Name: a three-dimensional spheroid model to investigate the tumor-stromal interaction in hepatocellular carcinoma
Uploaded: 2021-09-30T13:30:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma at JoVE.com

MYWZ wordt gefinancierd door de Secretary of State for Business, Energy and Industrial Strategy en de Newton Prize 2020 als onderdeel van het Britse officiële ontwikkelingshulp "ODA" en Newton-fonds. SS wordt ondersteund door Cancer Research UK Advanced Clinician Scientist fellowship C53575/A29959. SS, FO en HR ontvangen financiering als onderdeel van HUNTER, gefinancierd door een partnerschap tussen Cancer Research UK, Fondazione AIRC en Fundacion Cientifica de la Asociacion Espanola Contra el Cancer.

1. Celvoorbereiding
<ol><li>Voer alle experimenten uit onder steriele omstandigheden in de microbiologische veiligheidskast klasse II laminaire stroming (zie Materiaaltabel).<ol>
<li>Zet de kap aan en zorg voor de stabilisatie van de luchtstroom.</li>
		<li>Spuit het oppervlak van de binnenkap grondig met 70% ethanol om mogelijke verontreiniging van eerdere gebruikers te elimineren.</li>
		<li>Bereid 5% van een desinfecterende oplossing in een glazen bekerglas van 500 ml. Gooi alle celsupernatant of celresten in de oplossing weg.</li>
		<li>Reinig alle micropipettes en tipboxen grondig met 70% ethanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid verse celkweekmedia door Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) hoge glucose media aan te vullen met 10% warmte gedeactiveerd foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline / streptomycine (100 eenheid / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine) en 2 mM L-glutamine. Voor de LX2 hepatische stellaat cellijn, verlaag de concentratie van het FBS supplement tot 2%.</li>
	<li>Warme cultuurmedia voordat het experiment wordt geïnitieerd.</li>
	<li>Neem Huh7 en Hep3B HCC tumorcellijnen en COS7 en LX2 fibroblast cellijnen uit hun opslagrek in vloeibare stikstof. Ontdooi snel gecryopreserveerde cellen.</li>
	<li>Verdun ontdooide cellen met 2 ml verse kweekmedia. Centrifugeer cellen bij 200 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in 1 ml verse warme kweekmedia.</li>
	<li>Zaadcellen in T75 celkweekkolf. Incubeer de cellen in een celkweekincubator in 5% CO2 bij 37 °C in 95% bevochtigde omstandigheden totdat de cellen 60%-70% confluentie bereiken.</li>
</ol>2. Celverzameling
<ol><li>Kweekmedia aspirateren en cellen driemaal wassen met fosfaatbufferzoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Voeg 2 ml voorverwarmd 1x trypsine toe om de hechtende cellen los te maken van de bodem van de T75-kolven. Incubeer bij 37 °C in een couveuse gedurende 4 min.</li>
	<li>Inactiveer trypsine door toevoeging van 4 ml complete kweekmedia. Verzamel de celsuspensie en centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen in 4 ml verse kweekmedia.</li>
</ol>3. Cel tellen
<ol><li>Vortex voorzichtig de celsuspensie om een homogene verdeling van cellen in de centrifugebuis te garanderen.</li>
	<li>Gebruik een pipet van 10 μL om 10 μL celsuspensie te mengen met 10 μL Trypan blauw. Pipetteer het mengsel vier keer voorzichtig op en neer om ervoor te zorgen dat het buitenste celoppervlak volledig wordt gekleurd met de kleurstof.</li>
	<li>Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.<ol>
<li>Plaats eerst een coverslip over het telgebied van de hemocytometer voordat u de gekleurde celsuspensie laadt.</li>
		<li>Plaats de pipetpunt met de celsuspensie in de V-groef van de hemocytometer. Verwijder de puntinhoud voorzichtig in de telschuif.</li>
		<li>Laat de brij een paar minuten bezinken voordat u deze op de microscooptrap bevestigt voor het tellen van cellen. OPMERKING: Om dubbeltelling te voorkomen, telt u alleen de cellen aan de twee zijden van het grote vierkant.</li>
		<li>Tel in cellen die de bovenste of de rechter-regel overlappen en vermijd cellen die de onderste of de linkerregel overlappen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereken het totale aantal cellen. OPMERKING: Celnummer per ml = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq01.jpg">
</li>
</ol>4. Verzameling van fibroblast geconditioneerde media (CM)
<ol><li>Zuig kweekmedia op en was de LX2-cellen driemaal met PBS.</li>
	<li>Voeg 2 ml voorverwarmd 1x trypsine toe om de hechtende cellen los te maken van de bodem van de T75-kolven. Incubeer de kolf bij 37 °C in een incubator gedurende 4 min.</li>
	<li>Inactiveer trypsine door toevoeging van 4 ml complete kweekmedia. Verzamel de celsuspensie en centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. Tel de cellen volgens stap 3.</li>
	<li>Zaad 1 x 106 LX2 cellen in 10 cm3 schalen gedurende 48 h bij 37 °C.</li>
	<li>Verzamel de fibroblast CM na 48 uur. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur om eventuele drijvende cellen te pelleteren. Steriel filter de CM met behulp van een 0,22 μm filter bevestigd op de bodem van 20 ml spuiten.</li>
	<li>Verzamel het supernatant CM. Vul de CM in buizen van 2 ml en bewaar bij -80 °C voor verdere toepassingen. OPMERKING: De oplossing kan 6 maanden bewaard worden bij -80 °C.</li>
</ol>5. Valideren van celdichtheden voor perfecte sferoïden
<ol><li>Aspirateer kweekmedia en was de HCC-cellijnen drie keer met PBS.</li>
	<li>Voeg 2 ml voorverwarmd 1x trypsine toe om de hechtende cellen los te maken van de bodem van de T75-kolven. Incubeer bij 37 °C in een couveuse gedurende 4 min.</li>
	<li>Inactiveer trypsine door toevoeging van 4 ml complete kweekmedia. Verzamel de celsuspensie en centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Tel de cellen volgens stap 3.</li>
	<li>Pipetteer verschillende dichtheden van de tumorcellijnen (12000, 6000, 3000, 1500, 1000, 750, 500, 250 en 125 cellen) in 20 μL media op het binnenoppervlak van een 10 cm3 deksel van een petrischaaltje.</li>
	<li>Voeg 10 ml steriele PBS toe aan de bodem van de schaal om vochtige omstandigheden te bieden voor het proces van sferoïdevorming.</li>
	<li>Keer het deksel van de 10 cm3 schaal om zodat de media, inclusief de celsuspensie, boven een vochtige omgeving kunnen hangen. Laat de hangende druppels 3 dagen staan.</li>
	<li>Maak foto's van de sferoïden met een vergroting van 50x met behulp van een omgekeerde microscoop 3 dagen na het ophangen van de originele druppels.</li>
</ol>6. Heterotypische tumor/stromale sferoïden
<ol><li>Hang 1500 Huh7 HCC-cellen met 1500 COS7-fibroblastcellen van zoogdieren (1: 1-verhouding) in hangende druppels om bollen te vormen. Voeg 10 ml steriele PBS toe aan de bodem van de schaal om vochtige omstandigheden voor de sferoïden te bieden.</li>
	<li>Keer het deksel van de 10 cm3 schaal om zodat de media, inclusief de celsuspensie, boven een vochtige omgeving kunnen hangen. Laat de hangende druppels 3 dagen staan.</li>
	<li>Maak foto's van de sferoïden met behulp van een omgekeerde microscoop van dag 3 tot dag 10 van de cultuur.<ol>
<li>Leg de schaal van 10 cm3 op het microscooppodium. Pas de vergroting van de microscoop aan op 50x voor alle sferoïden.</li>
		<li>Open de microscoopsoftware op de aangesloten computer en pas de focus aan om een duidelijk beeld van elke sferoïde te hebben. Gebruik de Capture Tool op de microscoopsoftware om de verkregen foto's op te slaan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Homotypische Hep3B-sferoïden in LX2 CM
<ol><li>Hang 3000 Hep3B HCC-cellen in de hangende druppels om bollen te vormen. Voeg 10 ml steriele PBS toe aan de bodem van de schaal om vochtige omstandigheden voor de sferoïden te bieden.</li>
	<li>Keer het deksel van de 10 cm3 schaal om zodat de media, inclusief de celsuspensie, boven een vochtige omgeving kunnen hangen. Laat de hangende druppels 3 dagen staan.</li>
	<li>Breng Hep3B-sferoïden over in 20 μL verse CM van LX2-cellen in hangende druppels. OPMERKING: Gebruik steriele geautoclaveerde ongefilterde 200 μL pipetpunten in het proces van sferoïde overdracht om verstoring of letsel aan de gevormde sferoïden te voorkomen. Dit is ook om eventuele restcellen te elimineren die niet vastzitten aan de belangrijkste enkele sferoïde.<ol>
<li>Gebruik een geautoclaveerde pipet van 20 μL voor het overdrachtsproces. Stel het pipetvolume in op 2 μL. Bevestig de pipetpunt aan de pipet.</li>
		<li>Keer het deksel van de 10 cm3 schaal waarop de sferoïden werden gevormd om. Bevestig het deksel op het podium van een lichtmicroscoop. Pas de fijne focus van de microscoop aan om elke sferoïde zichtbaar te maken.</li>
		<li>Leeg voorzichtig de lucht van de micropipette door op de zuigerknop te drukken. Plaats de pipetpunt in de druppel, inclusief de sferoïde, die moet worden overgebracht. Kom heel dicht bij de sferoïde zonder deze met de punt aan te raken.</li>
		<li>Laat de druk op de zuigerknop voorzichtig los om de sferoïde in de micropipettepunt in 2 μL media te laten zuigen.</li>
		<li>Breng de sferoïde over in een nieuwe druppel die aan een nieuwe schaal van 10 cm3 hangt, met nieuwe media / geconditioneerde media / behandeling. OPMERKING: Zorg ervoor dat alle sferoïden met de lichtmicroscoop met succes naar de nieuwe 10 cm3 schotel worden overgebracht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Maak foto's van de sferoïden met een vergroting van 50x met behulp van een omgekeerde microscoop vanaf de dag van overdracht (dag 3) tot dag 7 van de cultuur in LX2 CM.</li>
</ol>8. Berekening van het sferoïde volume
<ol><li>Wijs een unieke numerieke id toe voor elke sferoïde, zodat dagelijks afbeeldingen van overeenkomende sferoïden kunnen worden vastgelegd.</li>
	<li>Analyseer afbeeldingen van de groeiende sferoïden met behulp van een softwarepakket voor beeldanalyse.<ol>
<li>Open elke sferoïde afbeelding in het softwarepakket. Gebruik het selectiegereedschap uit de vrije hand en schets elke sferoïde. Selecteer in de vervolgkeuzelijst Analyse de optie Meting instellen en vervolgens Gebied. Druk op OK.</li>
		<li>Teken handmatig een cirkel rond elke sferoïde. Zodra de bol is omcirkeld, drukt u op Ctrl + M om het programma in staat te stellen het sferoïde gebied in Pixels te berekenen. Zet het gebied van de sferoïde om in een volume. OPMERKING: Volume van sferoidmm3 = 0,09403 × <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq02.jpg">
</li>
		<li>Bereken de verandering in sferoïde volume ten opzichte van het volume op de eerste dag van het vastleggen van de afbeelding. OPMERKING: Dit is om het sferoïde volume te normaliseren naar het startvolume en de nauwkeurigheid te verbeteren gezien de natuurlijke variatie in de startgrootte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

FO is bestuurder en aandeelhouder van Fibrofind limited.

De context waarin de experimentele cellijnen groeien, beïnvloedt hun genexpressieprofiel, routeanalyse en functionele criteria. In borstkankercellen blijft bijvoorbeeld de coördinatie tussen verschillende oncogene routes alleen behouden als kankercellen in 3D-conformatie worden gekweekt27. Gedereguleerde genen in 3D-melanoom en borstkankersferoïden, maar niet in de monolaagcellen, zijn relevanter voor de in vivo menselijke tumor28,29. De β1-integrinespiegels in borstepitheelcellen en tumortegenhangers waren bijvoorbeeld lager dan de niveaus die in een 2D-formaat werden gekweekt29. Bovendien hebben fibroblasten in 3D-structuren de neiging om duidelijk te migreren in termen van morfologie en snelheid in vergelijking met die gekweekt op plastic30. Bovendien activeert de mechanische stijfheid van het groeisubstraat specifieke routes die de kwaadaardige transformatie van normale epitheelcellen aanmoedigen via deregulatie van het extracellulaire signaalgeregelde kinase (ERK) / Rho in epitheelcellen31. Deze factoren bevorderen de overgang van conventionele 2D-cultuur naar 3D-sferoïde modellen, omdat 3D-culturen meer in overeenstemming zijn met menselijke ziekten.
De huidige studie gebruikte conventionele laboratoriumgereedschappen en -benodigdheden om een 3D-tumorsferoïde model te produceren. De gevormde sferoïden reageerden op de proliferatiesignalen afkomstig van fibroblasten, zoals blijkt uit hun aanzienlijk verhoogde groei. Dit model behoort tot de categorie meercellige tumorsferoïden. Er zijn drie andere categorieën van 3D-tumorsferoïden, waaronder tumorospheres32, weefsel-afgeleide tumorbollen33,34 en organotypische meercellige sferoïden35. In meercellige tumorsferoïden worden tumorcellen gesuspendeerd in omstandigheden met lage adhesie, zodat ze samen kunnen aggregeren om bollen te vormen zonder de bodem van het kweekvat aan te raken36. Er zijn verschillende benaderingen gebruikt om deze verankeringsonafhankelijke techniek te leveren, variërend van roterende systemen, vloeibare overlay-technieken en ongecoate ultralage U-vormige platen37. In HCC gebruiken de meeste in vitro sferoïde culturen de ultra-lage aanhechtingsplaten van 24 of 96 putten om afgeronde sferoïden te vormen18,19,20,21,22. Deze techniek is echter niet kosteneffectief en sluit elk toevallig cel-plastic contact niet uit. Andere systemen gebruiken trans-wells23 of leverplakken12 om levermicroweefsels te produceren. Het gebruik van menselijke weefsels in translationeel werk is de gouden standaard, maar niet altijd beschikbaar of toegankelijk voor veel onderzoeksgroepen. De huidige aanpak profiteerde van de hangende druppeltheorie. Celsuspensie wordt toegevoegd zodat de tumorsferoïden worden gevormd in een toegankelijke vloeistof-luchtinterface om enkele afgeronde bollen te vormen38. Voordelen van het gebruik van deze techniek zijn het ontbreken van enig cel-plastisch contact en het gemak van het bestuderen van de autocriene en paracriene overspraak tussen tumor- en fibroblastcellen. Dit model werd verder gevalideerd in een andere studie die het belang van de niet-parenchymale TREM2 ontcijferde bij het beschermen van de lever tegen HCC-ontwikkeling39. Dit werk toonde aan dat het volume van zowel Hep3B- als PLC/PRF5-sferoïden hoger was in controle LX2 CM versus TREM2-overexpressie LX2 CM op een Wnt-afhankelijke manier39.
In de huidige studie werden fibroblasten gemengd met tumorcellen vóór sferoïdevorming om de proliferatieve impact van deze co-cultuur te onderzoeken. Anderen hebben fibroblasten, endotheelcellen en immuuncellen met tumorcelsuspensie toegevoegd na het vormen van een tumorsferoïde om de migratie van stromale cellen in de tumor te bestuderen40,41. Het huidige heterotypische sferoïde model vertoonde een vergelijkbaar groeipatroon als de eerder gerapporteerde modellen en de oorspronkelijke in vivo tumor; sferoïden vertonen exponentiële groei gevolgd door een vertraagde groeifase, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van de uitputting van voedingsstoffen en vergroting van de necrotische kern42. In plaats van groeifactoren en mitogenen toe te voegen om de vorming van sferoïden te helpen, gebruikte deze studie een meer fysiologische benadering door deze groeifactoren uit direct contact met fibroblasten of hun secretoom in de fibroblast CM te hebben. Het is essentieel om te vermelden dat LX2-cellen verder kunnen worden geactiveerd door behandeling met TGFβ1 of PDGF43. LX2-cellen zijn behandeld met 10 ng/ml TGFβ1 gedurende 48 uur voordat de media voor verschillende experimentele instellingen werden verwijderd. LX2-cellen werden drie keer gewassen met PBS (om een direct TGFβ1-effect uit te sluiten) en vervolgens werden nog eens 24 uur verse media toegevoegd voordat de CM werd verzameld. De CM verzameld van TGFβ1-gestimuleerde LX2 induceerde de groei van de Hep3B-sferoïden met een hogere snelheid dan de CM van controle LX2 (gegevens niet weergegeven). Dit flexibele systeem kan zich lenen voor co-culturen van verschillende kankercellen plus / minus fibroblasten, evenals patiënt-afgeleide lijnen. Het kan ook een screeningstest met gemiddelde doorvoer bieden voor geneesmiddelen die snel kunnen worden aangenomen en ingevoegd in een translationele pijplijn voor het ontdekken van geneesmiddelen om de dosering voor in vivo studies te informeren.
Een beperking van de huidige studie is het gebruik van de onsterfelijke cellijnen in sferoïde formatie in plaats van vers geïsoleerde HCC-tumorcellen en kankergeassocieerde fibroblasten. Een andere beperking is het vergelijken van de groei van de homotypische Hep3B-sferoïde tussen CM van LX2 en in verse media in plaats van CM van andere niet-fibroblastcellijnen. De laatste beperking kan worden aangepakt door de genetische modificatie van een gen van belang in de fibroblasten, gevolgd door het toepassen van de CM van wild type versus genetisch gemanipuleerde fibroblast op homotypische sferoïden.

De wereldwijde incidentie en mortaliteit van leverkanker zijn blijven toenemen, ondanks de vooruitgang in behandelingen voor leverziekte en de meeste andere soorten kanker. In 2018 overtrof leverkanker colorectale en maagkanker om wereldwijd de op één na meest voorkomende oorzaak van kankergerelateerde sterfte te worden1. In 2020 waren er meer dan 9.00.000 nieuwe diagnoses, goed voor 4,7% van de totale kankergevallen wereldwijd1. Dit is bijzonder teleurstellend, aangezien de significante risicofactoren voor de ontwikkeling van HCC, de meest voorkomende vorm van leverkanker, goed worden gekarakteriseerd2. Cirrose is de meest voorkomende risicofactor voor de ontwikkeling van HCC, waarbij 80% van de gevallen zich ontwikkelt op de achtergrond van gevestigde cirrose2. Chronische leverziekten, die zich ontwikkelen tot cirrose, en bijgevolg HCC, omvatten hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV), alcoholgerelateerde leverziekte (ARLD), niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) - de laatste toegeschreven aan obesitas en type 2 diabetes mellitus (T2DM) 2,3. De huidige managementprotocollen voor HCC zijn faseafhankelijk en beperkt voor mensen met gevorderde kanker, die meestal een slechte uitkomst hebben4. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt met behulp van kinaseremmers en, meer recent, immuun-oncologische behandelingen, hoewel realistisch gezien, profiteren slechts een minderheid van de patiënten met gevorderde leverkankers5. Bovendien is er bezorgdheid dat HCC's die optreden bij patiënten met NAFLD - de snelst groeiende onderliggende oorzaak, goed voor meer dan 50% van de nieuw gediagnosticeerde HCC-gevallen in westerse landen, mogelijk resistenter zijn tegen geprogrammeerde dood 1 (PD1) checkpointremmertherapie6.
Er is enorm geïnvesteerd in klinische onderzoeken voor patiënten met HCC, waaronder significante verbeteringen in klinische onderzoeken en hun eindpunten7. Na een decennium van mislukkingen zijn deze investeringen begonnen met het veranderen van de kansen voor patiënten. De realiteit is echter dat het totale percentage responders relatief slecht blijft, waarbij patiënten die in onderzoeken worden gerekruteerd vaak slecht representatief zijn voor degenen die in de klinieken worden verzorgd. Het gevaar is dat de vooruitgang kostbaar is en eerder ten goede komt aan enkelen dan aan velen. Naarmate er meer kandidaat-therapieën ontstaan voor eenmalig gebruik of combinatie, is het essentieel om preklinische modellen te hebben die meer voorspellend zijn voor in vivo responsen. Dit zijn waarschijnlijk modellen die aanvullende factoren bevatten die bijdragen aan de variabiliteit in patiëntresponsen die de menselijke HCC-heterogeniteit en pathologische complexiteit beter weerspiegelen8. Systemen die de in vivo pathofysiologische omstandigheden van HCC recreëren, zijn nodig om de biologie van tumorevolutie, groei en progressie te helpen begrijpen. De bestaande experimentele modellen van chronische leverziekten en HCC vallen meestal onder drie hoofdcategorieën: in vivo diermodellen (beoordeeld in9), in vitro culturen10 en ex vivo11,12 modellen. Dierlijke benaderingen worden op grote schaal gebruikt om chronische leverziekten te bestuderen, waaronder HCC; de genetische variabiliteit, hoge bedrijfskosten en de verschillende immuunsystemen tussen soorten behoren echter tot de belangrijkste beperkingen voor het toepassen van dergelijke modellen9. Hoewel sommige ex vivo modellen een uitstekend hulpmiddel bieden om zich te concentreren op menselijke weefsels in vergelijking met andere in vitro cellijnmodellen, belemmeren de beschikbaarheid van weefsel en het beperkte experimentele tijdsverloop hun gebruik op grote schaal.
Aan de andere kant blijven de in vitro cellijnmodellen een goede optie voor wetenschappers die met beperkte middelen werken, met een minder behoefte aan een constante toevoer van vers menselijk weefsel10. Deze modellen bieden ook een hulpmiddel dat kan worden gebruikt als een eerste scherm om te helpen bij de doelvalidatie van medicijnselectie voordat wordt overgegaan tot complexere in vivo modellen. De recente modificatie van de traditionele 2D-monolaagculturen in 3D-culturen heeft de effectiviteit van deze in vitro modellen verbeterd13,14.
3D-in vitromodellen kunnen kritieke kenmerken samenvatten die worden gezien in normale en pathologische omstandigheden bij de mens. Onder fysiologische omstandigheden wordt signaaltransductie geïnitieerd door cellulaire overspraak en interactie met andere bindweefselmoleculen, namelijk de extracellulaire matrix (ECM) eiwitten, die een 3D-interactienetwerk vormen15,16. De tumor evolueert in een 3D-bolvorm tijdens kwaadaardige transformatie, waarvoor zuurstof en voedingsstoffen gemakkelijk overvloedig aanwezig zijn in de niet-tumor / tumor interfase. Tegelijkertijd overheersen hypoxische aandoeningen in de tumorkern. Deze heterogeniteit in de beschikbaarheid van voedingsstoffen resulteert in de activering van ruimtelijk verschillende signalerings- en metabole routes die tumorigenese reguleren. Deze omstandigheden worden slecht samengevat in de conventionele 2D-monolaagculturen14, waarin cellen op een fysiologisch irrelevante manier op stijve kweekplastic groeien. Kankercellen communiceren ook met andere niet-parenchymale cellen, de primaire bron van ECM, groei en invasiesignalering in de micro-omgeving van de tumor. In tegenstelling tot 2D-culturen kunnen 3D-in vitromodellen een geschikter platform bieden om deze tumor-stromale interactie te bestuderen17.
3D-modellen worden veel gebruikt in het HCC-veld en variëren in de manier waarop het microweefsel wordt gevormd18,19,20,21,22,23. De meeste van deze modellen gebruikten de ultra-lage bindingsplaten18,19,20,21,22 of trans-wells23 in het proces van sferoïde vorming. Het beschreven protocol introduceert de hangende druppeltechniek als een alternatief, plasticvrij en kosteneffectief in vitro 3D-tumorsferoïde model. Dit kan het beoordelen van de paracriene en autocriene rollen van fibroblasten op de proliferatie van de tumorcellen in een 3D-formaat vergemakkelijken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59429C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>Biorender.com</td>
			<td>Online</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II laminar flow BioMAT2 hood</td>
			<td>Medair Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>M-D1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel sofware</td>
			<td>Microsoft office 365</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism sofware</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat deactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>life tech</td>
			<td>105000064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (100 unit/ml penicillin and 100 &#956;g/ml streptomycin)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 90 mm, triple vented</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon&#8482; Broad Spectrum Disinfectant, 5kg Bucket</td>
			<td>Rely+On&#8482;</td>
			<td>SCI-129999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziess inverted microscope</td>
			<td>Ziess</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional spheroid model to investigate the tumor-stromal interaction in hepatocellular carcinoma

De agressiviteit en het gebrek aan goed verdragen en zeer effectieve behandelingen voor gevorderd hepatocellulair carcinoom (HCC), de overheersende vorm van leverkanker, rationaliseren de rang als de tweede meest voorkomende oorzaak van kankergerelateerde dood. Preklinische modellen moeten worden aangepast om de menselijke omstandigheden samen te vatten om de beste therapeutische kandidaten voor klinische ontwikkeling te selecteren en de levering van gepersonaliseerde geneeskunde te ondersteunen. Driedimensionale (3D) cellulaire sferoïde modellen zijn veelbelovend als een opkomend in vitro alternatief voor tweedimensionale (2D) monolaagculturen. Hier beschrijven we een 3D-tumorsferoïdemodel dat het vermogen van individuele cellen om te aggregeren gebruikt wanneer het in hangende druppels wordt gehouden, en dat representatiever is voor een in vivo omgeving dan standaard monolagen. Bovendien kunnen 3D-sferoïden worden geproduceerd door homotypische of heterotypische cellen te combineren, die meer de cellulaire heterogeniteit in vivo weerspiegelen, waardoor mogelijk de studie van omgevingsinteracties mogelijk wordt die progressie en behandelingsresponsen kunnen beïnvloeden. Het huidige onderzoek optimaliseerde de celdichtheid om 3D homotypische en heterotypische tumorsferoïden te vormen door celsuspensies op de deksels van standaard 10 cm3 petrischalen te immobiliseren. Longitudinale analyse werd uitgevoerd om groeicurven te genereren voor homotypische versus heterotypische tumor/fibroblasten sferoïden. Ten slotte werd de proliferatieve impact van fibroblasten (COS7-cellen) en levermyofibroblasten (LX2) op homotypische tumor (Hep3B) sferoïden onderzocht. Een zaaidichtheid van 3.000 cellen (in 20 μL media) leverde met succes Huh7/COS7 heterotypische sferoïden op, die tot kweekdag 8 een gestage toename in grootte vertoonden, gevolgd door groeiachterstand. Deze bevinding werd bevestigd met behulp van Hep3B homotypische sferoïden gekweekt in LX2 (human hepatic stellate cell line) geconditioneerd medium (CM). LX2 CM veroorzaakte de proliferatie van Hep3B-sferoïden in vergelijking met controletumorsferoïden. Kortom, dit protocol heeft aangetoond dat 3D-tumorsferoïden kunnen worden gebruikt als een eenvoudig, economisch en prescreen in vitro hulpmiddel om tumor-stromale interacties uitgebreider te bestuderen.

Cellen gekweekt in een meerlagig 3D-formaat weerspiegelen nauwkeuriger de complexiteit van de tumormicro-omgeving dan conventionele 2D-culturen24,25. Eerder hebben veel studies de sferoïdencultuurmedia aangevuld met verschillende mitogenen en groeifactoren26 om sferoïdevorming te initiëren. In deze studie biedt de toevoeging van fibroblasten, of hun CM, echter essentiële mitogenen en groeifactoren om de sferoïde groei te versnellen.
Figuur 1 toont gegevens van een pilotstudie waarin Huh7 menselijke HCC-cellen werden gezaaid in een dalende zaaidichtheid vanaf 12.000 tot 125 cellen in 20 μL verse media gedurende 3 dagen. Een zaaidichtheid van 12.000 cellen leverde sferoïden op met een asymmetrische vorm, die zelfs na het halveren van de celzaaidichtheid niet werd gecorrigeerd. Sferoïden gemaakt van 3000 cellen leken echter meer afgerond (figuur 1, bovenste rij). Verdere vermindering van de celconcentratie slaagde er niet in om enkele bollen te vormen (125, 250, 500 celdichtheidsbollen) noch had een regelmatig bolvormig uiterlijk (1000 en 1500 celdichtheidssferoïden). Het is vermeldenswaard dat veel kleine bolletjes werden gevormd met een dichtheid van 500 tumorcellen; er werd echter slechts één kleine sferoïde gevangen bij 50x vergroting (figuur 1, bovenste rij). Hetzelfde geoptimaliseerde protocol werd toegepast op de COS7 primaat nier fibroblast cellijn (figuur 1, middelste rij). Het opschorten van 125, 250 en 500 COS7 fibroblasten in hangende druppels van 20 μL resulteerde in één afgeronde sferoïde met meerdere kleinere sferoïden, terwijl hogere celdichtheden (1000, 1500 en 3000) enkele halfronde sferoïden vormden. Net als bij de Huh7-tumorsferoïden resulteerden hogere celsuspensies (6.000 en 12.000 cellen / bol) in de vorming van onregelmatige celaggregaten en daarom werden hogere celconcentraties weggegooid (figuur 1, middelste rij). Lage dichtheden van Huh7/COS7 heterotypische celsuspensies (125, 250 en 500 cellen/bol) genereerden een enkele sferoïde met meerdere zwevende of semi-gehechte sferoïden (figuur 1, onderste rij). 1000- en 1500-cel heterotypische sferoïden werden half afgerond, terwijl een zaaidichtheid van 3000 cellen (1500 per celtype) een afgeronde 3D-sferoïde gaf. Zoals eerder opgemerkt, resulteerden hogere celdichtheden in de vorming van aggregaten in plaats van goed gedefinieerde sferoïden (figuur 1, onderste rij). Kortom, 3000 sferoïden met celdichtheid werden afgerond, vergelijkbaar met menselijke HCC-tumoren, en werden aangepast voor verdere experimenten. Het kweken van de celsuspensies als hangende druppels gedurende 3 dagen was voldoende om de vorming van sferoïden te bevorderen.
Na het optimaliseren van de beste celconcentratie en het tijdspunt voor sferoïdevorming in de huidige context, werd de proliferatieve impact van co-culturing tumor- en fibroblastcellijnen longitudinaal beoordeeld. Figuur 2 en figuur 3 tonen Huh7/COS7 heterotypische sferoïden (3000 totale celaantallen per sferoïde) gemonitord van dag 3 tot dag 10. Homotypische Huh7- en COS7-sferoïden (elk 1500 cellen) dienden als controles. Vanaf dag 4 groeiden heterotypische sferoïden in een ideale ronde vorm in vergelijking met homotypische sferoïden (figuur 2). Het beginvolume van de heterotypische sferoïde was groter dan dat van elke homotypische sferoïde. De groei van sferoïden werd berekend als de verandering in hun volume ten opzichte van het initiële volume op de dag van sferoïdevorming om normale variatie in sferoïde volume te voorkomen (dag 3, figuur 3). Heterotypische sferoïden vertoonden aanvankelijk een snelle groeifase vanaf dag 4 tot dag 7, gevolgd door een langzamere groeifase op dag 8 (figuren 2, bovenste rij en figuur 3). Het sferoïde volume nam af op dag 9 en 10, mogelijk als gevolg van de uitputting van voedingsstoffen of een hypoxische kern en celdood.
Daarentegen groeiden homotypische Huh7- en COS7-sferoïden in een veel langzamer tempo (figuur 2, middelste en onderste rijen; Figuur 3). Homotypische sferoïden vertoonden een relatief statische groeicurve tot de vijfde dag van de kweek (twee dagen na de vorming van sferoïden). Vanaf dag 6 begonnen de homotypische sferoïden een geleidelijke toename van hun groeicurve te vertonen, zij het met een significant lagere snelheid dan die van de heterotypische sferoïden (figuur 3). Kortom, tumor / fibroblast heterotypische sferoïden groeien met een hogere snelheid dan homotypische sferoïden, wat suggereert dat het directe contact van tumorcellen en fibroblasten de grootte van de tumorsferoïden vergroot.
Ten slotte, om de bovenstaande bevindingen te valideren en om de paracriene impact van mesenchymale cellen op de proliferatie van HCC-sferoïden in een levergerelateerde context te bestuderen, werden 3 dagen oude homotypische Hep3B HCC-sferoïden gekweekt in reguliere verse media of CM van LX2-hepatische stellaatcellen (figuur 4 en figuur 5) gedurende nog eens 4 dagen. Op het eerste gezicht vormden 3000 Hep3B-cellen na 3 dagen perfect afgeronde sferoïden (figuur 4). Hep3B-sferoïden vertoonden een continue proliferatie in verse media van dag 3 tot dag 7 (figuur 4, bovenste rij). De groeisnelheid werd versterkt wanneer Hep3B-sferoïden in LX2 CM werden gehandhaafd (figuur 4, onderste rij). Deze media-afhankelijke conversie in Hep3B sferoïde groei vertoonde statistische significantie vanaf dag 4 tot het einde van het experiment (figuur 5), wat wijst op een fibroblast-gedreven proliferatie van tumorsferoïden.
Concluderend heeft deze studie met succes de bestaande 3D-sferoïde culturen gewijzigd om de overspraak tussen HCC-tumorcellen en verschillende fibroblastcellijnen te benutten en de proliferatieve betekenis van deze directe en indirecte cellulaire interactie te onderzoeken (figuur 6). Verdere karakterisering van de gevormde sferoïden is nodig om de interactie tussen tumorcellen en de omringende micro-omgeving te verbeteren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig01.jpg"> Figuur 1: Optimalisatie van de optimale celdichtheid voor sferoïde vorming. Kolommen vertegenwoordigen verschillende celzaaidichtheden en rijen vertegenwoordigen sferoïden gevormd uit Huh7-cellen (bovenste rij), COS7-cellen (middelste rij) en Huh7 / COS7 heterotypische cellen (onderste rij). Afbeeldingen vertegenwoordigen sferoïden gevormd na het opschorten van 125, 250, 500, 1000, 1500, 3000, 6000 en 12000 cellen (van links naar rechts) in 20 μL media gedurende 3 dagen. De pilotstudie omvatte twee sferoïden per aandoening en de foto's werden genomen met een vergroting van 50x, schaalbalk = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig02.jpg"> Figuur 2: Heterotypische versus homotypische sferoïde groei. Kolommen vertegenwoordigen de dag waarop sferoïde afbeeldingen werden gemaakt en rijen tonen representatieve afbeeldingen voor sferoïden gevormd uit Huh7-cellen (bovenste rij), COS7-cellen (middelste rij) en Huh7 / COS7-cellen (onderste rij). De afbeeldingen vertegenwoordigen de sferoïden gevormd na het opschorten van 3000 cellen van elke aandoening (homotypische Huh7, COS7 of de Huh7 / COS7 heterotypische sferoïden) van verschillende tijdspunten van links naar rechts. Het experiment omvatte 10 sferoïden per conditie en de beelden werden genomen met een vergroting van 50x, schaalbalk = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig03.jpg"> Figuur 3: Longitudinale analyse van heterotypische versus homotypische sferoïde groei. De grafiek toont de groeicurve van heterotypische Huh7/COS7-sferoïden versus homotypische Huh7- en COS7-sferoïden. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± s.e.m; n = 10 onafhankelijke sferoïden. ** p < 0,01; p < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig04.jpg"> Figuur 4: Groei van homotypische hep3B-sferoïden in LX2 CM. Kolommen vertegenwoordigen de dag waarop sferoïde beelden werden vastgelegd en rijen tonen representatieve afbeeldingen van Hep3B-sferoïden gekweekt in verse DMEM-cultuurmedia (bovenste rij) of LX2 CM (onderste rij). Het experiment omvatte zeven sferoïden per conditie (verse media of LX2 CM), en er werden foto's gemaakt met een vergroting van 50x, schaalbalk = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig05.jpg"> Figuur 5: Longitudinale analyse van de homotypische Hep3B sferoïde groei. De grafiek toont de groeicurve van Hep3B-sferoïden in verse DMEM-kweekmedia of LX2 CM. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± s.e.m; n = 7 onafhankelijke sferoïden. p < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig06.jpg"> Figuur 6: Schematische weergave van het sferoïdevormingsproces. De celsuspensie wordt gepipetteerd op het binnendeksel van 10 cm3 petrischaal. Het deksel wordt omgekeerd en gedurende 3 dagen bewaard om homotypische of heterotypische sferoïdevorming mogelijk te maken. Sferoïde beelden worden genomen met een vergroting van 50x. De figuur is gemaakt met behulp van een webgebaseerde wetenschappelijke illustratietool (zie Tabel met materialen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma at JoVE.com

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Uitgebreide in vitro modellen die de relevante menselijke ziekte getrouw samenvatten, ontbreken. De huidige studie presenteert driedimensionale (3D) tumor sferoïde creatie en cultuur, een betrouwbaar in vitro hulpmiddel om de tumor-stromale interactie in humaan hepatocellulair carcinoom te bestuderen.

Een driedimensionaal sferoïde model om de tumor-stromale interactie bij hepatocellulair carcinoom te onderzoeken

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

3D-tumorsferoïden hebben de conventionele 2D-monolaagtechniek vervangen als de gouden standaard voor in vitro kankeronderzoek. Deze modellen maken de co-kweek van meerdere celtypen mogelijk die de heterogeniteit van de tumormicro-omgeving weerspiegelen en de exploitatie van ruimtelijke interacties mogelijk maken. Voordelen van het gebruik van de hangende druppelmethode om 3D-sferoïden te genereren, zijn het gebrek aan cel-plastic interactie en het gemak van het bestuderen van de interactie tussen de tumorcellen en de niet-tumorcellen.Deze techniek biedt ook een reproduceerbare en kosteneffectieve manier om tumor-stromale interactie te modelleren. 3D-tumoroïden zijn waardevolle preklinische modellen en worden vaak gebruikt als een hulpmiddel voor het screenen van geneesmiddelen. Deze methode kan worden toegepast om de farmacologische effecten van meerdere verbindingen op tumorgroei en de omliggende micro-omgeving te bestuderen.Het proces van sferoïdevorming is gebruiksvriendelijk en vereist conventionele celkweeklaboratoriumapparatuur. Sferoïden kunnen worden afgebeeld met behulp van elke omgekeerde lichtmicroscoop op de bank en de analyse van de grootte en vorm van sferoïden kan worden uitgevoerd met behulp van algemeen beschikbare online beeldanalysesoftware. Verwijder om te beginnen Huh7 en Hep3B HCC tumorcellijnen en COS-7 en LX2 fibroblast cellijnen uit hun opslagrek in vloeibare stikstof en ontdooi ze snel.Verdun na het ontdooien de ontdooide cellen met twee milliliter vers kweekmedium. Centrifugeer de cellen. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in één milliliter vers warm kweekmedium.Zaai vervolgens de cellen in T75-celkweekkolven en incubaleer ze in een celkweekincubator totdat cellen 60 tot 70 & confluency bereiken. Voor celverzameling, aspirateer de kweekmedia en was de cellen drie keer met PBS. Voeg vervolgens twee milliliter voorverwarmde trypsine toe om de aanhangende cellen van de bodem van de kolven los te maken en te incuberen bij 37 graden Celsius.Inactiveer na vier minuten de trypsine door vier milliliter volledig kweekmedium toe te voegen en verzamel de celsuspensie, centrifugeer vervolgens de cellen en gooi het supernatant weg voordat de cellen in één milliliter vers kweekmedium worden geresuspendeerd. Voeg ten slotte nog eens drie milliliter vers kweekmedium toe. Om de cellen te tellen, vortext u voorzichtig de celsuspensie.Gebruik vervolgens een pipet van 10 microliter, meng vervolgens 10 microliter van de celsuspensie met 10 microliter trypan blauw en pipetteer het mengsel vier keer voorzichtig op en neer om ervoor te zorgen dat het buitenste celoppervlak volledig wordt gekleurd met de kleurstof. Plaats vervolgens een coverslip over het telgebied van de hemocytometer. Plaats vervolgens de pipetpunt met het celmengsel naast de rand van de dekplaat en verwijder de puntinhoud voorzichtig in de telschuif.Na een paar minuten wachten tot de slurry is bezinkt, bevestigt u de hemocytometer op het microscoopstadium en telt u de cellen die de bovenste of de rechterregel overlappen, terwijl u die de onderste of de linkerregel overlapt. Bereken ten slotte het totale aantal cellen met behulp van deze formule. Na het aanzuigen van het kweekmedium, wast u de LX2-cellen driemaal met PBS.Maak de cellen los met trypsine zoals eerder aangetoond en centrifugeer ze. Na het tellen van de cellen zoals eerder aangetoond, zaai je één keer 10 tot de zesde LX2-cellen in 10 kubieke centimeter schaal en incubeer je bij 37 graden Celsius. Verzamel na 48 uur het fibroblastgeconditioneerde medium en centrifugeer om eventuele drijvende cellen te pelleteren.Filter steriliseer het geconditioneerde medium met behulp van een filter van 0,22 micron dat is bevestigd aan een spuit van 20 milliliter. Gebruik vervolgens de media in twee milliliterbuizen voor opslag bij min 80 graden Celsius. Voeg 10 milliliter steriele PBS toe aan de bodem van een schaal van 10 kubieke centimeter om vochtige omstandigheden voor de sferoïden te bieden.Suspensie vervolgens 1.500 HuH7 HCC-cellen met 1.500 COS-7 zoogdierfiblastcellen in hangende druppeltjes om bollen te vormen. Keer het deksel van de schotel om zodat de media, inclusief celsuspensie, boven een vochtige omgeving kunnen hangen. Na drie dagen, om foto's van de sferoïden te maken, plaatst u de schotel op het podium van een omgekeerde microscoop en past u de vergroting aan tot vijf keer.Open vervolgens de microscoopsoftware op de aangesloten computer en pas de focus aan om een duidelijk beeld van elke sferoïde te hebben. Gebruik vervolgens de snap-tool op de microscoopsoftware om de afbeeldingen te verkrijgen en de verkregen foto's op te slaan. Voeg 10 milliliter steriel PBS toe aan de bodem van een schaal van 10 kubieke centimeter.Hang vervolgens 3.000 Hep3B HCC-cellen in de hangende druppels om bollen te vormen en het deksel van de schaal om te keren, zodat de druppels drie dagen boven een vochtige omgeving kunnen hangen. Breng vervolgens de Hep3B-sferoïden over in 20 microliter verse conditiemedia van LX2-cellen in hangende druppels. Keer vervolgens het deksel van de schaal waarop de sferoïden zijn gevormd om en bevestig het deksel op het podium van een lichtmicroscoop.Pas de fijne focus van de microscoop aan om elke sferoïde zichtbaar te maken zoals eerder is aangetoond. Nadat u op de zuigerknop hebt gedrukt om de lucht van de micropipette voorzichtig te legen, plaatst u de pipetpunt in de druppel met de over te brengen sferoïde. Kom heel dicht bij de sferoïde zonder deze met de punt aan te raken.Laat vervolgens voorzichtig de druk op de zuigerknop los om de sferoïde in de micropipette-punt in twee microliter media te laten zuigen. Breng vervolgens de sferoïde over in een nieuwe druppel die aan een nieuwe schaal van 10 kubieke centimeter hangt. Maak foto's van de sferoïden met een vijfvoudige vergroting met behulp van een omgekeerde microscoop vanaf de dag van overdracht tot dag zeven van de cultuur in de LX2-geconditioneerde media.Om de afbeeldingen van de groeiende sferoïden te analyseren, opent u elke sferoïde afbeelding in een beeldanalysesoftware en gebruikt u de selectietool uit de vrije hand om elke sferoïde te schetsen. Selecteer vervolgens in de vervolgkeuzelijst Analyse de optie Meting instellen, gevolgd door gebied en druk op OK. Teken vervolgens handmatig een cirkel rond elke sferoïde en zodra de bol is omcirkeld, drukt u op Control M om het programma in staat te stellen het sferoïde gebied in pixels te berekenen. Zet vervolgens de oppervlakte van de sferoïde om in een volume met behulp van deze formule.Bereken ten slotte de verandering in sferoïde volume ten opzichte van het volume op de eerste dag van de opname van afbeeldingen. Tijdens optimalisatie van de celdichtheid voor sferoïdevorming leverden hogere zaaidichtheden van 12.000 en 6.000 cellen sferoïden op met een asymmetrische vorm, terwijl een zaaidichtheid van 3.000 cellen een perfecte afgeronde 3D-sferoïde gaf. Zo werden 3.000 sferoïden met celdichtheid aangepast voor verdere experimenten.Longitudinale beoordeling van de proliferatieve impact van co-culturing tumor- en fibroblastcellijnen toonde aan dat vanaf dag vier heterotypische sferoïden in een ideale ronde vorm groeiden in vergelijking met homotypische sferoïden. Heterotypische sferoïden vertoonden aanvankelijk een snelle groeifase vanaf dag vier tot dag zeven, gevolgd door een langzamere fase op dag acht. Het sferoïde volume nam vervolgens af op dag negen en 10, mogelijk als gevolg van de uitputting van voedingsstoffen of een hypoxische kern en celdood.Daarentegen vertoonden de homotypische sferoïden een relatief statische groeicurve tot dag vijf, gevolgd door een geleidelijke toename van hun groeicurves vanaf dag zes. De hogere groeisnelheid van heterotypische sferoïden suggereert dat het directe contact tussen tumor en fibroblasten de grootte van de tumorsferoïden vergroot. Toen drie dagen oude homotypische Hep3B-sferoïden in verse media werden gekweekt, vormden de cellen na drie dagen perfect afgeronde sferoïden en vertoonden ze voortdurende proliferatie tot dag zeven.De groeisnelheid werd versterkt wanneer sferoïden werden gehandhaafd in LX2-geconditioneerde media, wat wijst op een fibroblast-gedreven proliferatie van tumorsferoïden. Het is cruciaal om ervoor te zorgen dat de steriele BBS aan de bodem van de schotels wordt toegevoegd om een geschikte vochtige conditie te behouden voor sferoïdevorming. Wees ook voorzichtig bij het omkeren van het deksel, zodat de sferoïden en de druppels niet worden verstoord.3D-tumorsferoïden kunnen worden gefixeerd of ingevroren en opgeslagen voor toekomstige toepassingen zoals immunochemie of immunofluorescentie, evenals RNA-extractie voor transcriptomische analyse. Heterotypische sferoïden met voorgelabelde cellen kunnen in beeld worden gebracht en gevolgd om inzicht te geven in cel-celinteracties in de micro-omgeving van de tumor.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Studie van virale vectoren in een drie-dimensionale lever Model herbevolkt met de menselijke hepatocellulair carcinoom cellijn HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Therapie testen in een sferoïde gebaseerde 3D cel cultuur Model voor hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Driedimensionale bot extracellulaire Matrix Model voor Osteosarcoom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Transradial Access Chemoembolization for Hepatocellular Carcinoma Patients

Transradiale toegang chemoembolisatie voor hepatocellulair carcinoom patiënten

Transarterial chemoembolization (TACE) is the most common modality for treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) at the intermediate stage. TACE is ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/61109.jpg

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Celdood evalueren met celvrije supernatant van probiotica in driedimensionale sferoïde culturen van colorectale kankercellen

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Een driedimensionaal model van sferoïden om stamcellen van darmkanker te bestuderen

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Een muismodel om de rol van kanker-geassocieerde fibroblasten in tumorgroei te onderzoeken

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Driedimensionaal in vitro biomimetisch model van neuroblastoom met behulp van op collageen gebaseerde steigers

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...