עבודה זו נתמכה על ידי אגודת מקס פלנק (KMD, BD, AWM, שחפת, TBB, DJM, וWK), האשכול של אקסלנס &quot;מכלולי Macromolecular&quot; פרנקפורט ממומן על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) וטווח ארוך EMBO הבתר מלגה (VAMG).

.1 הכנת המיטוכונדריה מתאים או רקמות על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלי סעיף זה מתאר נוהל כללי לבידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מאורגניזמים אוקריוטים שונים. רכיבי חיץ ומהירויות צנטריפוגה המדויקות צריכים להיות מותאם לכל רקמה / מינים למדו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור תאי חיץ איזוטוני (למשל, 250 סוכרוז מ&quot;מ, 10 HEPES מ&quot;מ pH 7.4), (תפטיר פטרייה) באמצעות טחנת חרוזי זכוכית 28, עיכול אנזימטי של דופן התא (Saccharomyces cerevisiae) 29, homogenizer מיסבים כדורי (אחת -cell אאוקריוטים / תאים / נמטודות תרבות) 30, או בלנדר (רקמות בעלי חיים או צמח) ביום 31 ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פסולת תא על ידי סינון דרך בד מוסלין ואחריו צנטריפוגה במהירות נמוכה (2,000 XG, 4 ° C, 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף מיטוכונדריה supernatant והגלול על ידי צנטריפוגה במהירות גבוהה (9,000 XG, 4 ° C, 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, להשתמש בשיפוע צעד הצפיפות שוה לטיהור נוספת של שבריר של המיטוכונדריה 32. </li></ol> 2 הכנת המיטוכונדריה לאלקטרונים קריו טומוגרפיה הסעיף הבא מתאר כיצד להשיג דגימות-התייבשות קפוא לcryo-ET. הערה: השיטה כרוכה בשימוש בחנקן נוזלי קר מאוד ואתאן, אשר יכולה לגרום לכוויות בעור חמורות. משקפי בטיחות וכפפות cryo-הגנה חייבים להיות משוחק. אתאן הנוזלי, שהוא גם דליק, יש לטפל במנדף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend מיטוכונדריה pelleted ב250 trehalose מ&quot;מ, 10 חיץ HEPES מ&quot;מ בpH 7.4 לריכוז של כ 5 מ&quot;ג / חלבון כולל מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשתות זוהר פריקה EM פחמן מחורר, צד של פחמן, במכשיר ואקום לפי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נזל כמה מיליליטרים של אתאן על ידי הפניית זרם של גז אתאן על הצד הפנימי של מגניב חנקן נוזלימיכל אלומיניום ed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים השעיה fiducial זהב חלבון מצומדות- 1: 1 עם השעיה של המיטוכונדריה ולהחיל באופן מיידי 3 μl לרשת EM זוהר פריקה שנערכה בפינצטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את פינצטה במכשיר vitrification, למשל, גיליוטינה תוצרת בית. למחוק את נוזל עודף עם טריז של נייר סינון (~ 5 שניות או עד שמפסיק נוזל מתפשט) ולצלול מייד לרשת לאתאן הנוזלי על ידי שחרור על ההדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הרשת מאתאן הנוזלי לתוך חנקן נוזלי. במהלך העברה, להסיר אתאן העודף מהרשת עם נייר סינון. הנח את הקצה של פיסת נייר סינון בצורת טריז לאתאן הנוזלי. כאתאן הנוזלי עולה, בעדינות לגרור את הרשת עד נייר הסינון אבל לשמור את זה מתחת לחזית הנוזלית. אתאן הנוזלי הוסר מהרשת על ידי פעולת נימים וברגע שכל אתאן הנוזלי הוסר, להעביר באופן מיידי את הרשת לתוך חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרשת המזוגגת לתוך קופסא אחסון רשת,nd לאחסן תחת חנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר כמתאים. </li></ol> .3 הקלטה של ​​סדרת ההטיה טומוגרפיה הסעיף הבא מתאר כיצד להגדיר ולאסוף סדרת הטיה טומוגרפית של mitochondrion עם מיקרוסקופ אלקטרונים Polara מצויד במסנן אנרגיית פוסט טור ומצלמת CCD. פרוטוקולים דומים נמצאים בשימוש בכל cryo-מיקרוסקופי האלקטרונים מצוידים בCCD או מצלמות ישירות גלאי אלקטרונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בדיקת דגימה למשל, גרפיט ואיי זהב על סרט פחמן מחורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצב חיפוש בחר במערכת במינון הנמוך של מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא מדגם לגובה eucentric. זוהי הנקודה של תנועת XY מינימאלית כאשר ההטיה בעל הדגימה. מרכז נקודת העניין ב 0 ° הטיה, להטות את הבמה כדי 20 ° מחדש מרכז הנקודה על ידי שינוי z-הגובה. חזור אל 0 ° וחזור עד הקיזוז לרוחב ממוזער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרמצב חשיפה. בחר הגדלה רצויה לאיסוף tomogram (למשל, 25,000X בגלאי ≈ 0.6 ננומטר דגימת גודל פיקסל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר צמצם הקבל קטן (50-70 מ&quot;מ) ובחר גודל נקודה ועוצמת קרן, כך שהקרן היא פשוט יותר מאשר מכשיר ההדמיה ונותנת קריאת פיקסל של 60 דואר - / פיקסל (CCD) או 14 דואר - / פיקסל / שניות (גלאי אלקטרונים ישירים, מצב ספירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמצם הקבל מרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא למשל מוקד גאוס, נקודה של ניגוד מינימאלי. קריאת איפוס defocus מיקרוסקופ ונקודות ציר נכונות ומרכז סיבוב פי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיוג בdefocus הרצוי להקלטת tomogram. הערה: defocus גבוה (8 מיקרומטר) מגבירה ניגוד אך מפחיתה רזולוציה, ואילו defocus הנמוך (2-4 מיקרומטר) מגדיל רזולוציה על חשבון לעומת זאת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעל חור ריק, ליצור התייחסות רווח חדשה וליישר מסנן אנרגיה על פי יצרן שלהוראות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר מצבי חיפוש וחשיפה. במצב חשיפה, מרכז נקודת העניין ולעבור למצב החיפוש. הגדלה נבחרת של 1,500X (0.033 מיקרומטר / פיקסל של דגימה בגלאי) וdefocus של 100 מיקרומטר (לניגוד מוגבר). להביא נקודה חזרה ריבית למרכז באמצעות סלילי משמרת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במצב חיפוש, להתאים את גודל מקום ואת עוצמת קרן, כך שהקרן היא פשוט יותר מאשר מכשיר ההדמיה ונותנת קריאת פיקסל של ~ 20 דואר - / פיקסל (CCD) או ~ 8 דואר - / פיקסל / שנייה (גלאי אלקטרונים ישירים, ספירת מצב). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מציאת שטח דגימה טובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הרשת עם מיטוכונדריה-התייבשות קפוא למיקרוסקופ האלקטרונים בטמפרטורה של חנקן נוזלי (עיין בהוראות של יצרן EM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במצב חיפוש, חיפוש ברשת לתחומי איכות עובי קרח ודגימה מתאימה. קח את תמונת חיפוש 6 שניות של אזורים המבטיחים כדי לקבוע התאמה לאוסף tomogram. Both קרום המיטוכונדריה הפנימי וחיצוני צריך להיות גלוי בהגדלה זו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלטה של ​​סדרת הטיה טומוגרפיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שאזור דגימה טוב נמצא, להטות את הבמה ± 60 ° כדי לקבוע את טווח ההטיה המרבי שזמין ללא כל חסימה של החשיפה או להתמקד באזור על ידי ברים רשת או גושי קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על חור מלאת קרח סמוך מראה דומה, לעבור למצב חשיפה ולהתאים את זמן עוצמת קרן או רכישת תמונה יש כל כך כל תמונה נרשמה מינון אלקטרון של 30-50 דואר - / פיקסל לCCDs או 6-8 דואר - / פיקסל / S גלאי אלקטרונים ישירים, לספור מצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את יחס חלוקת מנה (אני 0 / אני 60) על ידי חלוקת מספר האלקטרונים הממוצע לתמונת 1 שניות נרכשה ב 0 ° עם זה של תמונה 60 °. יחס זה מתאר את העלייה בזמן חשיפה הנדרשת כדי לשמור על ספירת אלקטרונים קבועה לכל תמונה עם הגדלת זווית הטיה (זמן = 1 / c חשיפהמערכת הפעלה (α) n שם (אני 0 / אני 60) = 2 n). היחס משמש גם כאינדיקציה טובה לעובי קרח. tomograms הטוב של המיטוכונדריה נרשם בדרך כלל עם אני 0 / אני 60 = 2.3-2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעל חור ריק, לרכוש תמונת 1 שניות במצב חשיפה ולציין את ספירת האלקטרונים ל2. אם ניקח בחשבון את יחס חלוקת המנה, לחשב את המספר הכולל של תמונות שניתן להקליט עבור הסכום כולל מינון אלקטרון ספציפי (לדוגמא, &lt;40 דואר - / 2 לקביעת מבנה ו~ 160 דואר - / 2 למורפולוגיה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מרווח ההטיה המתאים לאוסף tomogram על ידי חלוקת טווח ההטיה הכוללת (לדוגמא, 120 ° ל± 60 °) במספר הכולל של תמונות מחושבים ב3.3.4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר ולהקליט tomogram עם הפרמטרים שנקבעו לעיל באמצעות תוכנת איסוף נתונים אוטומטי מתאים 33, 34. סדרת הטיה בדרך כלל התחילה ב± 20 ° ולעבור 0 ° לפני שהגיע בנטיות גבוהות על מנת למקסם את תוכן המידע של תמונות נמוכה הטיה אשר נהרס על ידי מינון אלקטרון הגדלת. </li></ol> .4 יצירה ופילוח כרכי טומוגרפיה סעיף זה מתאר כיצד כרכים טומוגרפית של מיטוכונדריה נוצרים סדרת הטיה ואיך כרכי נוכחים לצפייה כללית מ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הסדרה להטות טומוגרפית לספרייה מתאימה. צור ערימת תמונה ולהמיר לפורמט מתאים קובץ עם תוכנות קוד פתוח, כגון dm2mrc או tif2mrc (חבילת IMOD), אשר להמיר .dm3, .dm4 או .tif קבצים לערימות MRC. ערימות MRC נדרשות לשיקום טומוגרפית עם IMOD 35. חבילות אחרות דורשות פורמטים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את התמונות וליצור tomogram ידי ביצוע השלבים המפורטים בהדרכת IMOD ( <ahref=&quot;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html&quot;&gt;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשפר את הניגודיות של tomogram באמצעות מסנן דיפוזיה איזוטרופי שאינו ליניארי מופץ עם IMOD. מסנן זה עובד היטב עבור ממברנות וחלקיקי קרום הקשורים כגון synthase ATP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדמיה, באופן ידני קטע tomogram באמצעות תוכניות זמינות באופן מסחרי לדוגמא, אמירה. הקצאת voxels המתאימים הקרום הפנימי או חיצוני וליצור משטח. שימוש באפשרות השלט בתוסף EM-חבילה לעמירה 36 לסמן את המיקום של חלקיקי synthase ATP. </li></ol> מיצוע .5 Subtomogram של הדימרים synthase ATP והתאמה של מבני X-Ray הסעיף הבא מתאר כיצד ניתן להשיג ממוצעי subtomogram של הדימרים synthase ATP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בחלקיקים המסומנים כקלט וחבילת תוכנה מתאימה, כגון &quot;חלקהערכת icle לתכנית &#39;אלקטרונים טומוגרפיה, לחשב ממוצע subtomogram. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להערכת רזולוציה, להשוות בין שני ממוצעי subtomogram באופן עצמאי נקבעו על ידי מתאם פגז פורייה 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מבנים זמינים, מזח ידוע רנטגן לתוך ממוצע subtomogram על ידי גוף נוקשה הולם, באופן ידני או באמצעות רוטינות עגינה רציפות אוטומטיות כגון אלה בתכנית כימרה 38. </li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הפרוטוקול המובא כאן מספק מבוא לקריו ET ומיצוע subtomogram של מיטוכונדריה, אבל בעצם אותו ההליך יכול להיות מיושם על כל תא תא אחר או קרום. כדי להשיג את הנתונים הטובים ביותר האפשריים, שלבים קריטיים במהלך ההליך הם הכנת מדגם, אסטרטגיית רכישת תהליך ההקפאה לצלול ונתונים. איכות מדגם, שהוא קריטי להצלחה, תלויה בפרוטוקול הקפאה מותאמת על מנת להבטיח עובי קרח מתאים, אשר הוא בעלת חשיבות עליונה לניגוד תמונה טוב. אסטרטגיית הרכישות של נתונים אופטימליות תלויה במכשיר והמדגם. פרמטרים להיות מותאמים כוללים מנת אלקטרון לכל תמונה, תכנית ההטיה וdefocus. רכישת tomogram טובה של מדגם טוב עושה את כל העיבוד נוסף על שלבים יותר קל ומבטיח תוצאה סופי משביעת רצון. שילוב Cryo-ET עם מיצוע subtomogram והמתאים מודל אטומי מספק פרטים של איך קומפלקסי חלבונים מסודרים בהסביבה סלולרית ילידי Eir. הטכניקה היא מתאים באותה מידה לחקירת המבנה של קומפלקסי חלבוני קרום גדולים, כגון supercomplexes נשימה שרשרת (1.7 מד&quot;א), הדימרים synthase ATP (2x500 KDA), או מורכבת הנקבובית הגרעיני (~ 120 מד&quot;א) 8, 9, 17. הארגון של הדימרים synthase ATP לשורות לא יכול להיות שנצפה על ידי טכניקות ברזולוציה גבוהה כגון קריסטלוגרפיה רנטגן, NMR או חלקיק יחיד cryo-EM, כי שורות דימר הם שיבשו על ידי מיצוי חומר ניקוי, שבו הוא צעד הכרחי בבידוד וטיהור של קומפלקסי חלבוני קרום. ההסדר של synthase ATP בשורות של הדימרים לאורך רכסי cristae הוא עיקרון מארגן אוניברסלי של המיטוכונדריה בכל המינים. מתחמי פרוטון שאיבה של שרשרת העברת אלקטרונים, במתחם מסוים אני (dehydrogenase NADH), ממוקמים באזורי הקרום משני צדי השורות 8,9. ארגון זה של שרשרת הנשימה יש השפעה עמוקה על bioenergetics המיטוכונדריה. אם שורות דימר לא יכולות להיווצר בשל העדר של יחידות משנה חלבון דימר ספציפי, תאי תערוכת פעמים דור ארוכים יותר וכושר סלולארי מופחת, כפי שנצפו במוטצית השמרים שמוצגת באיור 3 41. עם העניין ההולך וגובר במחלות מיטוכונדריאליות, מפורטים הבנה של הבסיס המולקולרי השולט ultrastructure ותפקוד המיטוכונדריה היא בעלת חשיבות עליונה. cryo-טומוגרפיה של האלקטרון מספקת קישור בין מבנה חלבון נקבע על פי שיטות ברזולוציה גבוהה, וההפצה וסידור של חלבונים אלה בקרום בקנה המידה של ננומטר. זה עושה cryo-ET כלי חיוני להבנת מבנה ותפקוד של המיטוכונדריה בבריאות ובחוליים. התפתחויות נוספות טכניות ושיפורים בcryo-ET כוללים אסטרטגיות חלבון תיוג לזהות את עמדתו של protein תת יחידות במתחמי macromolecular או המיקום של חלבונים שונים קטנים יותר או פחות (&lt;0.5 מד&quot;א) בתאים. בנוסף, שיטות עיבוד EM ההיברידי, המשלבות מיצוע subtomogram עם ניתוח חלקיקים בודד או שחזור סליל לאחרונה נקבעו מבנים חלבוניים ל~ 8 42 A, 43. שיטות עיבוד אלו כרגע מוגבלות לחלבונים מטוהרים, אשר מופרדים היטב בקרח או ליצור מכלולי סליל וכרגע אינו ישימים לסביבות סלולריות צפופות כמו המיטוכונדריה וcristae ממברנות. לאיסוף נתונים, כלים מחשוב וחומרה חדשים מפותחים על מנת לאפשר רכישת tomogram אוטומטית, להגדיל את ניגוד תמונה ולהפחית את סך מינון אלקטרון הנדרש. המגבלה הבסיסית בלבד בcryo-ET היא נזקי קרינה למדגם על ידי קרן האלקטרונים. משמעות דבר היא כי מינוני אלקטרון רק נמוכים מאוד יכולים לשמש כדי להקליט כל תמונה של סדרת ההטיה טומוגרפיה, וכתוצאה מכך אות t העניo-רעש יחס שסופו של דבר מגביל את הרזולוציה השגה. הגלאים החדשים האלקטרון ישיר, שוחררו לפני פחות משנה, בימים אלו מהפכה בתחום חלקיק היחיד cryo-EM 44, 45. גלאים החדשים אלה מספקים ניגודיות גבוהה יותר ורזולוציה טובה יותר במינונים נמוכים יותר אלקטרונים. לcryo-טומוגרפיה של אלקטרון, זה אומר שסדרת הטיה עם גדלי צעד קטנים או tomograms ציר אפילו כפול ניתן לאסוף חששות לגבי נזקי קרינה מוגזמים (CCD תמונה אחת שווה במינון אלקטרון עד 5 תמונות גלאי אלקטרונים ישירות) בלי. הכמויות גדולות של נתונים היוצר על ידי גלאים אלה יוצרים אתגרים משלהם בנתונים טיפול, עיבוד ואחסון, אשר יש להתגבר. בנוסף, צלחות שלב, הפועלות על עקרונות דומים לאלה המשמשים באופן שיגרתי במיקרוסקופ אור כדי לשפר את ניגוד שלב, בימים אלו שפותחו עבור מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים 46, 47. צריך זה לאפשר tomograms שייגבה קרוב יותר להתמקד, ולכן ברזולוציה גבוהה יותר, ואילו באותו הזמן השמירה ברזולוציה נמוכה תכונות הכרחיות ליישור ופרשנות של כרכים טומוגרפית. יחדיו, התקדמות הטכנולוגית אלה תרחיב באופן משמעותי את מגוון שאלות ביולוגיות שניתן לטפל על ידי cryo-ET.

המיטוכונדריה הוא הכח, בתים של התא. על ידי המרת שיפוע פרוטון אלקטרוכימי על פני קרום המיטוכונדריה הפנימי לתוך קשר כימי באנרגיה, synthase ATP במיטוכונדריה מייצר את רוב ATP שמניע את תהליכים תאיים. על מנת להבין את המנגנונים שמאחורי המרת אנרגיה של המיטוכונדריה, אנחנו צריכים לקבוע את המבנה של synthase ATP באתר, ולגלות איך זה מסודר והופץ בקרום המיטוכונדריה הפנימי. למרות שמבנים ברזולוציה גבוהה של רוב המרכיבים של המיטוכונדריה ATP synthase 1-3 והמפות ברזולוציה הנמוכה של 4 המורכבים כולו זמינים, חשוב להקים את המבנה וקונפורמציה של האנזים הפועל בקרום. חלוקת synthase ATP בקרום המיטוכונדריה הפנימית כבר הניחה באופן נרחב כדי להיות אקראי, אבל מוקדם מציאת 5 והתוצאות הראשוניות שלנו 6 הצביעו על כך שזה לא tהוא המקרה. מחקרים מאוחרים יותר מהקבוצה שלנו ואחרים 7 אישרו כי synthase ATP מסודר בשורות של הדימרים לאורך הרכסים בחוזקה המעוגלים של cristae קרום המיטוכונדריה הפנימי 8 ארוכות, ואילו משאבות הפרוטון של שרשרת העברת אלקטרונים מופיעות להיות ממוקמות בכל צד של השורות 9. יש הסדר זה השלכות חשובות על המנגנונים של המרת אנרגיה של המיטוכונדריה. הטכניקה ששמשנו לקביעת הסדר זה היא cryo-טומוגרפיה של אלקטרון (cryo-ET). Cryo-ET הוא כיום השיטה היחידה המספקת כמויות מדויקות תלת ממדים (3D) של תאים, תאים סלולריים או אברונים ברזולוציה מולקולרית. Cryo-ET הוא מתאים במיוחד ללימוד מתחמים גדולים בממברנות ביולוגיות, משום שהקרומים מופיעים עם ניגודיות טובה וקלים לאתר בכרכי טומוגרפיה 3D. שיטות אחרות כדי ללמוד את מבנה 3D של תאים או organelles לא מספק פירוט מולקולרי. הרזולוציה סופר מיקרוסקופ אור 10, 11 היא מעולה בחושף את העמדה או מרחקים בין תוויות פולטות אור מחוברות לחלבוני עניין עם דיוק של עשרות ננומטר, אבל זה לא לחשוף את המבנה של החלבון עצמו, אפילו ברזולוציה נמוכה . במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים סעיפים סידוריים 12 או לחסום פנים הדמיה על ידי סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים 13 של דגימות ביולוגיות מוטבע פלסטיק לספק תצוגות ברזולוציה נמוכה של כרכים סלולריים אבל גם לא חושף פרטים מולקולריים. כוח מיקרוסקופיה האטומית 14 יכולה בעיקרון לספק רזולוציה מולקולרית או אפילו אטומית, אבל רק על פני השטח של אובייקטים על תמיכה אטומית שטוחה, מוצקה. לבסוף, טומוגרפיה רנטגן 15 או פיזור של פולסים חזקים של קרינת X מלייזרי אלקטרונים חופשיים היא 16 סבירה כדי לחשוף את המבנה של אובייקטים גדולים ומורכבים, לא מחזוריים כגון תאים או אברונים שלמים במ &#39;הרזולוציה olecular בעתיד הנראה לעין. כך בהווה, אין חלופה לקריו ET ללימודים של מבנה 3D של תאים או אברונים ברזולוציה ננומטר. Cryo-ET הוא שיטת הבחירה לבחינת המבנה והמבנה של מכלולים הקשורים חלבון קרום כוללים המתחם הגרעיני הנקבובית 17, ספייק שפעת קומפלקסי 18, ושוטונים חלבוני מנוע 22, 23 אלא גם הארגון של תאים שלמים של חיידקי 19 וכניסה של וירוסים פתוגניים כגון HIV בתאי 20-23. Cryo-ET הוא לא יסולא בפז המאפשר הדמיה חלבונים סיביים ויחסי הגומלין שלהם בתא, כולל סיביים אקטין 24 או axonemes 25. הרזולוציה ניתן לשפר עד 2 ננומטר או טוב יותר על ידי subtomogram ממוצע 26, לפיה subvolumes של תכונות חוזרות ונשנות, רגילות נחתכות מטומוגרפיה נפח ובממוצע על ידי פרו תמונת חלקיק יחידטכניקות cessing. Cryo-ET כרוך ברכישה של סדרה של תמונות הקרנה של דגימה דקה (&lt;250nm) נלקחה בזוויות הטיה שונות במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). הדגימה חייבת להיות רזה כדי שאלקטרונים, אשר אינטראקציה חזקה עם עניין, פזורים לא יותר מפעם אחת. פיזור מרובה הופך את התמונות וכתוצאה מכך קשה לפרש, ומפחית את הניגוד. תמונות של אזור הדגימה שנבחר מיושרות ביחס לכל אחד אחר ומוקרנות לתוך חלל 3D על ידי תוכנת מחשב מתאימה, יצירת נפח 3D של הדגימה. היישור של התמונות נעזר בסמני fiducial זהב, אשר מעורבבים עם המדגם לפני ההקפאה. סמני fiducial באופן אידיאלי 10 או יותר באופן שווה מופצים צריכים להיות נוכחים בכל תמונה כדי להשיג התאמה טובה. כדי לצפות בפירוט מולקולרי, דוגמאות הן לצלול קפוא באתאן הנוזלי, השומר על מדינת התייבשות האם שלהם. הקפאה בנוזלאתאן הוא כל כך מהר (~ 10 5 ° C / sec) 27 שהמים אינו להתגבש אבל נשאר במדינה מזוגגת, כמו זכוכית. גביש קרח נזקי היווצרות מבנים ביולוגיים רגישים. כדגימות ביולוגיות סובלות מנזקי קרינה, יש גבול למספר הכולל של אירועי פיזור הדגימה יכולה לסבול. תמונות ובכך רכשו במצב במינון נמוך: שטח של עניין מזוהה בהגדלה נמוכה (1,500X) עם מינון אלקטרון להלן דואר 1 - / (מצב חיפוש) ננומטר 2. התמונה לאחר מכן התמקדה בהגדלה גבוהה יותר, את האזור של עניין (מצב מיקוד). רק כאשר תמונה שנרכשה, את תחומי עניין שלו מוקרנים עם מינון גבוה יותר אלקטרונים (מצב חשיפה). כאן, אנו מציגים סקירה של איך לאסוף וcryo-tomograms אלקטרון תהליך, באמצעות הדימרים synthase ATP בקרום המיטוכונדריה הפנימי לדוגמא ירושלים. הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להכין מיטוכונדריה לcryo-ET, כיצד להגדיר אתולאסוף סדרת הטיה עם מנה ספציפית כוללת אלקטרון, וכיצד לעבד את הסדרה להטות להשיג 3D נפח של השטח של עניין. סקירה של ההליך מתואר באיור 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="961">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sucrose</td>
			<td style="width:235px;">ROTH</td>
			<td style="width:119px;">4621.2</td>
			<td style="width:379px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Trehalose</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">HEPES</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Zymolase</td>
			<td style="width:235px;">biomol</td>
			<td style="width:119px;">Z1000.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Density gradient medium</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D1556 or P1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Protein A gold</td>
			<td style="width:235px;">Aurion</td>
			<td style="width:119px;">810.111</td>
			<td>10 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Ethane</td>
			<td style="width:235px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;">P0502S02R0A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:235px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;">I4150RG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Consumables</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Filter paper</td>
			<td style="width:235px;">Whatman, GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">1004 090</td>
			<td>Nr 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tweezers</td>
			<td style="width:235px;">Dumont</td>
			<td style="width:119px;">T506</td>
			<td>Non-magnetic, pattern #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">EM combined test grid</td>
			<td style="width:235px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:119px;">S142</td>
			<td>grapite and gold islands on holey carbon film</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Holey carbon grids</td>
			<td style="width:235px;">Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>R2/2 300 Cu mesh&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cryo grid boxes</td>
			<td style="width:235px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:119px;">160-42</td>
			<td>Alternative home-made metal boxes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Equipment</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Potter</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender</td>
			<td style="width:235px;">Waring</td>
			<td style="width:119px;">8011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glass bead mill - bead beater</td>
			<td style="width:235px;">BioSpec Products</td>
			<td style="width:119px;">1107900-105</td>
			<td>Including 0.5 mm beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ball-bearing (Balch) homogeniser</td>
			<td style="width:235px;">isobiotec</td>
			<td style="width:119px;">H8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:235px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46915</td>
			<td>Sorvall RC6+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glow-discharge apparatus</td>
			<td style="width:235px;">Bal-Tec A.G.</td>
			<td style="width:119px;">CTA 010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Grid vitrification device</td>
			<td style="width:235px;">FEI, Gatan or Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Alternative home-made plunger</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:235px;">FEI or Jeol</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Direct electron detector (CMOS)</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4k x 4k pixels, counted mode</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Charge coupled device</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Energy filter</td>
			<td style="width:235px;">Gatan or Jeol</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Software</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tomogram acquisition software</td>
			<td style="width:235px;">Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tomogram processing software</td>
			<td style="width:235px;">FEI, UCSF or UC-Boulder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Subtomogram averaging software</td>
			<td style="width:235px;">UC-Boulder, or University of Basel</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Tomogram visualisation software</td>
			<td style="width:235px;">UC-Boulder, FEI, or University of Utah</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">visualisation software plugin</td>
			<td style="width:235px;">Goethe university</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Structure visualisation software</td>
			<td style="width:235px;">UCSF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Numerical calculation software</td>
			<td style="width:235px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.mathworks.de/academia/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of atp synthase dimers in mitochondria by electron cryo-tomography

cryo-טומוגרפיה של האלקטרון היא כלי רב עוצמה בביולוגיה מבנית, מסוגל לדמיין את המבנה התל ממדי של דגימות ביולוגיות, כגון תאים, האברונים, שלפוחית ​​קרום, או וירוסים בפירוט מולקולרי. כדי להשיג זאת, המדגם המימית הוא מזוגג במהירות באתאן הנוזלי, השומר אותו ב, מדינה קפוא התייבשות קרובה לילידים. במיקרוסקופ האלקטרונים, סדרת הטיה נרשמת בטמפרטורה של חנקן נוזלי, שממנו tomograms 3D משוחזר. יחס אות לרעש של טומוגרפיה הנפח הוא מטבעו נמוך. תכונות מוכרות, חוזרות משופרות באמצעות מיצוע subtomogram, שבו subvolumes בודד לגזור, מיושר וממוצע כדי להפחית את הרעש. בדרך זו, 3D מפות עם רזולוציה של 2 ננומטר או טוב יותר ניתן להשיג. התאמה של מבנים ברזולוציה גבוהה הזמינים ל3D הנפח ואז מייצרת מודלים אטומיים של קומפלקסי חלבונים בסביבה הטבעית שלהם. כאן אנו מראים כיצד אנו משתמשים cryo-tomograp אלקטרוןHY ללמוד הארגון באתרו של קומפלקסי חלבוני קרום גדולים במיטוכונדריה. אנו מוצאים כי synthases ATP מאורגנים בשורות של הדימרים לאורך קודקודיו מעוגלים מאוד של cristae הקרום הפנימי, ואילו אני מורכב מופץ באופן אקראי באזורי הקרום משני צדי השורות. על ידי מיצוע subtomogram השגנו מבנה של דימר synthase ATP במיטוכונדריה בתוך קרום cristae.

cryo-tomograms אלקטרונים של המיטוכונדריה באופן ברור לחשוף את מורפולוגיה 3D של אברון (איור 2). פילוח ידני של הקרומים בטומוגרפיה נפח ממחיש את המבנה של cristae בmitochondrion. על ידי ההדמיה מיטוכונדריה מזני השמרים נוקאאוט שונים שאין להן מרכיבי חלבון מסוימים, את ההשפעה של חלבונים אלה על מורפולוגיה cristae יכולה על ידי העריכה. איור 3 מציג mitochondrion מזן שמרים חסרי דואר למקטע synthase ATP. רכיב זה של מתחם synthase ATP דרוש לdimerization של synthase ATP במיטוכונדריה. המיטוכונדריה מזן זה חסר cristae שבשבת הרגילה של המיטוכונדריה wildtype (איור 2) ובמקום להכיל מספר תאי קרום הפנימיים. תאים אלה הם גם נטולי cristae או מכילים invaginations הקטן בצורת בלון קרום (איור 3). בtom<html> ograms עם ניגודיות טובה, קומפלקסי חלבוני המיטוכונדריה גדולים, בהדימרים synthase מקרה ATP זה, הם בקלות נראית לעין (איור 4: 1 סרט). המבנים של הקומפלקסים ניתן לקבוע ב2-3 הרזולוציה ננומטר על ידי מיצוע subtomogram (איור 5; סרט 2). הכרכים הממוצע ניתן להציב בחזרה לtomogram כדי להעריך את הארגון של מתחמים בודדים ביחס לזה ולקומפלקסי חלבונים אחרים בקרום (איור 6; סרט 3). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 תרשים זרימה המציג את השלבים של cryo-טומוגרפיה של אלקטרון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> ogether.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 מורפולוגיה של mitochondrion מwildtype S. Cerevisiae. הפרוסה מרכזית באמצעות טומוגרפיה נפח של wildtype ס mitochondrion cerevisiae (משמאל) ומקביל שניתנו משטח נפח (מימין). הנפח המפולח של הקרום החיצוני מוצג באפור והכרכים של הגבול הפנימי וcristae ממברנות בצבע תכלת. מעובד מתוך אל דייויס ואח 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3 mitochondrion מS. מתח cerevisiae חסר מקטע הנדרש לATP dimerization synthase. פורסים באמצעות נפח טומוגרפיה (משמאל) וליווי שניתנו משטח נפח (מימין) של mitochondrion מS. מתח cerevisiae חסר הדואר למקטע חלבון דרוש לdimerization synthase ATP. בהשוואה לאיור 2, mitochondrion מזן המוטציה חסר cristae שבשבת הרגילה של המיטוכונדריה wildtype. במקום זאת, יש לו את mitochondrion רבים תאי קרום פנימי עם או בלי cristae או cristae בצורת בלון. כך אלקטרון cryo-טומוגרפיה מדגישה שינויים במורפולוגיה קרום בשל מחיקות גן. מעובד מתוך אל דייויס ואח 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" width="500" /> Figurדואר mitochondrion .4 מהפטרייה פ anserina. פורסים באמצעות נפח טומוגרפיה (משמאל) ונלווה שניתנו משטח נפח (מימין) של mitochondrion מהפטרייה הסיבית פ anserina. בtomogram זה, שורות של 10 חלקיקי ננומטר (ראשי חץ צהובים) ממוקמות מעל רכסי קרום מעוקלים ביותר בcristae הקרום הפנימי (ראה סרט 1). חלקיקים אלה זוהו כהדימרים synthase ATP על ידי מיצוע subtomogram. מדייויס et al 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" width="500" /> איור מבנה .5 וארגון של synthase ATP במיטוכונדריה. צד ומבט מלמעלה מראה את צפיפות האלקטרונים של דימר synthase ATP מס ג<html> erevisiae כפי שנקבע על ידי מיצוע subtomogram עם מודלים אטומיים מצוידים (משמאל). שלפוחית ​​מיטוכונדריאלי הפנימית קרום מראה את הארגון של הדימרים synthase ATP בשורות (מימין). הדמות נוצרה על ידי מיקום ממוצע subtomogram של דימר synthase ATP לתוך הנפח המפולח של שלפוחית ​​הקרום, באמצעות הקואורדינטות מחושבים בממוצע. מעובד מתוך אל דייויס ואח 8. מודלים אטומי: F 1 / רוטור טבעת [PDB: 2WPD] 39 (כחול וסגול); oligomycin רגיש חלבון OSCP המקנה [PDB: 2BO5] 40 (ירוק); בר גבעול היקפי [PDB: 2CLY] 1 עם שאריות N-מסוף מ[ PDB: 2WSS] 2 (צהוב ואדום) (ראה סרט 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <html> _upload / 51,228 / &quot;width =&quot; 51228fig6highres.jpg 500 &quot;/&gt; איור 6 מבודדות שלפוחית ​​Crista מפ anserina mitochondrion. פרוסות מטומוגרפיה נפח (משמאל) ונלווה שניתנו משטח נפח (מימין) של שלפוחית ​​Crista מפ anserina. צפיפות חלבון הבולטת מהקרום גלויה לעין. הצפיפויות שצוינו על ידי ראשי חץ צהובים הן הדימרים synthase ATP, כפי שזוהו על ידי מיצוע subtomogram. ראשי חץ ירוקים מצביעים על צפיפות זוהתה על ידי תיוג נוגדן כדהידרוגנז NADH (מורכב 1; לפרטים ראו 9). פילוח צפיפות החלבון מגלה הארגון שלהם בcristae, עם הדימרים ATP synthase (האדומים וצהובים) ויצרו שורות לאורך רכסי cristae המעוקלים מאוד ומתחמי דהידרוגנז NADH (הירוק) באזורי הקרום משני צדי השורות (ראה סרט 3). מדייויס et 9 אל.28 51228fig7highres.jpg &quot;target =&quot; / _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. סרט .1 אלקטרונים cryo-tomogram של פ anserina mitochondrion. הסרט מראה פרוסות רצופות באמצעות טומוגרפיה נלקח מmitochondrion מהפטרייה הסיבית פ נפח anserina. שורות של synthase ATP מסומנות על ידי ראשי חץ צהובים. , הנפח המפולח שניתנו המשטח מציג את המיקום של synthase ATP (ספירות צהובות) ביחס למבנה cristae 3D. קרום חיצוני, אפור; קרום פנימי גבול, כחול שקוף; cristae קרומים, כחול אטום. מדייויס et 9 אל. ראה גם באיור 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie1.mp4" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בוידאו.</a> סרט .2 ממוצע Subtomogram של דימר synthase ATP במיטוכונדריה מS. Cerevisiae עם מודלים אטומיים מצוידים. הממוצע היהמחושב מ121 subvolumes. הצפיפות מוצגת בשלוש רמות גובה: 1s - רשת, 2s - אפור ו-3 אור - אפור כהה. מודלים אטומי הותאמו לצפיפות באמצעות שגרת הכושר רציפה בכימרה. מודלים אטומי: F 1 / רוטור טבעת [PDB: 2WPD] 39 (כחול וסגול); oligomycin רגיש חלבון OSCP המקנה [PDB: 2BO5] 40 (ירוק); בר גבעול היקפי [PDB: 2CLY] 1 עם שאריות N-מסוף מ[ PDB: 2WSS]. 2 (צהוב ואדום) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie2.mov" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בוידאו.</a> מעובד מתוך אל דייויס ואח 8. ראה גם באיור 5. סרט .3 מבודדות שלפוחית ​​cristae מפ anserina mitochondrion. פרוסות רצופות באמצעות טומוגרפיה הנפח מוצג, ואחריו המפולח שניתנו משטח הנפח. צפיפות חלבון הבולטת מmembranהדואר גלוי לעין. צפיפויות אדומות וצהובות הן הדימרים synthase ATP. צפיפויות ירוקות הם דהידרוגנז NADH (אני מורכב) כפי שנקבע על ידי תיוג נוגדן. מדייויס et 9 אל. ראה גם באיור 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie3.mpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בוידאו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography at JoVE.com

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

אנו מציגים פרוטוקול של איך לאסוף ואלקטרון תהליך cryo-tomograms של כל המיטוכונדריה. הטכניקה מספקת מידע מפורט לגבי המבנה, תפקוד, והארגון של קומפלקסי חלבוני קרום גדולים בקרומים ביולוגיים מקומיים.

ויזואליזציה של הדימרים synthase ATP במיטוכונדריה על ידי אלקטרונים קריו טומוגרפיה

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

visualization-atp-synthase-dimers-mitochondria-electron-cryo

Research

JoVE Journal

Biology

29.4K Views.  Max Planck Institute of Biophysics.  אנו מציגים פרוטוקול של איך לאסוף ואלקטרון תהליך cryo-tomograms של כל המיטוכונדריה. הטכניקה מספקת מידע מפורט לגבי המבנה, תפקוד, והארגון של קומפלקסי חלבוני קרום גדולים בקרומים ביולוגיים מקומיים. 

Video: Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

ההדמיה confocal של הבזקים בודדים מיטוכונדריאלי Superoxide בלב שלם או<em&gt; בVivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immunodetection של החלבונים בממברנה חיצוניים על ידי cytometry הזרימה של מיטוכונדריה מבודדת

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות בתאים קבועים

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

ויזואליזציה של דחיסת DNA ב כחוליות על ידי מתח גבוה הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...