Name: a three-dimensional spheroid model to investigate the tumor-stromal interaction in hepatocellular carcinoma
Uploaded: 2021-09-30T13:30:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma at JoVE.com

MYWZ由商业，能源和工业战略大臣和2020年牛顿奖资助，作为英国官方发展援助"ODA"和牛顿基金的一部分。SS由英国癌症研究中心高级临床科学家奖学金C53575 / A29959支持。SS，FO和HR作为HUNTER的一部分获得资金，由英国癌症研究中心，AIRC基金会和Fundacion Cientifica de la Asociacion Espanola Contra el Cancer合作资助。

1. 细胞制备
<ol><li>在II类层流微生物安全柜中的无菌条件下进行所有实验（见 材料表）。<ol>
<li>打开引擎盖并允许稳定气流。</li>
		<li>用70%乙醇彻底喷洒内部引擎盖表面，以消除以前用户可能造成的任何污染。</li>
		<li>在500 mL玻璃烧杯中制备5%的消毒剂溶液。弃去溶液内的任何细胞上清液或细胞碎片。</li>
		<li>用70%乙醇彻底清洁所有微量移液器和吸头盒。</li>
	</ol>
</li>
	<li>通过将Dulbecco的改性Eagle培养基（DMEM）高葡萄糖培养基补充10%热灭活胎儿牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素（100单位/ mL青霉素和100μg/ mL链霉素）和2mM L-谷氨酰胺来制备新鲜细胞培养基。对于LX2肝星状细胞系，将FBS补充剂的浓度降低到2%。</li>
	<li>在开始实验之前加热培养基。</li>
	<li>将Huh7和Hep3B HCC肿瘤细胞系以及COS7和LX2成纤维细胞系从液氮中的储存架中取出。快速解冻冷冻保存的细胞。</li>
	<li>用2 mL新鲜培养基稀释解冻的细胞。在室温下以200× g 离心细胞4分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于1mL新鲜温热培养基中。</li>
	<li>在T75细胞培养瓶中播种细胞。将细胞在细胞培养箱中孵育5%CO 2 ，在37°C的95%湿润条件下，直到细胞达到60%-70%汇合度。</li>
</ol>2. 细胞采集
<ol><li>吸出培养基并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞三次。</li>
	<li>加入2 mL预热的1x胰蛋白酶，将贴壁细胞从T75烧瓶底部分离。在培养箱中在37°C孵育4分钟。</li>
	<li>通过加入4mL完整培养基使胰蛋白酶失活。收集细胞悬浮液并在室温下以200× g 离心细胞4分钟。弃去上清液并将细胞重悬于4mL新鲜培养基中。</li>
</ol>3. 细胞计数
<ol><li>轻轻涡旋细胞悬浮液，以确保细胞在离心管中的均匀分布。</li>
	<li>使用10μL移液器，将10μL细胞悬浮液与10μL台盼蓝混合。轻轻地上下移液混合物四次，以确保用染料完全染色外细胞表面。</li>
	<li>使用血细胞计数器计数细胞数量。<ol>
<li>首先，在加载染色的细胞悬浮液之前，在血细胞计数器计数区域上放置盖玻片。</li>
		<li>将含有细胞悬浮液的移液器尖端放入血细胞计数器的V形槽中。轻轻地将笔尖内容物排出到计数幻灯片中。</li>
		<li>将浆料静置几分钟，然后将其固定在显微镜载物台上进行细胞计数。 注意：为避免重复计数，请仅对大正方形两侧的单元格进行计数。</li>
		<li>在与顶部或右侧规则重叠的单元格中计数，并避免与底部或左侧规则重叠的单元格。</li>
	</ol>
</li>
	<li>计算单元格的总数。 注意：每毫升细胞数= <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq01.jpg">
</li>
</ol>4. 成纤维细胞条件培养基（CM）的收集
<ol><li>吸出培养基并用PBS洗涤LX2细胞三次。</li>
	<li>加入2 mL预热的1x胰蛋白酶，将贴壁细胞从T75烧瓶底部分离。将烧瓶在37°C下在培养箱中孵育4分钟。</li>
	<li>通过加入4mL完整培养基使胰蛋白酶失活。收集细胞悬浮液并在室温下以200× g 离心细胞4分钟。按照步骤 3 对单元格进行计数。</li>
	<li>在37°C下将1 x 10 6 LX2细胞接种在10 cm 3 培养皿中48小时。</li>
	<li>48小时后收集成纤维细胞CM。在室温下以200× g 离心4分钟以沉淀任何漂浮的细胞。使用固定在20 mL注射器底部的0.22μm过滤器无菌过滤CM。</li>
	<li>收集上清液CM，将CM等分到2 mL管中并储存在-80°C以备进一步应用。 注意：该溶液可以在-80°C下储存6个月。</li>
</ol>5. 验证细胞密度以获得完美的球体
<ol><li>吸出培养基并用PBS洗涤HCC细胞系三次。</li>
	<li>加入2 mL预热的1x胰蛋白酶，将贴壁细胞从T75烧瓶底部分离。在培养箱中在37°C孵育4分钟。</li>
	<li>通过加入4mL完整培养基使胰蛋白酶失活。收集细胞悬浮液并在室温下以200× g 离心细胞4分钟。</li>
	<li>按照步骤 3 对单元格进行计数。</li>
	<li>在培养皿10 cm 3盖子的内表面上的20μL培养基中，从肿瘤细胞系（12000，6000，3000 ，1500，1000，750，500，250和125个细胞）中移取不同密度的培养基。</li>
	<li>向培养皿底部加入10 mL无菌PBS，为球体形成过程提供潮湿的条件。</li>
	<li>倒置10 cm3 培养皿的盖子，以使包括细胞悬浮液在内的培养基悬挂在潮湿的环境中。将悬挂的液滴放置3天。</li>
	<li>悬挂原始液滴3天后，使用倒置显微镜以50倍放大倍率拍摄球体的图像。</li>
</ol>6. 异型肿瘤/基质球体
<ol><li>将1500个Huh7 HCC细胞与1500个COS7哺乳动物成纤维细胞（1：1比例）悬浮在悬挂的液滴中以形成球体。将10毫升无菌PBS添加到培养皿底部，为球体提供潮湿的条件。</li>
	<li>倒置10 cm3 培养皿的盖子，以使包括细胞悬浮液在内的培养基悬挂在潮湿的环境中。将悬挂的液滴放置3天。</li>
	<li>从培养的第3天到第10天，使用倒置显微镜拍摄球体的图像。<ol>
<li>将10 cm3 培养皿放在显微镜载物台上。将显微镜的放大倍率调整为所有球体的50倍。</li>
		<li>打开所连接计算机上的显微镜软件并调整其焦点，以获得每个旋转椭球体的清晰图像。使用显微镜软件上的 捕获工具 保存获取的照片。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. LX2 CM中的同型Hep3B球体
<ol><li>将3000个Hep3B HCC细胞悬浮在悬挂的液滴中以形成球体。将10毫升无菌PBS添加到培养皿底部，为球体提供潮湿的条件。</li>
	<li>倒置10 cm3 培养皿的盖子，以使包括细胞悬浮液在内的培养基悬挂在潮湿的环境中。将悬挂的液滴放置3天。</li>
	<li>将Hep3B球体转移到悬挂液滴中来自LX2细胞的20μL新鲜CM中。 注意：在球体转移过程中使用无菌高压灭菌的未过滤200μL移液器吸头，以避免对形成的球体造成任何破坏或伤害。这也是为了消除任何未附着在主单球体上的残留细胞。<ol>
<li>使用高压灭菌的20μL移液器进行转移过程。将移液器体积调节至2 μL，将移液器吸头连接到移液器上。</li>
		<li>倒置形成球体的10 cm3 培养皿的盖子。将盖子固定在光学显微镜的载物台上。调整显微镜的精细焦点，使每个球体可见。</li>
		<li>按下柱塞按钮，小心地清空微量移液管中的空气。将移液器吸头插入要转移的液滴（包括球体）中。非常接近椭球体，而不用尖端触摸它。</li>
		<li>轻轻释放柱塞按钮上的压力，使球体在2μL培养基中吸入微量移液器尖端。</li>
		<li>将球体转移到悬挂在新的10 cm3 培养皿上的新液滴中，具有新的培养基/条件培养基/处理。 注意：使用光学显微镜确保将所有球体成功转移到新的10 cm3 培养皿中。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用倒置显微镜从转移当天（第3天）到LX2 CM培养的第7天，以50倍放大倍率拍摄球体的图像。</li>
</ol>8. 球体体积的计算
<ol><li>为每个旋转椭球体分配一个唯一的数字标识符，以便每天可以捕获来自匹配旋转椭球体的图像。</li>
	<li>使用图像分析软件包分析生长的旋转椭球体的图像。<ol>
<li>打开软件包中的每个旋转椭球体映像。使用 手绘 选择工具并勾勒出每个旋转椭球体的轮廓。从 "分析 "下拉按钮中，选择" 设置度量值"，然后选择" 面积"。按 确定。</li>
		<li>在每个旋转椭球体周围手动绘制一个圆圈。球体圈成圆圈后，按 Ctrl + M 允许程序计算以像素为单位的旋转椭球体面积。将旋转椭球体的面积转换为体积。 注：球体体积mm3 =0.09403 × <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq02.jpg">
</li>
		<li>计算图像捕获第一天球体体积相对于其体积的变化。 注意：这是为了将球体体积归一化为起始体积，并在给定起始尺寸的自然变化的情况下提高精度。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

FO是Fibrofind Limited的董事和股东。

实验细胞系生长的环境会影响其基因表达谱、通路分析和功能标准。例如，在乳腺癌细胞中，只有当癌细胞以3D构象生长时，不同致癌途径之间的协调才会保留27。3D黑色素瘤和乳腺癌球体中的失调基因，但不是单层细胞中的基因，与 体内 人类肿瘤更相关28，29。例如，乳腺上皮细胞和肿瘤对应物中的β1整合素水平低于2D格式生长的水平29。此外，与在塑料上培养的成纤维细胞相比，3D结构中的成纤维细胞在形态和速度方面倾向于明显迁移30。此外，生长底物的机械刚度激活特定途径， 通过 对上皮细胞中细胞外信号调节激酶（ERK）/Rho的去调节来促进正常上皮细胞的恶性转化31。这些因素有利于从传统2D培养到3D球体模型的过渡，因为3D培养更符合人类疾病。
目前的研究使用传统的实验室工具和用品来制作3D肿瘤球体模型。形成的球体对来自成纤维细胞的增殖信号作出反应，如它们显着增加的生长所示。该模型属于多细胞肿瘤球体类别。3D肿瘤球体还有其他三类，包括肿瘤球体32，组织衍生肿瘤球体33，34和组织型多细胞球体35。在多细胞肿瘤球体中，肿瘤细胞悬浮在低粘附条件下，使它们聚集在一起形成球体，而不会接触培养容器的底部36。已经采用了几种方法来提供这种与锚固无关的技术，包括旋转系统，液体覆盖技术和无涂层的超低附着U形板37。在HCC中，大多数 体外 球状体培养物使用超低附着的24孔或96孔板形成圆形球体18，19，20，21，22。然而，这种技术不具有成本效益，并且不排除任何意外的电池 - 塑料接触。其他系统使用经孔23 或肝脏切片12 来产生肝脏微组织。在转化工作中使用人体组织是黄金标准，但许多研究小组并不总是可用或可访问的。目前的方法受益于悬挂液滴理论。加入细胞悬浮液，使肿瘤球体在可接近的液态空气界面中形成形成单个圆形球体38。使用这种技术的优点是没有任何细胞 - 塑料接触，并且易于研究肿瘤和成纤维细胞之间的自分泌和旁分泌串扰。该模型在另一项研究中得到进一步验证，该研究破译了非实质TREM2在保护肝脏免受HCC发展方面的重要性39。这项工作表明，与以Wnt依赖性方式过度表达的TREM2 CM相比，控制LX2 CM中Hep3B和PLC / PRF5球体的体积更高39。
在目前的研究中，成纤维细胞在球体形成之前与肿瘤细胞混合，以研究这种共培养的增殖影响。其他人在形成肿瘤球体后添加了成纤维细胞，内皮细胞和具有肿瘤细胞悬浮液的免疫细胞，以研究基质细胞迁移到肿瘤中40，41。目前的异型球体模型显示出与先前报道的模型和原始 体内 肿瘤相似的生长模式;球状体呈指数增长，随后出现延迟生长阶段，很可能是由于营养物质的消耗和坏死性核心的扩大42。这项研究没有添加生长因子和有丝分裂原来帮助球体形成，而是使用了一种更生理的方法，使这些生长因子与成纤维细胞或其分泌组直接接触成纤维细胞CM。值得一提的是，LX2细胞可以通过用TGFβ1或PDGF43治疗来进一步激活。LX2细胞已用10 ng / mL TGFβ1处理48小时，然后除去培养基以进行不同的实验设置。用PBS洗涤LX2细胞三次（以排除任何直接的TGFβ1效应），然后在收集CM之前再加入新鲜培养基24小时。从TGFβ1刺激的LX2收集的CM诱导Hep3B球体的生长速度高于对照LX2的CM（数据未显示）。这种灵活的系统可以用于不同癌细胞加/减成纤维细胞的共培养，以及患者来源的系。它还可以为药物提供中等通量筛选测定，这些药物可以快速采用并插入转化药物发现管道中，为 体内 研究的剂量提供信息。
目前研究的局限性是在球体形成中使用永生化的细胞系，而不是新分离的HCC肿瘤细胞和癌症相关成纤维细胞。另一个限制是比较来自LX2的CM和新鲜培养基而不是来自其他非成纤维细胞系的CM之间的同型Hep3B球体的生长。后一种限制可以通过对成纤维细胞中感兴趣的基因进行遗传修饰来解决，然后将来自野生型与基因工程成纤维细胞的CM应用于同型球体。

肝癌的全球发病率和死亡率继续增加，尽管肝病和大多数其他类型的癌症的治疗取得了进展。2018年，肝癌超过结直肠癌和胃癌，成为全球癌症相关死亡的第二大常见原因1。2020 年，新增确诊病例超过 9，00，000 例，占全球癌症病例总数的 4.7%1。这尤其令人失望，因为肝癌（最常见的肝癌形式）发展的重要危险因素具有良好的特征2。肝硬化是肝细胞癌发展的最常见危险因素，80% 的病例是在已确诊肝硬化的背景下发生的2。慢性肝病，进展为肝硬化，从而包括肝癌病毒（HBV），丙型肝炎病毒（HCV），酒精相关性肝病（ARLD），非酒精性脂肪性肝病（NAFLD） - 后者归因于肥胖和2型糖尿病（T2DM）2，3。目前HCC的管理方案与阶段相关，并且仅限于晚期癌症患者，他们通常预后较差4。使用激酶抑制剂取得了重大进展，最近，免疫肿瘤学治疗虽然现实上只使少数晚期肝癌患者受益5。此外，人们担心，在NAFLD患者中产生的HCC（增长最快的根本原因，占西方国家新诊断的HCC病例的50%以上）可能对程序性死亡1（PD1）检查点抑制剂治疗更具耐药性6。
在HCC患者的临床试验方面进行了大量投资，包括临床试验及其终点的显着改进7。经过十年的失败，这些投资已经开始改变患者的机会。然而，现实情况是，响应者的总体比例仍然相对较低，招募参加试验的患者通常代表那些在诊所接受治疗的患者。危险在于，这些进步代价高昂，使少数人受益，而不是多数人。随着越来越多的候选疗法出现，一次性使用或联合使用，必须有临床前模型更能预测体内反应。这些模型可能包含其他因素，这些因素有助于患者反应中的变异性，从而更好地反映人类HCC异质性和病理复杂性8。需要重建HCC体内病理生理学条件的系统来帮助了解肿瘤进化，生长和进展的生物学。现有的慢性肝病和肝细胞癌实验模型通常分为三大类：体内动物模型（回顾于9），体外培养10和离体11，12模型。基于动物的方法被广泛用于研究慢性肝病，包括HCC;然而，遗传变异性，高运行成本以及物种之间不同的免疫系统是应用此类模型的主要限制9。虽然与其他体外细胞系模型相比，一些离体模型为关注人体组织提供了一种极好的工具，但组织可用性和有限的实验时间过程阻碍了它们的大规模利用。
另一方面，对于资源有限的科学家来说， 体外 细胞系模型仍然是一个不错的选择，对新鲜人体组织的持续供应的需求较小10。这些模型还提供了一种工具，可以用作第一个筛选，以帮助在进行更复杂的 体内 模型之前对药物选择进行靶向验证。最近将传统的2D单层培养物修改为3D培养物，提高了这些 体外 模型的功效13，14。
3D 体外 模型可以概括在人类正常和病理条件下看到的关键特征。在生理条件下，信号转导通过细胞串扰和与其它结缔组织分子（即细胞外基质（ECM）蛋白）的相互作用而启动，形成3D相互作用网络15，16。肿瘤在恶性转化过程中以3D球形形式进化，其氧气和营养物质在非肿瘤/肿瘤间期中很容易丰富。同时，缺氧条件在肿瘤核心占主导地位。营养可用性的这种异质性导致空间上不同的信号传导和代谢途径的激活，从而调节肿瘤发生。这些条件在传统的2D单层培养物14中很难概括，其中细胞以生理上不相关的方式在僵硬的培养塑料上生长。癌细胞还与其他非实质细胞通信，这是肿瘤微环境中ECM，生长和侵袭信号传导的主要来源。与2D培养物不同，3D 体外 模型可以为研究这种肿瘤 - 基质相互作用提供更合适的平台17。
3D模型广泛用于HCC领域，它们在微组织的形成方式上有所不同18，19，20，21，22，23。这些模型中的大多数在球体形成过程中使用超低结合板18，19，20，21，22或跨孔23。所描述的方案介绍了悬挂液滴技术作为替代，无塑料且具有成本效益的体外3D肿瘤球体模型。这可能有助于以3D格式评估成纤维细胞对肿瘤细胞增殖的旁分泌和自分泌作用。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59429C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>Biorender.com</td>
			<td>Online</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II laminar flow BioMAT2 hood</td>
			<td>Medair Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>M-D1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel sofware</td>
			<td>Microsoft office 365</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism sofware</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat deactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>life tech</td>
			<td>105000064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (100 unit/ml penicillin and 100 &#956;g/ml streptomycin)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 90 mm, triple vented</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon&#8482; Broad Spectrum Disinfectant, 5kg Bucket</td>
			<td>Rely+On&#8482;</td>
			<td>SCI-129999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziess inverted microscope</td>
			<td>Ziess</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional spheroid model to investigate the tumor-stromal interaction in hepatocellular carcinoma

对于晚期肝细胞癌（HCC）（肝癌的主要形式），其侵略性和缺乏耐受性良好且广泛有效的治疗方法，使其成为癌症相关死亡的第二大常见原因。临床前模型需要进行调整，以概括人类条件，为临床开发选择最佳治疗候选药物，并帮助提供个性化医疗。三维（3D）细胞球体模型有望成为二维（2D）单层培养物 的新兴体外 替代品。在这里，我们描述了一种3D肿瘤球体模型，该模型利用了单个细胞在悬浮液滴中保持时聚集的能力，并且比标准单层更能代表 体内 环境。此外，3D球体可以通过组合同型或异型细胞来产生，更能反映 体内细胞异质性，从而有可能研究可能影响进展和治疗反应的环境相互作用。目前的研究优化了细胞密度，通过固定标准10 cm3 培养皿的盖子上的细胞悬浮液来形成3D同型和异型肿瘤球体。进行纵向分析以生成同型与异型肿瘤/成纤维细胞球体的生长曲线。最后，研究了成纤维细胞（COS7细胞）和肝脏肌成纤维细胞（LX2）对同型肿瘤（Hep3B）球体的增殖影响。3，000个细胞（在20μL培养基中）的接种密度成功产生了Huh7 / COS7异型球体，其尺寸稳定增加至培养日8，随后生长迟缓。使用在LX2（人肝星状细胞系）条件培养基（CM）中培养的Hep3B同型球体证实了这一发现。与对照肿瘤球体相比，LX2 CM触发了Hep3B球体的增殖。总之，该协议表明，3D肿瘤球体可以作为一种简单，经济和预筛选 的体外 工具，以更全面地研究肿瘤 - 基质相互作用。

以多层3D格式培养的细胞比传统的2D培养物更准确地反映肿瘤微环境的复杂性24，25。以前，许多研究已经用不同的丝裂原和生长因子26 补充了球体培养基，以启动球体形成。然而，在这项研究中，添加成纤维细胞或其CM提供了必需的丝裂原和生长因子来加速球体生长。
图1描述了一项试点研究的数据，其中Huh7人HCC细胞在20μL新鲜培养基中以从12，000到125个细胞的下降接种密度接种3天。12，000个细胞的接种密度产生了形状不对称的球体，即使在将细胞接种密度减半后也无法校正。然而，由3000个细胞创建的球体看起来更圆润（图1，上行）。细胞浓度的进一步降低既没有成功形成单个球体（125，250，500个细胞密度球体），也没有规则的球形外观（1000和1500个细胞密度球体）。值得一提的是，许多小球体以500个肿瘤细胞的密度形成;但是，在50倍放大倍率下只捕获了一个小的旋转椭球体（图1，上行）。将相同的优化方案应用于COS7灵长类肾成纤维细胞系（图1，中间行）。将125，250和500 COS7成纤维细胞悬浮在20μL悬挂液滴中导致一个圆形球体具有多个较小的球体，而更高的细胞密度（1000，1500和3000）形成单个半圆形球体。与Huh7肿瘤球体类似，较高的细胞悬浮液（6，000和12，000个细胞/球体）导致形成不规则的细胞聚集体，因此丢弃了较高的细胞浓度（图1，中间行）。低密度的Huh7 / COS7异型细胞悬浮液（125，250和500个细胞/球体）产生具有多个浮动或半连接球体的单个球体（图1，底排）。1000和1500个细胞的异型球体是半圆形的，而3000个细胞（每种细胞类型1500个）的接种密度给出了一个圆形的3D球体。如前所述，较高的细胞密度导致聚集体的形成，而不是明确定义的球体（图1，底行）。总之，3000个细胞密度的球状体被圆形化，类似于人类HCC肿瘤，并被调整为进一步的实验。将细胞悬浮液培养为悬挂的液滴3天足以促进球体的形成。
在当前背景下优化球体形成的最佳细胞浓度和时间点后，纵向评估了共培养肿瘤和成纤维细胞系的增殖影响。 图2 和 图3 显示了从第3天到第10天监测的Huh7 / COS7异型球体（每个球体3000个总细胞数）。同型Huh7和COS7球体（各1500个细胞）作为对照。从第4天开始，与同型球体相比，异型椭球体以理想的圆形生长（图2）。异型椭球体的初始体积大于每个同型椭球体的初始体积。球体的生长计算为在球体形成之日其体积相对于初始体积的变化，以避免球体体积的正常变化（第3天， 图3）。异型球体最初从第4天到第7天显示出快速生长阶段，然后在第8天显示出较慢的生长阶段（图2，上行和 图3）。球体体积在第9天和第10天减少，可能反映了营养物质的消耗或缺氧的核心和细胞死亡。
相比之下，同型Huh7和COS7球体以更慢的速度增长（图2，中间和底部行; 图 3）。同型球体表现出相对静态的生长曲线，直到培养的第五天（球体形成后两天）。从第6天开始，同型球体开始显示出其生长曲线的逐渐增加，尽管其速度明显低于异型球体（图3）。总之，肿瘤/成纤维细胞异型球体的生长速度高于同型球体，这表明肿瘤细胞和成纤维细胞的直接接触增加了肿瘤球体的大小。
最后，为了验证上述发现并研究间充质细胞在肝脏相关背景下对HCC球状体增殖的旁分泌影响，在常规新鲜培养基或来自LX2肝星状细胞的CM（图4和图5）中生长3天的同型Hep3B HCC球状体（图4 和 图5） 4天。乍一看，3000个Hep3B细胞在3天后形成了完美的圆形球体（图4）。Hep3B球体从第3天到第7天在新鲜培养基中显示出持续增殖（图4，上排）。当Hep3B球体保持在LX2 CM中时，生长速率增强（图4，下行）。从实验第4天到实验结束，Hep3B球体生长中的这种培养基依赖性转化表现出统计学意义（图5），表明成纤维细胞驱动的肿瘤球体增殖。
总之，本研究成功地修改了现有的3D球体培养物，以利用HCC肿瘤细胞与不同成纤维细胞系之间的串扰，并研究这种直接和间接细胞相互作用的增殖意义（图6）。需要进一步表征形成的球体，以改善肿瘤细胞与周围微环境的相互作用。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig01.jpg"> 图1：优化球体形成的最佳细胞密度。 列表示不同的细胞接种密度，行表示由Huh7细胞（顶行），COS7细胞（中间行）和Huh7 / COS7异型细胞（底行）形成的球体。图像表示将125，250，500，1000，1500，3000，6000和12000个细胞（从左到右）悬浮在20μL培养基中3天后形成的球体。试点研究包括每个条件两个旋转椭球体，图像是在50倍放大倍率下拍摄的，比例尺= 200μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig01large.jpg" target="_blank">。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig02.jpg"> 图2：异型与同型球体生长。 列表示拍摄旋转体图像的日期，行显示由 Huh7 细胞（顶行）、COS7 细胞（中间行）和 Huh7/COS7 细胞（下行）形成的球体的代表性图像。这些图像代表了从左到右从左到右的不同时间点的每种条件（同型Huh7，COS7或Huh7 / COS7异型球体）悬浮3000个细胞后形成的球体。该实验包括每个条件的10个旋转椭球体，图像以50倍放大倍率拍摄，比例尺= 200μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig02large.jpg" target="_blank">。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig03.jpg"> 图3：异型与同型球体生长的纵向分析。 该图显示了异型Huh7/COS7球体与同型Huh7和COS7球体的生长曲线。数据以平均值表示±s.e.m;n = 10 个独立的旋转椭球体。** p < 0.01;p < 0.001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig04.jpg"> 图4：LX2 CM中同型Hep3B球体的生长。 列表示捕获旋转体图像的日期，行显示在新鲜DMEM培养基（顶行）或LX2 CM（下行）中培养的Hep3B球体的代表性图像。该实验包括每个条件（新鲜介质或LX2 CM）的七个球体，并以50倍放大倍率拍摄图像，比例尺= 200μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig04large.jpg" target="_blank">。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig05.jpg"> 图5：同型Hep3B球体生长的纵向分析。 该图显示了Hep3B球体在新鲜DMEM培养基或LX2 CM中的生长曲线，数据以平均值±表示.m;n = 7 个独立的旋转椭球体。p < 0.001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig06.jpg"> 图 6：球体形成过程的示意图。将细胞悬浮液移液在10cm3培养皿的内盖上。盖子倒置并保持3天，以允许同型或异型球体形成。旋转椭球体图像以50倍放大倍率拍摄。该图是使用基于Web的科学插图工具创建的（参见材料表）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

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A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

缺乏能够忠实地概括相关人类疾病的综合 体外 模型。目前的研究提出了三维（3D）肿瘤球体的创建和培养，这是一种可靠的 体外 工具，用于研究人肝细胞癌中的肿瘤 - 基质相互作用。

一种三维球体模型研究肝细胞癌肿瘤-基质相互作用

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

3D肿瘤球体已经取代了传统的2D单层技术，成为体外癌症研究的黄金标准。这些模型允许多种细胞类型的共培养，这些细胞类型反映了肿瘤微环境的异质性，并允许利用空间相互作用。使用悬挂液滴方法生成3D球体的优点是缺乏细胞 - 塑料相互作用并且易于研究肿瘤细胞与非肿瘤细胞之间的相互作用。该技术还为模拟肿瘤 - 基质相互作用提供了一种可重复且具有成本效益的方法。3D类肿瘤是有价值的临床前模型，通常用作药物筛选工具。该方法可用于研究多种化合物对肿瘤生长和周围微环境的药理作用。球体形成过程是用户友好的，需要传统的细胞培养实验室设备。可以使用任何台式倒置光学显微镜对旋转椭球体进行成像，并且可以使用广泛使用的在线图像分析软件进行旋转椭球体大小和形状的分析。首先，从液氮中的储存架中取出Huh7和Hep3B HCC肿瘤细胞系以及COS-7和LX2成纤维细胞系并快速解冻。解冻后，用两毫升新鲜培养基稀释解冻的细胞。离心细胞。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于一毫升新鲜温热培养基中。然后将细胞接种在T75细胞培养瓶中，并在细胞培养箱中孵育，直到细胞达到60至70&汇合度。对于细胞收集，吸出培养基并用PBS洗涤细胞三次。然后，为了将贴壁细胞从烧瓶底部分离，加入两毫升预热的胰蛋白酶并在37摄氏度下孵育。四分钟后，通过加入四毫升完整培养基灭活胰蛋白酶并收集细胞悬浮液，然后离心细胞并弃去上清液，然后将细胞重悬于一毫升新鲜培养基中。最后，再加入三毫升新鲜培养基。要计数细胞，轻轻涡旋细胞悬浮液。然后使用10微升移液管，将10微升细胞悬浮液与10微升台盼蓝混合，并轻轻地上下移液混合物四次，以确保用染料完全染色外细胞表面。接下来，在血细胞计数器计数区域放置盖玻片。然后将含有细胞混合物的移液器吸头放在盖玻片的边缘旁边，并将吸头内容物轻轻地排出到计数载玻片中。等待几分钟让浆液沉降后，将血细胞计数器固定在显微镜载物台上，并计数与顶部或右侧裁决重叠的细胞，同时避免与底部或左侧裁决重叠的细胞。最后，使用此公式计算单元格的总数。吸出培养基后，用PBS洗涤LX2细胞三次。如前所述，使用胰蛋白酶分离细胞并离心它们。如前所述对细胞进行计数后，在10立方厘米培养皿中接种10至第六个LX2细胞，并在37摄氏度下孵育。48小时后，收集成纤维细胞调节的培养基并离心以沉淀任何漂浮的细胞。过滤器使用连接到20毫升注射器的0.22微米过滤器对调节介质进行灭菌。然后将培养基等分到两毫升管中，以储存在零下80摄氏度。将10毫升无菌PBS添加到10立方厘米培养皿的底部，为球体提供潮湿的条件。然后将1， 500个HuH7 HCC细胞与1， 500个COS-7哺乳动物成纤维细胞悬浮在悬挂的液滴中以形成球体。倒置培养皿的盖子，使培养基（包括细胞悬浮液）悬挂在潮湿的环境中。三天后，要拍摄球体的图像，请将培养皿放在倒置显微镜的载物台上，并将放大倍率调整为五倍。接下来，打开所连接计算机上的显微镜软件并调整其焦点以获得每个旋转椭球体的清晰图像。然后使用显微镜软件上的捕捉工具获取图像并保存获取的图片。将10毫升无菌PBS添加到10立方厘米培养皿的底部。然后将3， 000个Hep3B HCC细胞悬浮在悬挂的液滴中以形成球体并倒置培养皿的盖子，使液滴在潮湿的环境中悬挂三天。接下来，将Hep3B球体转移到悬挂液滴中来自LX2细胞的20微升新鲜条件培养基中。然后翻开形成球体的培养皿的盖子，并将盖子固定在光学显微镜的载物台上。如前所述，调整显微镜的精细焦点以使每个球体可见。按下柱塞按钮小心地清空微量移液器中的空气后，将移液器吸头插入含有要转移的球体的液滴中。非常接近椭球体，而不用尖端触摸它。接下来，轻轻释放柱塞按钮上的压力，以使球体在两微升介质中吸入微量移液器尖端。然后将球体转移到挂在新的10立方厘米盘子上的新液滴中。使用倒置显微镜以五倍放大倍率拍摄球体的图像，从转移当天到LX2条件培养基中培养的第七天。要分析生长中的旋转椭球体的图像，请在图像分析软件中打开每个旋转体图像，并使用手绘选择工具勾勒出每个旋转椭球体的轮廓。然后从分析下拉按钮中，选择设置测量值，然后选择面积并按确定。接下来，在每个旋转椭球体周围手动绘制一个圆，一旦球体被圈出，按 Control M 以允许程序计算以像素为单位的旋转椭球体面积。然后使用此公式将旋转椭球体的面积转换为体积。最后，计算在图像捕获的第一天，球体体积相对于其体积的变化。在优化球体形成的细胞密度期间，12， 000和6， 000个细胞的较高接种密度产生具有不对称形状的球体，而3， 000个细胞的接种密度产生完美的圆形3D球体。因此，3， 000个细胞密度球体被调整用于进一步的实验。对共培养肿瘤和成纤维细胞系增殖影响的纵向评估表明，从第四天开始，与同型球体相比，异型球体以理想的圆形生长。异型球体最初从第四天到第七天显示出快速生长阶段，然后在第八天显示出较慢的阶段。然后，球体体积在第9天和第10天减少，可能反映了营养物质的消耗或缺氧的核心和细胞死亡。相比之下，同型球体在第五天之前表现出相对静态的生长曲线，然后从第六天开始其生长曲线逐渐增加。异型球体的较高生长速率表明肿瘤与成纤维细胞之间的直接接触增加了肿瘤球体的大小。当在新鲜培养基中生长三天龄的同型Hep3B球状体时，细胞在三天后形成完美的圆形球体，并显示出持续增殖直到第七天。当球体在LX2条件培养基中维持时，生长速率增强，表明成纤维细胞驱动的肿瘤球体增殖。确保将无菌BBS添加到培养皿的底部以保持合适的潮湿条件以形成球体至关重要。此外，在倒置盖子时要小心，以免球体和液滴被破坏。3D肿瘤球体可以固定或冷冻并储存，以备将来使用，如免疫化学或免疫荧光，以及用于转录组学分析的RNA提取。可以对具有预标记细胞的异型球体进行成像和跟踪，以提供对肿瘤微环境中细胞 - 细胞相互作用的见解。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

研究病毒载体在三维肝模型重新填充与人肝癌细胞株HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

科研

癌症研究

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

向上移动: 一个简单而灵活的体外三维入侵检测协议

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

基于球形的头颈部鳞状细胞癌3D 细胞培养模型的治疗试验

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

骨肉瘤的三维骨细胞外基质模型

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

三维流状入侵检测中的全人肿瘤基基质

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Transradial Access Chemoembolization for Hepatocellular Carcinoma Patients

肝细胞癌患者的跨径向获取化疗

Transarterial chemoembolization (TACE) is the most common modality for treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) at the intermediate stage. TACE is ...

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Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

在结肠直肠癌细胞的三维球体培养物中使用无细胞益生菌超常剂评估细胞死亡

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

研究结肠癌干细胞的球体三维模型

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Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

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使用胶原基支架的神经母细胞瘤三维 体外 仿生模型

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...