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

En mus modell av stentimplantation i halspulsådern för studier av restenos

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation in i den främre ögonkammaren för längsgående, icke-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging med encelliga Upplösning i realtid

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis av Confocal optisk avbildning<em&gt; In Vivo</em&gt;: En modell av enda kärl Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

longitudinell<em&gt; In Vivo</em&gt; Avbildning av Cerebrovasculature Relevans till CNS-sjukdomar

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kvantitativ visualisering av leukocytinfiltrat i en murinmodell av Fulminant-myokardit genom ljusarkmikroskopi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualisering av endogena Mitofagkomplex in situ i mänskliga bukspottskörteln beta celler använder närhet ligation assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Robotic Lateral Pancreaticojejunostomy for Chronic Pancreatitis

Robotic lateral Pancreaticojejunostomy för kronisk pankreatit

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Precision-Cut leverskivor som en Ex Vivo modell av leverbiologi

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

A Doxorubicin-Induced Murine Model of Dilated Cardiomyopathy In Vivo

En Doxorubicin-inducerad Murine modell av dilaterad kardiomyopati in vivo

Dilated cardiomyopathy (DCM) refers to a spectrum of heterogeneous myocardial disorders characterized by ventricular dilation and depressed cardiac ...