עבודה זו נתמכה על ידי מענק לח&quot;כ ו BKK מהמרכז הרפואי אליסון קרן. ח&quot;כ הוא רפואי אליסון קרן מלומד חדש הזדקנות. ברצוננו להודות Soumya Kotireddy לסיוע במהלך הצילומים.

חלק 1: הכן זנים וצלחות לניתוח תוחלת החיים replicative סעיף זה מתאר את הכנת לוחות YEPD מוצק לשימוש הניסוי תוחלת החיים replicative והכנת בתאי שמרים לניתוח תוחלת החיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות טכניקה סטרילי המתאים, להכין צלחות אגר YEPD (1% תמצית שמרים, 2% bacto-peptone, אגר 2%, גלוקוז 2%) אשר ישמשו עבור בתאי שמרים culturing ו לניתוח החיים replicative תוחלת. אתה צריך להכין לפחות 2 צלחות לכל 4-5 זנים להיות מנותח בניסוי תוחלת החיים. פלטות צריכים להיות מוכנים לפחות 2 ימים לפני הניסוי תוחלת החיים להתייבש לפני תחילת assay תוחלת החיים. אם הניסוי לא יחל בתוך 4-5 ימי לשפוך את הצלחות, הם צריכים להיות ממוקם בתוך חממה בקירור עטוף parafilm או פלסטיק כדי למנוע dessication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר זני שמרים ממניות קפוא פס עבור מושבות אחת על גבי צלחות אגר YEPD. עד 6 זנים יכול בקלות להיות מפוספס על הצלחת YEPD אותו על ידי חלוקת העוגה לתוך צלחת בצורת פלחי בגודל שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים מן החממה תאים תיקון מהמושבה יחיד על צלחת YEPD טריים. שני תיקונים משתי מושבות שונות צריכה להיות שנוצר עבור כל זן. בשלב זה, זנים כדי להיות מנותח צריך להיות מקודד כדי להבטיח את חיי replicative הניסוי תוחלת מתבצעת &quot;עיוורת&quot;, שם dissectors אינם יודעים את זהותו של זנים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תוקנו, תאים מקודדים ב 30 ° C עד הערב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים תאים קלות תיקון מהמאמץ כל מקודד על צלחות YEPD טריים, אשר תשמש את הצלחות ניסיוני המשמש ניתוח תוחלת החיים replicative. תאים צריכים להיות תוקנו לאורך קו אנכי בצד שמאל של הצלחת YEPD (איור 1). כ 3-5 טלאים לכל צלחת הוא אופטימלי, בהנחה ניתוח תוחלת החיים replicative על 20 תאים כל תיקון. אין צורך (וגם לא רצוי) כדי להעביר מספר גדול של תאים הצלחת YEPD טריים, כמו זה יגרום לתאים לצמוח עבה במהלך הדגירה לילה, אשר עלול להגביל את תוחלת החיים שלהם בעקבות replicative. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות תוקנו טרי לילה על גבי הספסל. </li></ol> חלק 2: תאים מיקום לניתוח החיים replicative תוחלת. בחלק זה אנו מתארים כיצד למקם את התאים השמרים על הצלחת ואיך להשיג לתאי הבת בתולה לניתוח החיים replicative תוחלת. מנקודה זו ואילך, צלחות כל צריך להיות parafilmed, למעט כאשר עובר לנתיחה, על מנת למנוע dessication. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ המצויד במנגנון microdissection מתאים שמרים, להעביר כ 50 תאים מהלחץ תוקנו הראשון עמדה על הצלחת דיסטלי לתאי תוקנו. אם בשלב מיקרוסקופ שלך מדורגת, דרגות אלה יכולים לשמש כדי להבטיח התאים יהיה קל למצוא במהלך חזרות עוקבות. ביום Axioscope Zeiss 40, תאים מן המאמץ תוקנו הראשון יכול להיות ממוקם בבית הקואורדינטות x 90 10 ו ערוכים אנכית משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את המחט של תאים שוב ושוב על ידי נגיעה במשטח אגר, ולאחר מכן ליצור חור אגר על ידי לאלץ את המחט דרך השטח אגר. חור זה ישמש כסמן כדי לכוון אותך על הצלחת במהלך חזרות עוקבות של דיסקציה של התא הסרת בתו. היזהר שלא לקבל תאים שמרים לחור, או שהם יגדלו בצורה המושבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממש מעל החור, ליישר אנכית לתוך תאים בודדים שמרים 20 עמדות מחולקת באופן שווה, עם קוטר מחט 1-3 (~ 100 מיקרומטר) בין העמדה כל תא (איור 1). כל כמה תאים, מקום שני תאים סמוכים זה לזה באותה תנוחה בשורה ולא אחד. זה מאפשר יתירות במהלך בחירת תא בתולה בת, אם אחד התאים הועברו נכשל לחלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין ה 10 ו ה 11 עמדות בקו, ליצור סדרה האופקי של 7-8 חורים אגר. זה ישמש כסמן כדי לכוון אותך על הצלחת במהלך חזרות עוקבות של דיסקציה של התא הסרת בתו. היזהר שלא לקבל תאים שמרים החורים, או שהם יגדלו בצורה המושבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.1-2.4 עבור תיקון זה על הצלחת, ממשיכים התאים במערך אנכי לאורך ציר זהה. צעד עבור 2.2, מספר חורים שנוצרו צריכה להתאים למספר התיקון (חור אחד עבור התיקון הראשון, שני חורים של השני וכו &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאים היו ערוכים על כל תיקון, parafilm את הצלחת לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך כ 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.1-2.6 על כל צלחת בניסוי. </li></ol> חלק 3: השג בת בתולה תאים לניתוח תוחלת החיים בסעיף זה אנו יוזמים את תוחלת החיים על ידי ניתוח להבטיח כי כל תא מתחיל כמו בת בתולההתא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחות מן האינקובטור ולוודא כי רוב התאים ערוכים עברו חלוקת התא. אם נדרש זמן נוסף כדי לאפשר חלוקת התא להסתיים, להחזיר את הצלחת אל האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל התא ערוכים הראשונה, להשתמש במחט לנתק לתאי הבת מן התא על ידי אמו בעדינות הצבת מחט על גבי תאים המצורפת. לפעמים זה מועיל כדי לנצל את הצד של הבסיס מיקרוסקופ בעוד המחט מונח על התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תא הבת מנותקת בקו אנכי, להחליף את תא האם כל התאים בת נוספת להעביר אותם באופן זמני בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.2 ו - 3.3 עבור כל אחד תאים מסודרים. אם התא נכשל לחלק, לקחת תא הבת מאחד התאים מיותר ממוקם בשלב 2.3. בסיום, אתה צריך 20 לתאי הבת עבור תיקון כל מיושרים אנכית על צלחת את תוחלת החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף כל התאים האם לתאי הבת נוסף לערימה ולהעבירם חזרה לשטח ליד התיקונים (&quot;בית הקברות&quot;). חשוב לשמור על תאים לא רצויים בהרבה מהתאים שעברו ניתוח תוחלת חיים כדי למנוע היווצרות של microcolonies ודלדול של חומרים מזינים המקומית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm את הצלחת לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך כ 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.2-3.6 על כל צלחת בניסוי. </li></ol> חלק 4: מדידת קיבולת replicative של תאים בודדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תוחלת החיים גיליונות נתונים. תוחלת החיים של גיליון הנתונים יכול להיות רשת פשוט שבו כל שורה מתאימה לתא אמא הפרט כל עמודה מקבילה לנקודת בגיל (איור 2). לייבל כל גיליון נתונים על פי מספר זנים להיות מנותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחות מן האינקובטור ולוודא כי רוב התאים ערוכים עברו לפחות חלוקת התא. אם נדרש זמן נוסף כדי לאפשר חלוקת התא להסתיים, להחזיר את הצלחת אל האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל התא ערוכים הראשון על הצלחת הראשונה, מבחינה ויזואלית לבחון את התא אמא ובת (ים) ו לקבוע את מספר חלוקות תא שהתרחשו. זה בדרך כלל קל לקבוע כמה תאים הבת לאם הפיק, בהתבסס על תבניות אופייניות של הסדרים התא. רשום את מספר התאים בת המיוצר על ידי תא האם במשבצת המתאימה על גיליון תוחלת החיים ציון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מחט לנתק לתאי הבת מן התא אמא כמתואר בשלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמר את התא אמא בעמדה שלו בקו אנכי ולעבור לתא הבת (ים) באופן זמני בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.3-4.5 לכל אחד התאים ערוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף כל התאים בת זרוקים ולהעביר אותם אל &quot;בית קברות&quot;, הממוקם בסמוך טלאים המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm את הצלחת לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.3-4.8 על כל צלחת בניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים עד 4.2-4.9 כל התאים אמא הפסיקו להתחלק. כמו גיל האם התאים, את התקדמות מחזור התא הופך איטי יותר וזה יהיה רצוי כדי לדגור על צלחת עבור תקופות זמן ארוכות יותר בין גיל נקודות. פלטות ניתן להציב על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג. הנתונים הגולמיים המיוצר על ידי ניסוי תוחלת החיים replicative היא רשימת מספרים המקביל לתאי הבת המיוצר על ידי תא האם בנקודה בגיל זה (איור 2). על ידי סיכום כל שורה של הגיליון את הציון, תוחלת החיים replicative עבור כל תא האם מתקבל. הנתונים עבור תאים אמא של קבוצת הניסוי אותו ניתן ונקווה כדי ליצור עקומת ההישרדות (איור 3A) וכן כדי לבצע חישובים סטטיסטיים, כגון תוחלת החיים כלומר, תוחלת החיים הממוצע, וסטיית התקן. בדיקת אי - פרמטריים, כגון מבחן Wilcoxon דרגה-Sum, ניתן לבצע כדי לקבוע אם הבדלים משמעותיים בתוחלת החיים התגלו בין קבוצות הניסוי. כאשר הניסוי פועל כראוי, עקומת ההישרדות צריך להיות עקבי עם בערך Gompertz-Makeham קינטיקה מראה shap sigmoidal עם תמותה מוקדמת נמוך לאחר ירידה מהירה יחסית הישרדות החוצה השטחת העקום הגילאים מאוחר יותר. רוב wild-type זנים יש תוחלת חיים replicative הערכים בטווח 20-30 הדור, אף מחוץ וריאציה של טווח זה דווחה. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig1.jpg" alt="דמות 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1209/fig1.2.jpg" alt="איור 1.5" /> באיור 1. תרשים של צלחת replicative טיפוסי תוחלת החיים. הערב לפני תחילת microdissection של תאים שמרים, 3-5 זנים הם תוקנו קלות לאורך צד אחד של הצלחת על פני השטח של צלחת YEPD (תיבות אדום) בקו אנכי. בעקבות הצמיחה בין לילה, כ -30 תאים בודדים מתוך כל המתח הם מסודרים במאונך לתוך הקו המכיל 20 עמדות. תוחלת החיים analysiזה יבוצע על תאים v בתולה בת המתקבל תאים אלה הראשונית. תאים עודפים microdissection המתקבל במהלך הניסוי (למשל לתאי הבת לא רצויות) ממוקמים &quot;בית הקברות&quot; (סגלגל אפור), הנמצא הרחק מתאי הניסוי על מנת למנוע דלדול מקומי של חומרים מזינים כמו מושבות נוצרים. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig3.jpg" alt="דמות 2" /> איור 2. תוחלת החיים replicative גיליון מספר הנקודות. נתונים גולמיים ניסוי תוחלת החיים replicative מוצג. כל שורה מקבילה תא שמרים בודד האם כל עמודה מקבילה לנקודת גיל. מספר נכנס בתיבה כל את מספר התאים בת המיוצר על ידי תא האם בנקודה בגיל זה. זן כל תווית עם מספר מקודדים כך הפרט לנתח בתאי שמרים אין ידע על זהותם של זנים להיות מנותח. עשרים תאים assayed עבור כל זן. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig2.jpg" alt="דמות 3" /> איור 3. נציג הישרדות עקומות גדילה של ניסוי תוחלת החיים replicative. (א) עקומות הישרדות מתקבלים על ידי זוממים את החלק היחסי של תאים אמא עדיין בחיים כפונקציה של גיל replicative (מספר חלוקות תא. (ב) עקומות גדילה מתקבלים על ידי התוויית המספר הממוצע של לתאי הבת המיוצר על ידי זן מסוים כפונקציה של נקודה הגיל. בדוגמה זו, זן # 2 ארוך ימים אבל הוא איטי הגוברת, כפי שמעידים המדרון הראשונית מופחת של העלילה את הצמיחה.

<ol>
	<li>Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+yeast+aging.">Recent developments in yeast aging.</a> PLoS Genet. 3, (2007).</li><li>Kaeberlein, M., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of models for human aging. , 109-120 (2006).</li><li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evidence+for+conserved+longevity+pathways+between+divergent+eukaryotic+species.">Quantitative evidence for conserved longevity pathways between divergent eukaryotic species.</a> Genome Res. 18, 564-570 (2008).</li><li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+aging+in+yeast:+the+means+to+the+end.">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29-54 (2008).</li><li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span.">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 113-121 (2008).</li><li>Jiang, J. C., Jaruga, E., Repnevskaya, M. V., Jazwinski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intervention+resembling+caloric+restriction+prolongs+life+span+and+retards+aging+in+yeast.">An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast.</a> Faseb J. 14, 2135-2137 (2000).</li><li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sir2-independent+life+span+extension+by+calorie+restriction+in+yeast.">Sir2-independent life span extension by calorie restriction in yeast.</a> PLoS Biol. 2, E296-E296 (2004).</li><li>Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+NAD+and+SIR2+for+life-span+extension+by+calorie+restriction+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 289, 2126-2128 (2000).</li><li>Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+in+yeast+of+conserved+ageing+genes.">Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes.</a> Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).</li><li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+yeast+replicative+life+span+by+TOR+and+Sch9+in+response+to+nutrients.">Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients.</a> Science. 310, 1193-1196 (2005).</li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0145-17-0 (214530)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto-Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0118-17-0 (211677)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0886-17-0 (288620)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring replicative life span in the budding yeast

הזדקנות היא תהליך ניוונית המאופיינת הידרדרות מתקדמת של רכיבים סלולריים האברונים וכתוצאה מכך התמותה. שמרים ניצני<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; כבר בשימוש נרחב כדי לחקור את הביולוגיה של ההזדקנות, אריכות ימים הקובעים כמה שמרים הוכחו להשתמר אאוקריוטים תאיים, כולל תולעים, זבובים ועכברים<sup&gt; 1</sup&gt;. בשל העדר גיל הקשורים פנוטיפים לכמת בקלות, הזדקנות בשמרים כבר assayed באופן כמעט בלעדי על ידי מדידת אורך החיים של תאים בהקשרים שונים, עם שתי פרדיגמות שונות תוחלת החיים השימוש הנפוץ<sup&gt; 2</sup&gt;. תוחלת החיים כרונולוגית מתייחס למשך הזמן כי תא האם יכול לשרוד במצב הלא חלוקת קפאון דמוי, והוא הציע לשמש מודל עבור הזדקנות שלאחר mitotic תאים אאוקריוטים רב תאיים. תוחלת החיים replicative, לעומת זאת, מתייחס את מספר התאים בת המיוצר על ידי תא האם לפני הזדקנות, והוא נחשב לספק מודל של הזדקנות תאים פעילים mitotically. כאן אנו מציגים פרוטוקול כללית למדידת replicative תוחלת החיים של תאים אמא נבגי שמרים. המטרה של assay תוחלת החיים replicative הוא לקבוע כמה פעמים כל תא ניצנים אמא. התאים אמא ובת יכול להיות מובחן בקלות על ידי חוקר מנוסה באמצעות מיקרוסקופ אור רגיל (הכולל הגדלה 160X), כגון Axioscope Zeiss 40 או דגם אחר להשוואה. הפרדה פיזית של תאים מתאי הבת אמא מושגת באמצעות micromanipulator ידני מצויד במחט סיבים אופטיים. זני שמרים אופייני במעבדה לייצר תאים בת 20-30 לכל אמא אחת תוחלת החיים הניסוי דורש 2-3 שבועות.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast at JoVE.com

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

במאמר זה אנו מציגים את פרוטוקול כללי למדידת חיים replicative טווח של תאים אמא שמרים.

מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

measuring-replicative-life-span-in-the-budding-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

20.6K Views.  University of Washington. במאמר זה אנו מציגים את פרוטוקול כללי למדידת חיים replicative טווח של תאים אמא שמרים.

Video: Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח על מדיה מוצק

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

כימות כרונולוגי שמרים תוחלת החיים על ידי תולדה של תאים בני

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 Magnetosome חלבון Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

מדידת קינטיקה של שעתוק mRNA בתאים חיים יחיד

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

מדידת אוסמוטי המים החדירות מקדם (P<sub&gt; F</sub&gt;) של תאים כדוריים: Protoplasts צמח מבודד כדוגמה

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.