Dessa analyser kan bidra till att klargöra rollen av tryptofanrester i proteiner när man utför ANS bindande studier. ANS fluorescens ökar vid bindning till specifika strukturella platser i proteiner. Ibland ans bindning webbplats lokaliserar nära en tryptofan rester med ett avstånd som tyder på förekomsten av FRET mellan tryptofan och ANS.
NBS förmedlar kemisk modifiering av tryptofanrester i proteiner och sänker dess fluorescens. Dessa analyser gör det därför möjligt att avgöra om tryptofanrester bidrar till ökningen av ANS fluorescensintensitet av FRET. I detta arbete använder vi en konstruerad rekombinant nukleotidbindningsdomän från SERCA som innehåller mutationer, som syftar till att hitta en tryptofan nära nukleotidbindningsstället där ANS också binder.
Denna analys är snabb och lätt att utföra, därav dess största fördel. Bestämning i silico av ANS och SERCA N-Domain interaktion. Generera en tredimensionell struktur av proteinet genom molekylär modellering med hjälp av den föredragna proteinmodelleringsprogramvaran.
Identifiera de aminosyrarester som utgör nukleotidbindningsstället med hjälp av den föredragna molekylära strukturella programvaran och bestämma förekomsten av arginin och lysinrester. Dessa krävs för ANS-bindning och ökar fluorescensintensiteten. På grund av förekomsten av arginin och lysinrester i nukleotidbindningsstället i SERCA, antar vi bindningen av ANS till N-Domänen.
I 3D-modellen identifieras och markeras aminosyraresterna som bildar ATP-bindningsstället i orange. På samma sätt ligger tyrosin-till-tryptofan mutationen och markeras i blått. Utför molekylär dockning med ATP, FITC och ANS.
Dockningsresultat visar att ANS passar bra på nukleotidbindningsstället, på samma sätt som ATP och FITC. FITC märker nukleotidbindningsstället. Beräkna det molekylära avståndet mellan tryptofanresterna och ANS.
20 angstroms verkar vara ett riktigt avstånd för FRET. Utför molekylär dynamisk simulering av ANS N-Domain-komplexet för att bestämma interaktionens stabilitet. En 10 nanosekundssimuleringstid visar komplexens stabilitet.
Fortsätt att utföra in vitro-experimenten. Uttryck och rening av den rekombinanta N-Domänen. Uttryck och rena, genom affinitetskromatografi, den konstruerade rekombinanta N-Domänen.
Utför en SDS-SIDA av det renade proteinet för att bestämma renheten. Bestäm proteinkoncentrationen genom absorbans vid en våglängd på 280 nanometer med N-Domänens utrotningskoefficient. Övervaka bildandet av ANS N-Domain-komplexet baserat på ANS- och N-Domänfluorescensintensitetsförändringar.
Förbered en ANS-stamlösning i N, N-Dimetylformamid. Väg en liten mängd ANS, mellan en till fem milligram. Lös upp ANS i en ml slutlig volym av N, N-Dimetylformamid.
Förbered en 100 mikromolär ANS-stamlösning med ANS-lösningen i N, N-Dimetylformamid. Blanda lösningen genom att virvelvind tre till fem gånger. Förbered NBS-stamlösningen i N, N-Dimetylformamid.
Väg en liten mängd NBS, en till fem milligram. Lös upp NBS i en ml N, N-Dimetylformamid. Förbered en en millimolär NBS-stamlösning med NBS-lösningen i N, N-Dimetylformamid.
Blanda lösningen genom att virvelvind tre till fem gånger. Titrera N-Domänen med ANS och spela in fluorescensspektrat för excitation vid en våglängd på 295 nanometer vid 25 grader. Få fluorescensspektrumets baslinje.
Placera en ml 50 millimolär fosfatbuffert med pH åtta i en en mL fluorescenskvarts cuvette. Placera cellen i spektrofotometerns termostaterade cellkammare och ställ in excitationsvåglängden på 295 nanometer. Spela in fluorescensspektrumet.
Det fluorescensspektrum av blindrummet visar toppen av vatten, som måste subtraheras senare. Få det inneboende fluorescensspektrumet i N-domänen. Placera 900 mikroliter på 50 millimolär fosfatbuffert med pH 8 i en fluorescenskvarts cuvette.
Lägg till 100 mikroliter N-Domain-suspension för att ge en slutlig koncentration av en mikromolar N-Domän. Homogenisera försiktigt med hjälp av en mikropipett för att säkerställa lösningens homogenitet. Placera cellen i spektrofotometerns termostatkammare.
Ställ excitationsvåglängden på 295 nanometer. Spela in N-Domain inneboende fluorescensspektrum. Tillsätt ANS och få fluorescensspektrumet genom excitation vid en våglängd på 295 nanometer.
Tillsätt en två mikroliter alikvot på 100 mikromolar ANS-stamlösning till den suspenderade N-Domänen för att erhålla en slutlig koncentration på 0,2 mikromolar ANS. Homogenisera försiktigt med hjälp av en mikropipett för att säkerställa att denna lösning är homogen. Spela in fluorescensspektrumet.
Upprepa ANS tillägg och fluorescens spektralinspelning som beskrivs ovan för en 1:1 ANS N-Domain molar relation. Subtrahera det tomma spektrumet från varje spektrum med hjälp av programvara. Rita alla spektra i ett enda diagram Bestäm om ett FRET-liknande mönster bildas av spektrumet.
ANS N-Domain fluorescensspektra bildar ett FRET-liknande mönster. N-Domän inneboende florescence titrering genom tryptofan kemisk modifiering med NBS. Få igen det inneboende fluorescensspektrumet för N-domänen.
Tillsätt en mikroliter alikvot på en millimolär NBS-stamlösning till den suspenderade N-Domain för att få en slutlig koncentration av en mikromolekylär NBS. Homogenisera försiktigt med hjälp av en mikropipett för att säkerställa lösningens homogenitet. Spela in fluorescensspektrumet.
Upprepa NBS tillägg och fluorescens spektral inspelning tills minimal N-Domän inneboende fluorescens släckning observeras. Homogenisera försiktigt med hjälp av en mikropipett för att säkerställa lösningens homogenitet. Subtrahera det tomma spektrumet från varje spektrum med hjälp av programvara.
Rita alla spektra i ett enda diagram. Titrera NBS-modifierade N-Domänen med ANS genom att registrera fluorescensspektra vid 25 grader. Tillsätt ANS och få fluorescensspektrumet genom excitation vid en våglängd på 295 nanometer.
Homogenisera försiktigt med hjälp av en mikropipett för att säkerställa lösningens homogenitet. Spela in fluorescensspektrumet. Subtrahera det tomma spektrumet från varje spektrum med hjälp av programvara.
Rita alla spektra i ett enda diagram. Den genererade fluorescensspektra stöder eller motbevisar förekomsten av FRET. Nämligen när FRET uppstår ökar inte ANS fluorescens och vice versa.
Bevis på ANS bindande för den kemiskt modifierade N-Domänen genom excitation vid en våglängd på 370 nanometer. Lägg till ANS i NBS-modifierade N-Domänen och registrera N-Domänens inneboende fluorescensspektrum genom excitation vid en våglängd på 370 nanometer. Subtrahera det tomma spektrumet från varje spektrum med hjälp av programvara.
Rita alla spektra i ett enda diagram. Bekräfta ANS-bindning till N-domänen genom den ökande ANS-fluorescensintensiteten. ANS-bindning till N-Domänen visar en fluorescensökning när den är upphetsad över en våglängd på 370 nanometer.
Resultatöversikt. Panel A.ANS N-Domain-komplexet visar ett FRET-liknande mönster när det är spännande vid en våglängd på 295 nanometer. Panel B.NBS släcker N-Domänens inneboende fluorescens genom att kemiskt modifiera de enda tryptofanresterna i den kemiskt modifierade N-domänen.
Panel C.ANS fluorescens ökar när den är spännande vid en våglängd på 295 nanometer. Panel D.ANS fluorescens ökar också när det är spännande vid en våglängd på 370 nanometer. Därför är direkt excitation av ANS vid en våglängd på 295 nanometer den främsta källan till ANS fluorescens när den är bunden till ATP-bindningsstället. Slutsatser.
Dessa analyser kan användas för att fastställa förekomsten av FRET mellan tryptofanrester och ANS i proteiner. Klargörandet av FRET, bekräftelse eller inte, mellan tryptofan och ANS kommer att göra det möjligt att dra bättre slutsatser i protein strukturella studier. Analysen kan också vara användbar vid användning av andra fluorforer.
