אנו מציגים פרוטוקול להדמיה מיקרוסקופית אלקטרונית של תחומים replicative בתא על ידי תיוג EdU של DNA מסונתז חדש זיהוי תווית עם שיפור כסף של חלקיקי Nanogold וכרום הכתמת הכרומטין. פרוטוקול זה מעניק את תיוג טרום ההטבעה הניגודיות הגבוהה עם קיבעון גלוטרדהיד מסורתי המעניק את השימור המבני הטוב ביותר של הכרומטין לעיבוד מדגם טמפרטורת החדר. פרוטוקול זה מותאם לתא הדבקה הגדל על כיסויים בצלחת פטרי.
הוסף EdU ל 10 מיקרו מולים ריכוז סופי ומניחים את התאים לתוך האינקובטור לזמן התיוג הרצוי. תקן את התאים המסומנים עם 2.5% gluaradehydrate בתמיסת 100 מילימול נתרן קקודילאט במשך שעה אחת. זמן קיבעון ארוך יותר עלול להשפיע לרעה על תיוג EdU.
הסר glutaraldehyde על ידי שטיפה של הדגימות עם PBS בתוספת חמישה מילימולים של מגנזיום כלוריד, נחשב עוד יותר כוכב PBS. לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות. קרום פלזמה Permeabilize עם 1% פתרון של Trione X-100 בכוכב PBS, לבצע שני שינויים במשך חמש דקות כל אחד.
פתרון זה מכונה גם כוכב PBS T.נרחב לשטוף את המדגם עם כוכב PBS. חמישה שינויים לחמש דקות כל אחד. להרוות את שאריות אלדהיד קבוצות עם 20 מילימול של גליצין בכוכב PBS, פעמיים במשך 10 דקות.
מניחים את המדגם בכוכב PBS עם 1%BSA במשך חצי שעה. בעת חסימה ב- BSA, להכין את קוקטייל התגובה לזיהוי EdU. סדר הוספת הרכיבים חשוב.
הטיות ביוטין-אזיד EdU מבוצעות בתא הלח כדי למזער את שינויי האידוי והריכוז בקוקטייל התגובה. הכינו את התא הלח. מניחים את כיסוי הכיסוי על para-film עם תאים הפונים כלפי מעלה ושכבה 50 עד 100 microliters של קוקטייל התגובה על כיסוי.
התגובה אורכת 30 דקות בטמפרטורת החדר. הפסיקו את התגובה על ידי שטיפת הדגימה בכוכב PBS T, חמש פעמים במשך חמש דקות כל אחד. חסום שוב עם 1%BSA בכוכב PBS T למשך חצי שעה נוספת.
הכן פתרון סטרפטאבידין-ננוגולד בכוכב PBS T עם 1%BSA. דגירה המדגם עם סטרפטאבידין לילה ב פלוס ארבע מעלות בתא לח שהוכן לאחרונה. ההליך זהה להטיית ביוטין-אזיד EdU.
הפסיקו את התגובה ושטפו את הדגימה, חמש פעמים במשך 10 דקות כל אחד עם כוכב PBS T.Stabilize biotin streptavidin קומפלקס על ידי קיבוע נוסף יהיה 1% כוכב PBS glutaraldehyde במשך חצי שעה. הסר glutaraldehyde על ידי כביסה אינטנסיבית עם מים deionized. להרוות קבוצות אלדהיד שיורית עם מיליגרם אחד למיליליטר נתרן בורוהידריד.
לשטוף שוב ביסודיות. השלב הבא הוא להגדיל את הגודל של חלקיקי Nanogold באמצעות תצהיר כסף על מסלול הזהב. הכן את ההכנות המוקדמות כדי למזער את פעילות חדר החושך.
שיווי משקל את הדגימות עם חוצץ כביסה ולהמשיך לחדר חושך. בחדר החושך מערבבים את הרכיבים להכנת פתרון הכביסה ומחילים אותו על הדגימות. תמיסת אבקת שיטה היא מאוד קרביים.
אז במהלך ערבוב הרכיבים, לטלטל את הצינור לאט כדי למנוע היווצרות בועה וקצף. התגובה אורכת בין שתיים לחמש דקות. אנו ממליצים לבצע הרצת מבחן כדי לקבוע את זמן התגובה האופטימלי.
זמן דגירה ארוך יותר עלול לגרום לתצהיר כסף לא ספציפי. כדי לעצור את התגובה, לשטוף במהירות את המדגם עם שלושה עד חמישה שינויים של מים deionized. ואחריו עוד שלושה שינויים במשך חמש דקות כל אחד.
כדי להגן על חלקיקי הכסף מפני פירוק על ידי tetroxide אוסמיום, לדגור על הדגימות ב 0.05% חומצה טטרכלורואורית במשך שתי דקות בחושך. לשטוף ביסודיות עם מים deionized. בשלב זה, ניגודיות נוספת מתווספת ל- DNA המכיל חומר.
להרוות את הדגימה עם כתם DNA DRAQ5. מוסיפים תמיסת diamionobenzidine לדגימה ודגורים במשך דקה אחת. הזיזו את כיסוי הכיסוי לתוך צלחת הפטרי התחתונה מזכוכית, והניחו אותה על הבמה של המיקרוסקופ ההפוך.
להקרין כמה שדות ראייה עם אור אדום 640 ננומטר. החלונית השמאלית מציגה את הלבנת התמונות המלאה של DRAQ5. בחלונית הימנית, אותו שדה ראייה מוצג באור המשודר המציג משקעים מסוג DAB.
לשטוף דגימות עם מים deionized. השלב הבא צריך להתבצע מתחת למכסה המנוע של האדים. מוכן פתרון אוסמיום טטרוקסיד מופחת חלקית.
תיזהר. חומר זה הוא מאוד נדיף ורעיל. החל את הפתרון המוכן על המדגם.
בשלב זה, תרכובות אוסימיום מופחת להגיב עם תצהירים diamionobenzidine ולהגדיל את הניגוד של ה- DNA. השליכו אוסמיום המכיל פתרון בהתאם לתקנה המקומית שלכם ושטפו דגימות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד. המדגם מיובש עוד יותר בסדרה של הגדלת ריכוזי אתנול ואחריו חדירת התאים עם תערובות שרף אתנול.
החלף תערובת שרף אלכוהול עם שרף טהור טרי מוכן. מלאו את תבנית ההטבעה בגודל הנכון בשרף טרי. מניחים את כיסוי הכיסוי עם תא הפונה כלפי מטה מעל החלל מלא שרף.
לרפא את השרף במשך 24 שעות ב 37 מעלות. ואז ב-60 מעלות לפחות יומיים. הסר שרף ממשטח תחתון של כיסוי.
זרוק את הלוח לתוך חנקן נוזלי ולאחר מכן להעביר למים רותחים. הזכוכית צריכה להתנתק. חזור על הפעולה במידת הצורך.
שדות ראייה מוקרנים צריכים להיות גלויים בבירור בשל התצהיר diamionobenzidine והכתמת DAB. לחתוך את האזור של עניין מן הלוח באמצעות המסור או כל מכשיר מתאים אחר. מניחים את הגזרה לתוך המחזיק הפשוט ultramicrotome.
הגדר את ultramicrotome עבור חיתוך בלוק סופי. באמצעות סכין הגילוח, הכינו את הגלולה בצורת פירמידה. גודלו של שטח שטוח על גבי הפירמידה צריך להיות כ 400 על ידי 200 מיקרון.
הר את הפירמידה המוכנה לזרוע האולטרה-רובוטית והתקן את הסכין. הכן את החלקים. ניתן להתאים את עובי המקטע כך שיתאים לדרישות הניסיוניות.
אנחנו שואפים לטומוגרפיה אלקטרומגרפיה. אז הכנו קטעים בעובי של 250 ננומטר המכונים גם קטעים דקים למחצה. נתק את המקטעים מקצה הסכין והתקן אותם על רשת חריצים.
השתמשנו ברשת חריצים, הם היו עגולים מילימטר אחד כדי להיות בסביבה, פתיחה צדדית מילימטרית אחת. גודל הפתיחה הקטן מספק יציבות טובה יותר של המקטעים. תן לדגימות להתייבש ברשת.
ברגע זה, החלקים מוכנים לתצפית. מקם את הרשת במחזיק מדגם מיקרוסקופ האלקטרונים. טען את הדגימה למיקרוסקופ האלקטרונים.
לרכוש סדרת הטיה. מוקדי שכפול בגרעיני תאי היונקים מציגים דפוסי הפצה ברורים בהתאם להתקדמות שלב ה- S. תיוג EdU מוצלח שאושר על ידי תגובת הקליק עם אזיד מסומן בפלואורסצנטיות מדגים דפוס שכפול טיפוסי באוכלוסיית התאים ההטרוגניים לאחר קיבוע glutaraldehyde על גבי.
תיוג סטרפטאבידין יכול להיות מושפע glutaraldehyde. אז קודם לבדוק את כתמי סטרפטאבידין פלואורסצנטין תחת אותו מצב כמו ננו-גד סטרפטאווידין בתחתית. תוצאה טובה של הליך שיפורי הכסף היא כתם חום כהה של כמה גרעינים וכתם ציטופלסט צהוב התעלף מאוד, המוצג בתחתית.
היתרון של תיוג לפני הטבעה הוא האפשרות לבחור תאים עבור החתך. זה אפשרי בשלב זה כי דפוסי התוויות הופכים גלויים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. התוויות המתאימות גורמות לאתרי השכפול המסומנים היטב.
ראש חץ להראות את סיבי הכרומטין מוכתמים DAB. תיוג הרקע מימין מוגבל לכמה חלקיקים למיקרון מרובע. חלקים דקים למחצה מוכנים לטומוגרפיה ואינם דורשים תוספת של חלקיקי זהב.
הגישה המתוארת המשמשת למחקרים של ארגון כרומטין באתרים עם שכפול זמין. לניתוח של ארגון מחדש לאחר שכפול של כרומטין כולל הדמיה ברזולוציה גבוהה של הפרדת כרומטין. הוא משמש גם עבור תיוג משוכפל של תחומים כרומוזומליים גדולים ומחקרים של קיפול כרומטין בסדר גבוה יותר והטרוכרומטין.
טכניקת הדמיה זו חשובה גם כנקודת התייחסות לנתונים הנוצרים על ידי גישות לא מיקרוסקופיות אחרות. ניתן להתאים את השיטה גם למחקרים מיקרוסקופיים מתואמים כולל טכניקות רזולוציית-על. זה פותח אופקים חדשים במחקרים של מבנה סדר גבוה יותר כרומטין ואת הדינמיקה שלה במצבים הפיזיולוגיים השונים של התא.
