Name: a three-dimensional spheroid model to investigate the tumor-stromal interaction in hepatocellular carcinoma
Uploaded: 2021-09-30T13:30:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma at JoVE.com

MYWZ est financé par le Secrétaire d’État aux affaires, à l’énergie et à la stratégie industrielle et le Prix Newton 2020 dans le cadre de l’aide publique au développement « ODA » et du fonds Newton du Royaume-Uni. SS est soutenu par Cancer Research UK Advanced Clinician Scientist Fellowship C53575 / A29959. SS, FO et HR reçoivent un financement dans le cadre de HUNTER, financé par un partenariat entre Cancer Research UK, La Fondazione AIRC et la Fundacion Cientifica de la Asociacion Espanola Contra el Cancer.

1. Préparation des cellules
<ol><li>Effectuer toutes les expériences dans des conditions stériles dans une armoire de sécurité microbiologique à écoulement laminaire de classe II (voir tableau des matériaux).<ol>
<li>Allumez le capot et permettez la stabilisation du flux d’air.</li>
		<li>Vaporisez soigneusement la surface intérieure de la hotte avec 70% d’éthanol pour éliminer toute contamination possible des utilisateurs précédents.</li>
		<li>Préparer 5 % d’une solution désinfectante dans un bécher en verre de 500 ml. Jetez tout surnageant cellulaire ou débris cellulaire à l’intérieur de la solution.</li>
		<li>Nettoyez soigneusement toutes les micropipettes et les boîtes à embouts avec de l’éthanol à 70%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparez des milieux de culture cellulaire frais en complétant le milieu modifié eagle’s (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) désactivé par la chaleur, 1 % de pénicilline/streptomycine (100 unités/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) et 2 mM de L-glutamine. Pour la lignée cellulaire stellaire hépatique LX2, réduire la concentration du supplément FBS à 2%.</li>
	<li>Réchauffez les milieux de culture avant de commencer l’expérience.</li>
	<li>Prenez les lignées cellulaires tumorales Huh7 et Hep3B HCC et les lignées cellulaires de fibroblastes COS7 et LX2 de leur rack de stockage dans de l’azote liquide. Dégivrer rapidement les cellules cryoconservées.</li>
	<li>Diluer les cellules décongelées avec 2 mL de milieux de culture frais. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 4 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de culture frais et chaud.</li>
	<li>Cellules de semence dans une fiole de culture cellulaire T75. Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire dans 5% de CO2 à 37 °C dans des conditions humidifiées à 95% jusqu’à ce que les cellules atteignent 60% à 70% de confluence.</li>
</ol>2. Collecte de cellules
<ol><li>Aspirer les milieux de culture et laver les cellules trois fois avec une solution saline tampon phosphate (PBS).</li>
	<li>Ajouter 2 mL de trypsine 1x préchauffée pour détacher les cellules adhérentes du fond des flacons T75. Incuber à 37 °C dans un incubateur pendant 4 min.</li>
	<li>Inactiver la trypsine en ajoutant 4 mL de milieu de culture complet. Prélever la suspension cellulaire et centrifuger les cellules à 200 x g pendant 4 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans un milieu de culture frais de 4 mL.</li>
</ol>3. Comptage des cellules
<ol><li>Vortexez doucement la suspension cellulaire pour assurer une distribution homogène des cellules dans le tube de centrifugation.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette de 10 μL, mélanger 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de bleu trypan. Pipetez doucement le mélange de haut en bas quatre fois pour assurer une coloration complète de la surface externe de la cellule avec le colorant.</li>
	<li>Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.<ol>
<li>Tout d’abord, placez un couvercle sur la zone de comptage de l’hémocytomètre avant de charger la suspension cellulaire colorée.</li>
		<li>Placez l’embout de la pipette contenant la suspension cellulaire dans la rainure en V de l’hémocytomètre. Expulsez doucement le contenu de la pointe dans la diapositive de comptage.</li>
		<li>Laissez la boue se déposer pendant quelques minutes avant de la fixer sur l’étape du microscope pour le comptage des cellules. REMARQUE: Pour éviter le double comptage, ne comptez que les cellules des deux côtés du grand carré.</li>
		<li>Comptez dans les cellules qui chevauchent la règle supérieure ou droite et évitez celles qui chevauchent la règle inférieure ou la règle gauche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calculez le nombre total de cellules. REMARQUE: Nombre de cellules par ml = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq01.jpg">
</li>
</ol>4. Collecte des milieux conditionnés par les fibroblastes (CM)
<ol><li>Aspirer les milieux de culture et laver les cellules LX2 trois fois avec du PBS.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de trypsine 1x préchauffée pour détacher les cellules adhérentes du fond des flacons T75. Incuber la fiole à 37 °C dans un incubateur pendant 4 min.</li>
	<li>Inactiver la trypsine en ajoutant 4 mL de milieu de culture complet. Prélever la suspension cellulaire et centrifuger les cellules à 200 x g pendant 4 min à température ambiante. Comptez les cellules conformément à l’étape 3.</li>
	<li>Ensemencez 1 x 106 cellules LX2 dans des plats de 10 cm3 pendant 48 h à 37 °C.</li>
	<li>Recueillir le fibroblaste CM après 48 h. Centrifuger à 200 x g pendant 4 min à température ambiante pour granuler les cellules flottantes. Filtre stérile le CM à l’aide d’un filtre de 0,22 μm fixé au fond de seringues de 20 mL.</li>
	<li>Collectez le CM surnageant. Aliquotez le CM dans des tubes de 2 mL et stockez-le à -80 °C pour d’autres applications. REMARQUE: La solution peut être conservée pendant 6 mois à -80 ° C.</li>
</ol>5. Validation des densités cellulaires pour des sphéroïdes parfaits
<ol><li>Aspirer les milieux de culture et laver les lignées cellulaires HCC trois fois avec PBS.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de trypsine 1x préchauffée pour détacher les cellules adhérentes du fond des flacons T75. Incuber à 37 °C dans un incubateur pendant 4 min.</li>
	<li>Inactiver la trypsine en ajoutant 4 mL de milieu de culture complet. Prélever la suspension cellulaire et centrifuger les cellules à 200 x g pendant 4 min à température ambiante.</li>
	<li>Comptez les cellules conformément à l’étape 3.</li>
	<li>Pipette différentes densités des lignées cellulaires tumorales (12000, 6000, 3000, 1500, 1000, 750, 500, 250 et 125 cellules) dans 20 μL de milieu sur la surface intérieure d’un couvercle de 10 cm3 d’une boîte de Pétri.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de PBS stérile au fond de la boîte pour fournir des conditions humides pour le processus de formation de sphéroïdes.</li>
	<li>Inverser le couvercle de la parabole de 10 cm3 pour permettre au support, y compris la suspension cellulaire, de pendre au-dessus d’un environnement humide. Laissez les gouttelettes pendantes pendant 3 jours.</li>
	<li>Prenez des images des sphéroïdes à un grossissement de 50x à l’aide d’un microscope inversé 3 jours après avoir suspendu les gouttelettes d’origine.</li>
</ol>6. Tumeur hétérotypique / sphéroïdes stromaux
<ol><li>Suspendez 1500 cellules HCC Huh7 avec 1500 cellules fibroblastiques de mammifères COS7 (rapport 1:1) dans des gouttelettes suspendues pour former des sphères. Ajouter 10 mL de PBS stérile au fond de la parabole pour fournir des conditions humides pour les sphéroïdes.</li>
	<li>Inverser le couvercle de la parabole de 10 cm3 pour permettre au support, y compris la suspension cellulaire, de pendre au-dessus d’un environnement humide. Laissez les gouttelettes pendantes pendant 3 jours.</li>
	<li>Prenez des images des sphéroïdes à l’aide d’un microscope inversé du jour 3 au jour 10 de la culture.<ol>
<li>Placez la parabole de 10 cm3 sur la scène du microscope. Ajustez le grossissement du microscope à 50x pour tous les sphéroïdes.</li>
		<li>Ouvrez le logiciel de microscope sur l’ordinateur connecté et ajustez sa mise au point pour avoir une image claire de chaque sphéroïde. Utilisez l’outil de capture du logiciel de microscope pour enregistrer les images acquises.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Sphéroïdes homotypiques Hep3B dans LX2 CM
<ol><li>Suspendez 3000 cellules Hep3B HCC dans les gouttelettes suspendues pour former des sphères. Ajouter 10 mL de PBS stérile au fond de la parabole pour fournir des conditions humides pour les sphéroïdes.</li>
	<li>Inverser le couvercle de la parabole de 10 cm3 pour permettre au support, y compris la suspension cellulaire, de pendre au-dessus d’un environnement humide. Laissez les gouttelettes pendantes pendant 3 jours.</li>
	<li>Transférer les sphéroïdes Hep3B dans 20 μL de CM frais à partir de cellules LX2 dans des gouttelettes suspendues. REMARQUE: Utilisez des embouts de pipette stériles autoclavés non filtrés de 200 μL dans le processus de transfert de sphéroïdes pour éviter toute perturbation ou blessure aux sphéroïdes formés. Il s’agit également d’éliminer toutes les cellules résiduelles qui restent non attachées au sphéroïde unique principal.<ol>
<li>Utilisez une pipette autoclavée de 20 μL pour le processus de transfert. Réglez le volume de la pipette à 2 μL. Fixez l’embout de la pipette à la pipette.</li>
		<li>Inverser le couvercle du plat de 10 cm3 sur lequel les sphéroïdes se sont formés. Fixez le couvercle sur la scène d’un microscope optique. Ajustez la mise au point fine du microscope pour rendre chaque sphéroïde visible.</li>
		<li>Videz soigneusement l’air de la micropipette en appuyant sur le bouton du piston. Insérez l’embout de la pipette dans la gouttelette, y compris le sphéroïde, à transférer. Approchez-vous très près du sphéroïde sans le toucher avec la pointe.</li>
		<li>Relâchez doucement la pression sur le bouton du piston pour permettre l’aspiration du sphéroïde dans l’embout de la micropipette dans un support de 2 μL.</li>
		<li>Transférez le sphéroïde dans une nouvelle gouttelette suspendue à un nouveau plat de 10 cm3 , avec un nouveau support / support conditionné / traitement. REMARQUE: Assurez-vous que tous les sphéroïdes sont transférés avec succès dans la nouvelle antenne de 10 cm3 à l’aide du microscope optique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prenez des images des sphéroïdes à un grossissement de 50x à l’aide d’un microscope inversé du jour du transfert (jour 3) jusqu’au jour 7 de la culture en LX2 CM.</li>
</ol>8. Calcul du volume sphéroïde
<ol><li>Attribuez un identificateur numérique unique à chaque sphéroïde afin que les images des sphéroïdes correspondants puissent être capturées quotidiennement.</li>
	<li>Analysez les images des sphéroïdes en croissance à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.<ol>
<li>Ouvrez chaque image sphéroïde dans le progiciel. À l’aide de l’outil de sélection à main levée et contournez chaque sphéroïde. Dans le bouton déroulant Analyse , sélectionnez Définir la mesure, puis Zone. Appuyez sur OK.</li>
		<li>Dessinez manuellement un cercle autour de chaque sphéroïde. Une fois la sphère encerclée, appuyez sur Ctrl + M pour permettre au programme de calculer la zone sphéroïde en pixels. Convertissez la zone du sphéroïde en volume. REMARQUE: Volume de spheroidmm3 = 0,09403 × <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq02.jpg">
</li>
		<li>Calculez la variation du volume sphéroïde par rapport à son volume le premier jour de la capture de l’image. REMARQUE: Il s’agit de normaliser le volume sphéroïde au volume de départ et d’améliorer la précision compte tenu de la variation naturelle de la taille de départ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

FO est administrateur et actionnaire de Fibrofind limited.

Le contexte dans lequel les lignées cellulaires expérimentales se développent influence leur profil d’expression génique, l’analyse des voies et les critères fonctionnels. Par exemple, dans les cellules cancéreuses du sein, la coordination entre les différentes voies oncogènes n’est conservée que si les cellules cancéreuses sont cultivées en conformation 3D27. Les gènes dérégulés dans les sphéroïdes du mélanome 3D et du cancer du sein, mais pas dans les cellules monocouches, sont plus pertinents pour la tumeur humaine in vivo28,29. Par exemple, les niveaux d’intégrine β1 dans les cellules épithéliales mammaires et les homologues tumoraux étaient inférieurs aux niveaux cultivés dans un format 2D29. De plus, les fibroblastes dans les structures 3D ont tendance à migrer distinctement en termes de morphologie et de vitesse par rapport à ceux cultivés sur plastique30. De plus, la rigidité mécanique du substrat de croissance active des voies spécifiques qui favorisent la transformation maligne des cellules épithéliales normales via la dérégulation de la kinase extracellulaire régulée par le signal (ERK)/Rho dans les cellules épithéliales31. Ces facteurs favorisent la transition de la culture 2D conventionnelle aux modèles sphéroïdes 3D, car les cultures 3D sont plus conformes à la maladie humaine.
L’étude actuelle a utilisé des outils et des fournitures de laboratoire conventionnels pour produire un modèle de sphéroïde tumoral 3D. Les sphéroïdes formés ont répondu aux signaux de prolifération provenant des fibroblastes, comme le montre leur croissance considérablement accrue. Ce modèle appartient à la catégorie des sphéroïdes tumoraux multicellulaires. Il existe trois autres catégories de sphéroïdes tumoraux 3D, notamment les tumorosphères32, les sphères tumorales dérivées de tissus33,34 et les sphéroïdes multicellulaires organotypiques35. Dans les sphéroïdes tumoraux multicellulaires, les cellules tumorales sont suspendues dans des conditions de faible adhérence pour leur permettre de s’agréger pour former des sphères sans toucher le fond du récipient de culture36. Plusieurs approches ont été utilisées pour fournir cette technique indépendante de l’ancrage, allant des systèmes rotatifs, des techniques de superposition de liquide et des plaques en forme de U à fixation ultra-faible non revêtues37. Dans le CHC, la plupart des cultures de sphéroïdes in vitro utilisent les plaques ultra-faibles de 24 ou 96 puits pour former des sphéroïdes arrondis18,19,20,21,22. Cette technique n’est cependant pas rentable et n’exclut aucun contact accidentel cellule-plastique. D’autres systèmes utilisent des trans-puits23 ou des tranches de foie12 pour produire des micro-tissus hépatiques. L’utilisation de tissus humains dans le travail translationnel est la norme d’or, mais pas toujours disponible ou accessible par de nombreux groupes de recherche. L’approche actuelle a bénéficié de la théorie des gouttelettes suspendues. Une suspension cellulaire est ajoutée de sorte que les sphéroïdes tumoraux se forment dans une interface liquide-air accessible pour former des sphères arrondies simples38. Les avantages de l’utilisation de cette technique sont l’absence de tout contact cellule-plastique et la facilité d’étudier la diaphonie autocrine et paracrine entre les cellules tumorales et fibroblastiques. Ce modèle a ensuite été validé dans une autre étude déchiffrant l’importance du TREM2 non parenchymateux dans la protection du foie contre le développement du CHC39. Ces travaux ont montré que le volume des sphéroïdes Hep3B et PLC/PRF5 était plus élevé dans le contrôle LX2 CM par rapport au LX2 CM surexprimant TREM2 d’une manière dépendante de Wnt39.
Dans la présente étude, les fibroblastes ont été mélangés à des cellules tumorales avant la formation de sphéroïdes pour étudier l’impact prolifératif de cette co-culture. D’autres ont ajouté des fibroblastes, des cellules endothéliales et des cellules immunitaires avec suspension de cellules tumorales après avoir formé un sphéroïde tumoral pour étudier la migration des cellules stromales dans la tumeur40,41. Le modèle hétérotypique actuel des sphéroïdes a montré un modèle de croissance similaire aux modèles précédemment rapportés et à la tumeur in vivo originale; Les sphéroïdes montrent une croissance exponentielle suivie d’une phase de croissance retardée, probablement en raison de l’épuisement des nutriments et de l’élargissement du noyau nécrotique42. Au lieu d’ajouter des facteurs de croissance et des mitogènes pour aider à la formation de sphéroïdes, cette étude a utilisé une approche plus physiologique en ayant ces facteurs de croissance par contact direct avec les fibroblastes ou leur sécrétome dans le fibroblaste CM. Il est essentiel de mentionner que les cellules LX2 peuvent être activées davantage en traitant avec TGFβ1 ou PDGF43. Les cellules LX2 ont été traitées avec 10 ng/mL TGFβ1 pendant 48 h avant de retirer le milieu pour différents contextes expérimentaux. Les cellules LX2 ont été lavées trois fois avec du PBS (pour exclure tout effet direct de TGFβ1), puis des milieux frais ont été ajoutés pendant encore 24 heures avant de collecter le CM. Le CM collecté à partir du LX2 stimulé par TGFβ1 a induit la croissance des sphéroïdes Hep3B à un taux plus élevé que le CM du contrôle LX2 (données non présentées). Ce système flexible peut se prêter à des co-cultures de différentes cellules cancéreuses plus / moins des fibroblastes, ainsi qu’à des lignées dérivées du patient. Il peut également offrir un test de criblage à débit moyen pour les médicaments qui pourraient être rapidement adoptés et insérés dans un pipeline de découverte de médicaments translationnels pour éclairer le dosage pour les études in vivo.
Une limitation de la présente étude est l’utilisation des lignées cellulaires immortalisées dans la formation de sphéroïdes plutôt que des cellules tumorales HCC fraîchement isolées et des fibroblastes associés au cancer. Une autre limite consiste à comparer la croissance homotypique du sphéroïde Hep3B entre la CM de LX2 et dans des milieux frais plutôt que la CM d’autres lignées cellulaires non fibroblastiques. Cette dernière limitation pourrait être résolue par la modification génétique d’un gène d’intérêt dans les fibroblastes, suivie de l’application du CM de type sauvage par rapport au fibroblaste génétiquement modifié aux sphéroïdes homotypiques.

L’incidence mondiale et la mortalité par cancer du foie ont continué d’augmenter, malgré les progrès réalisés dans les traitements des maladies du foie et de la plupart des autres types de cancer. En 2018, le cancer du foie a dépassé le cancer colorectal et le cancer de l’estomac pour devenir la deuxième cause la plus fréquente de décès liés au cancer dans le monde1. En 2020, il y a eu plus de 9 000 000 nouveaux diagnostics, ce qui représente 4,7 % du total des cas de cancer dans le monde1. Ceci est particulièrement décevant, étant donné que les facteurs de risque importants pour le développement du CHC, la forme la plus courante de cancer du foie, sont bien caractérisés2. La cirrhose est le facteur de risque le plus courant pour le développement du CHC, avec 80% des cas se développant sur le fond de la cirrhose établie2. Les maladies chroniques du foie, qui évoluent vers la cirrhose et, par conséquent, le CHC, comprennent le virus de l’hépatite B (VHB), le virus de l’hépatite C (VHC), la maladie du foie liée à l’alcool (ARLD), les stéatoses hépatiques non alcooliques (NAFLD) - ces dernières attribuées à l’obésité et au diabète sucré de type 2 (DT2)2,3. Les protocoles de prise en charge actuels du CHC dépendent du stade et sont limités pour les personnes atteintes d’un cancer avancé, qui ont le plus souvent un mauvais résultat4. Des progrès significatifs ont été réalisés en utilisant des inhibiteurs de kinases et, plus récemment, des traitements immuno-oncologiques, bien que réalistes, ne bénéficient qu’à une minorité de patients atteints de cancers du foie avancés5. En outre, on craint que les HCC survenant chez les patients atteints de NAFLD - la cause sous-jacente à croissance la plus rapide, représentant plus de 50% des cas de CHC nouvellement diagnostiqués dans les pays occidentaux , puissent être plus résistants au traitement par inhibiteur de point de contrôle de la mort programmée 1 (PD1)6.
Il y a eu un investissement massif dans les essais cliniques pour les patients atteints de CHC, y compris des améliorations significatives dans les essais cliniques et leurs critères d’évaluation7. Après une décennie d’échecs, ces investissements ont commencé à changer les opportunités pour les patients. Cependant, la réalité est que la proportion globale de répondants reste relativement faible, les patients recrutés dans les essais représentant souvent mal ceux pris en charge dans les cliniques. Le danger est que les progrès soient coûteux et profitent à quelques-uns plutôt qu’à beaucoup. Au fur et à mesure que de plus en plus de thérapies candidates émergent pour un usage unique ou combiné, il est essentiel d’avoir des modèles précliniques plus prédictifs des réponses in vivo. Il s’agit probablement de modèles qui intègrent des facteurs supplémentaires contribuant à la variabilité observée dans les réponses des patients et qui reflètent mieux l’hétérogénéité et la complexité pathologique du CHC humain8. Des systèmes qui recréent les conditions physiopathologiques in vivo du CHC sont nécessaires pour aider à comprendre la biologie de l’évolution, de la croissance et de la progression tumorales. Les modèles expérimentaux existants de maladies chroniques du foie et de CHC se répartissent généralement en trois catégories principales : les modèles in vivo d’origine animale (examinés en 9), les cultures in vitro10 et les modèles ex vivo11,12. Les approches animales sont largement utilisées pour étudier les maladies chroniques du foie, y compris le CHC; toutefois, la variabilité génétique, les coûts de fonctionnement élevés et les différents systèmes immunitaires entre les espèces sont parmi les principales limites à l’application de tels modèles9. Alors que certains modèles ex vivo fournissent un excellent outil pour se concentrer sur les tissus humains par rapport à d’autres modèles de lignées cellulaires in vitro, la disponibilité des tissus et le temps expérimental limité entravent leur utilisation à grande échelle.
D’autre part, les modèles de lignées cellulaires in vitro restent une bonne option pour les scientifiques travaillant avec des ressources limitées, avec un besoin moindre d’avoir un approvisionnement constant en tissus humains frais10. Ces modèles fournissent également un outil qui peut être utilisé comme premier écran pour aider à la validation de la cible de la sélection des médicaments avant de passer à des modèles in vivo plus complexes. La modification récente des cultures monocouches 2D traditionnelles en cultures 3D a amélioré l’efficacité de ces modèles in vitro13,14.
Les modèles 3D in vitro peuvent récapituler les caractéristiques critiques observées dans des conditions normales et pathologiques humaines. Dans des conditions physiologiques, la transduction du signal est initiée par la diaphonie cellulaire et l’interaction avec d’autres molécules du tissu conjonctif, à savoir les protéines de la matrice extracellulaire (ECM), formant un réseau d’interaction 3D15,16. La tumeur évolue sous une forme sphérique 3D au cours de la transformation maligne, pour laquelle l’oxygène et les nutriments sont facilement abondants dans l’interphase non tumorale / tumorale. Dans le même temps, les conditions hypoxiques prédominent au niveau du noyau tumoral. Cette hétérogénéité dans la disponibilité des nutriments entraîne l’activation de voies de signalisation et métaboliques spatialement distinctes qui régulent la tumorigenèse. Ces conditions sont mal récapitulées dans les cultures monocouches 2D conventionnelles14, dans lesquelles les cellules se développent sur du plastique de culture rigide d’une manière physiologiquement non pertinente. Les cellules cancéreuses communiquent également avec d’autres cellules non parenchymateuses, la principale source d’ECM, de croissance et de signalisation d’invasion dans le microenvironnement tumoral. Contrairement aux cultures 2D, les modèles in vitro 3D peuvent fournir une plate-forme plus appropriée pour étudier cette interaction tumeur-stromale17.
Les modèles 3D sont largement utilisés dans le domaine du CHC, et ils varient dans la façon dont le micro-tissu est formé18,19,20,21,22,23. La plupart de ces modèles utilisaient soit les plaques de liaison ultra-basses18,19,20,21,22, soit les trans-puits23 dans le processus de formation de sphéroïdes. Le protocole décrit introduit la technique des gouttelettes suspendues comme un modèle de sphéroïde tumoral 3D in vitro alternatif, sans plastique et rentable. Cela peut faciliter l’évaluation des rôles paracrine et autocrine des fibroblastes sur la prolifération des cellules tumorales dans un format 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59429C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>Biorender.com</td>
			<td>Online</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II laminar flow BioMAT2 hood</td>
			<td>Medair Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>M-D1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel sofware</td>
			<td>Microsoft office 365</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism sofware</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat deactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>life tech</td>
			<td>105000064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (100 unit/ml penicillin and 100 &#956;g/ml streptomycin)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 90 mm, triple vented</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon&#8482; Broad Spectrum Disinfectant, 5kg Bucket</td>
			<td>Rely+On&#8482;</td>
			<td>SCI-129999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziess inverted microscope</td>
			<td>Ziess</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional spheroid model to investigate the tumor-stromal interaction in hepatocellular carcinoma

L’agressivité et l’absence de traitements bien tolérés et largement efficaces pour le carcinome hépatocellulaire avancé (CHC), la forme prédominante du cancer du foie, rationalisent son rang en tant que deuxième cause la plus fréquente de décès lié au cancer. Les modèles précliniques doivent être adaptés pour récapituler les conditions humaines afin de sélectionner les meilleurs candidats thérapeutiques pour le développement clinique et de faciliter la prestation de la médecine personnalisée. Les modèles de sphéroïdes cellulaires tridimensionnels (3D) sont prometteurs en tant qu’alternative in vitro émergente aux cultures monocouches bidimensionnelles (2D). Ici, nous décrivons un modèle de sphéroïde tumoral 3D qui exploite la capacité des cellules individuelles à s’agréger lorsqu’elles sont maintenues dans des gouttelettes suspendues, et est plus représentatif d’un environnement in vivo que les monocouches standard. De plus, les sphéroïdes 3D peuvent être produits en combinant des cellules homotypiques ou hétérotypiques, reflétant davantage l’hétérogénéité cellulaire in vivo, permettant potentiellement l’étude des interactions environnementales pouvant influencer la progression et les réponses au traitement. Les recherches actuelles ont optimisé la densité cellulaire pour former des sphéroïdes tumoraux homotypiques et hétérotypiques 3D en immobilisant des suspensions cellulaires sur les couvercles de boîtes de Petri standard de 10 cm3 . Une analyse longitudinale a été réalisée pour générer des courbes de croissance pour les sphéroïdes homotypiques versus hétérotypiques des tumeurs / fibroblastes. Enfin, l’impact prolifératif des fibroblastes (cellules COS7) et des myofibroblastes hépatiques (LX2) sur les sphéroïdes des tumeurs homotypiques (Hep3B) a été étudié. Une densité d’ensemencement de 3 000 cellules (dans des milieux de 20 μL) a donné avec succès des sphéroïdes hétérotypiques Huh7/COS7, qui ont montré une augmentation constante de la taille jusqu’au jour de culture 8, suivie d’un retard de croissance. Ce résultat a été corroboré à l’aide de sphéroïdes homotypiques Hep3B cultivés dans un milieu conditionné (CM) LX2 (lignée cellulaire stellaire hépatique humaine). LX2 CM a déclenché la prolifération des sphéroïdes Hep3B par rapport aux sphéroïdes tumoraux témoins. En conclusion, ce protocole a montré que les sphéroïdes tumoraux 3D peuvent être utilisés comme un outil in vitro simple, économique et de présélection pour étudier les interactions tumeur-stromale de manière plus complète.

Les cellules cultivées dans un format 3D multicouche reflètent plus précisément la complexité du microenvironnement tumoral que les cultures 2D conventionnelles24,25. Auparavant, de nombreuses études ont complété les milieux de culture des sphéroïdes avec différents mitogènes et facteurs de croissance26 pour initier la formation de sphéroïdes. Dans cette étude, cependant, l’ajout de fibroblastes, ou leur CM, fournit des mitogènes essentiels et des facteurs de croissance pour accélérer la croissance des sphéroïdes.
La figure 1 illustre les données d’une étude pilote dans laquelle des cellules HCC humaines Huh7 ont été ensemencées dans une densité d’ensemencement descendante allant de 12 000 à 125 cellules dans des milieux frais de 20 μL pendant 3 jours. Une densité d’ensemencement de 12 000 cellules a donné des sphéroïdes de forme asymétrique, qui n’a pas été corrigée même après avoir réduit de moitié la densité d’ensemencement cellulaire. Cependant, les sphéroïdes créés à partir de 3000 cellules semblaient plus arrondis (Figure 1, rangée supérieure). Une réduction supplémentaire de la concentration cellulaire n’a pas réussi à former des sphères uniques (125, 250, 500 sphères de densité cellulaire) ni n’a eu un aspect sphérique régulier (sphéroïdes de densité cellulaire 1000 et 1500). Il convient de mentionner que de nombreuses petites sphères se sont formées à une densité de 500 cellules tumorales; cependant, un seul petit sphéroïde a été capturé à un grossissement de 50x (Figure 1, rangée supérieure). Le même protocole optimisé a été appliqué à la lignée cellulaire de fibroblastes rénaux de primates COS7 (Figure 1, rangée du milieu). La suspension de 125, 250 et 500 fibroblastes COS7 dans des gouttelettes suspendues de 20 μL a donné un sphéroïde arrondi avec plusieurs sphéroïdes plus petits, tandis que des densités cellulaires plus élevées (1000, 1500 et 3000) ont formé des sphéroïdes semi-arrondis simples. Semblable aux sphéroïdes tumoraux Huh7, des suspensions cellulaires plus élevées (6 000 et 12 000 cellules / sphère) ont entraîné la formation d’agrégats cellulaires irréguliers, et donc des concentrations cellulaires plus élevées ont été éliminées (Figure 1, rangée du milieu). De faibles densités de suspensions de cellules hétérotypiques Huh7/COS7 (125, 250 et 500 cellules/sphère) ont généré un seul sphéroïde avec plusieurs sphéroïdes flottants ou semi-attachés (Figure 1, rangée du bas). Les sphéroïdes hétérotypiques à 1000 et 1500 cellules étaient semi-arrondis, tandis qu’une densité d’ensemencement de 3000 cellules (1500 par type de cellule) donnait un sphéroïde 3D arrondi. Comme nous l’avons mentionné précédemment, des densités cellulaires plus élevées ont entraîné la formation d’agrégats plutôt que de sphéroïdes bien définis (figure 1, rangée du bas). En conclusion, 3000 sphéroïdes de densité cellulaire ont été arrondis, similaires aux tumeurs humaines du CHC, et ont été adaptés pour d’autres expériences. Cultiver les suspensions cellulaires sous forme de gouttelettes suspendues pendant 3 jours était suffisant pour favoriser la formation de sphéroïdes.
Après avoir optimisé la meilleure concentration cellulaire et le meilleur point temporel pour la formation de sphéroïdes dans le contexte actuel, l’impact prolifératif des lignées cellulaires tumorales et fibroblastiques co-cultivatrices a été évalué longitudinalement. Les figures 2 et 3 montrent les sphéroïdes hétérotypiques Huh7/COS7 (3000 nombre total de cellules par sphéroïde) surveillés du jour 3 au jour 10. Les sphéroïdes homotypiques Huh7 et COS7 (1500 cellules chacun) ont servi de témoins. À partir du jour 4, les sphéroïdes hétérotypiques ont développé dans une forme ronde idéale par rapport aux sphéroïdes homotypiques (Figure 2). Le volume initial du sphéroïde hétérotypique était plus grand que celui de chaque sphéroïde homotypique. La croissance des sphéroïdes a été calculée comme la variation de leur volume par rapport au volume initial au jour de la formation des sphéroïdes afin d’éviter une variation normale du volume des sphéroïdes (jour 3, figure 3). Les sphéroïdes hétérotypiques ont d’abord montré une phase de croissance rapide à partir du jour 4 jusqu’au jour 7, suivie d’une phase de croissance plus lente au jour 8 (figures 2, rangée supérieure et figure 3). Le volume sphéroïde a diminué aux jours 9 et 10, reflétant peut-être l’épuisement des nutriments ou un noyau hypoxique et la mort cellulaire.
En revanche, les sphéroïdes homotypiques Huh7 et COS7 ont augmenté à un rythme beaucoup plus lent (figure 2, rangées du milieu et du bas; Graphique 3). Les sphéroïdes homotypiques ont présenté une courbe de croissance relativement statique jusqu’au cinquième jour de culture (deux jours après la formation des sphéroïdes). À partir du jour 6, les sphéroïdes homotypiques ont commencé à montrer une augmentation progressive de leur courbe de croissance, bien qu’à un rythme significativement inférieur à celui des sphéroïdes hétérotypiques (Figure 3). En conclusion, les sphéroïdes hétérotypiques tumoraux / fibroblastes se développent à un rythme plus élevé que les sphéroïdes homotypiques, ce qui suggère que le contact direct des cellules tumorales et des fibroblastes augmente la taille des sphéroïdes tumoraux.
Enfin, pour valider les résultats ci-dessus et étudier l’impact paracrine des cellules mésenchymateuses sur la prolifération des sphéroïdes HCC dans un contexte lié au foie, des sphéroïdes homotypiques Hep3B HCC de 3 jours ont été cultivés dans des milieux frais réguliers ou CM à partir de cellules stellaires hépatiques LX2 (Figure 4 et Figure 5) pendant 4 jours supplémentaires. À première vue, 3000 cellules Hep3B ont formé des sphéroïdes parfaitement arrondis après 3 jours (Figure 4). Les sphéroïdes Hep3B ont montré une prolifération continue dans les milieux frais du jour 3 au jour 7 (Figure 4, rangée supérieure). Le taux de croissance a été amélioré lorsque les sphéroïdes Hep3B ont été maintenus dans LX2 CM (Figure 4, rangée inférieure). Cette conversion dépendante des milieux dans la croissance des sphéroïdes Hep3B a montré une signification statistique du jour 4 jusqu’à la fin de l’expérience (Figure 5), suggérant une prolifération de sphéroïdes tumoraux induite par les fibroblastes.
En conclusion, cette étude a modifié avec succès les cultures de sphéroïdes 3D existantes pour exploiter la diaphonie entre les cellules tumorales du CHC et différentes lignées cellulaires de fibroblastes et étudier la signification proliférative de cette interaction cellulaire directe et indirecte (Figure 6). Une caractérisation plus approfondie des sphéroïdes formés est nécessaire pour améliorer la façon dont les cellules tumorales interagissent avec le microenvironnement environnant.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig01.jpg"> Figure 1 : Optimisation de la densité cellulaire optimale pour la formation de sphéroïdes. Les colonnes représentent différentes densités d’ensemencement cellulaire, et les lignes représentent les sphéroïdes formés à partir de cellules Huh7 (rangée du haut), de cellules COS7 (rangée du milieu) et de cellules hétérotypiques Huh7/COS7 (rangée du bas). Les images représentent des sphéroïdes formés après la suspension de 125, 250, 500, 1000, 1500, 3000, 6000 et 12000 cellules (de gauche à droite) dans un milieu de 20 μL pendant 3 jours. L’étude pilote comprenait deux sphéroïdes par condition, et les images ont été prises à un grossissement de 50x, barre d’échelle = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig02.jpg"> Figure 2 : Croissance hétérotypique versus sphéroïde homotypique. Les colonnes représentent le jour auquel les images sphéroïdes ont été prises, et les lignes montrent des images représentatives des sphéroïdes formés à partir de cellules Huh7 (rangée du haut), de cellules COS7 (rangée du milieu) et de cellules Huh7/COS7 (rangée du bas). Les images représentent les sphéroïdes formés après la suspension de 3000 cellules de chaque condition (homotypiques Huh7, COS7 ou les sphéroïdes hétérotypiques Huh7/ COS7) de différents points temporels de gauche à droite. L’expérience comprenait 10 sphéroïdes par condition, et les images ont été prises à un grossissement de 50x, barre d’échelle = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig03.jpg"> Figure 3 : Analyse longitudinale de la croissance hétérotypique par rapport à la croissance homotypique des sphéroïdes. Le graphique montre la courbe de croissance des sphéroïdes hétérotypiques Huh7/COS7 par rapport aux sphéroïdes homotypiques Huh7 et COS7. Les données sont présentées comme moyennes ± c.v.s.m; n = 10 sphéroïdes indépendants. ** p < 0,01; p < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig04.jpg"> Figure 4 : Croissance des sphéroïdes hep3B homotypiques dans LX2 CM. Les colonnes représentent le jour auquel les images sphéroïdes ont été capturées, et les lignes montrent des images représentatives des sphéroïdes Hep3B cultivés dans des milieux de culture DMEM frais (rangée du haut) ou LX2 CM (ligne du bas). L’expérience comprenait sept sphéroïdes par condition (milieu frais ou LX2 CM), et les images ont été prises à un grossissement de 50x, barre d’échelle = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig05.jpg"> Figure 5 : Analyse longitudinale de la croissance homotypique des sphéroïdes Hep3B. Le graphique montre la courbe de croissance des sphéroïdes Hep3B dans les milieux de culture DMEM frais ou LX2 CM. Les données sont présentées comme moyennes ± s.e.m; n = 7 sphéroïdes indépendants. p < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig06.jpg"> Figure 6 : Représentation schématique du processus de formation des sphéroïdes. La suspension cellulaire est pipetée sur le couvercle intérieur de la boîte de Petri de 10 cm3. Le couvercle est inversé et conservé pendant 3 jours pour permettre la formation de sphéroïdes homotypiques ou hétérotypiques. Les images sphéroïdes sont prises à un grossissement de 50x. La figure est créée à l’aide d’un outil d’illustration scientifique basé sur le Web (voir Tableau des matériaux). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Il manque des modèles in vitro complets qui récapitulent fidèlement la maladie humaine pertinente. La présente étude présente la création et la culture de sphéroïdes tumoraux tridimensionnels (3D), un outil in vitro fiable pour étudier l’interaction tumeur-stromale dans le carcinome hépatocellulaire humain.

Un modèle sphéroïde tridimensionnel pour étudier l’interaction tumeur-stromale dans le carcinome hépatocellulaire

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Les sphéroïdes tumoraux 3D ont remplacé la technique conventionnelle de monocouche 2D en tant que référence pour la recherche in vitro sur le cancer. Ces modèles permettent la co-culture de plusieurs types de cellules qui reflètent l’hétérogénéité du microenvironnement tumoral et permettent l’exploitation d’interactions spatiales. Les avantages de l’utilisation de la méthode des gouttelettes suspendues pour générer des sphéroïdes 3D sont le manque d’interaction cellule-plastique et la facilité d’étudier l’interaction entre les cellules tumorales et les cellules non tumorales.Cette technique fournit également un moyen reproductible et rentable de modéliser l’interaction tumeur-stromale. Les tumoroïdes 3D sont des modèles précliniques précieux et sont souvent utilisés comme outil de dépistage de drogues. Cette méthode peut être appliquée pour étudier les effets pharmacologiques de plusieurs composés sur la croissance tumorale et le microenvironnement environnant.Le processus de formation des sphéroïdes est convivial et nécessite un équipement de laboratoire de culture cellulaire conventionnel. Les sphéroïdes peuvent être imagés à l’aide de n’importe quel microscope à lumière inversée de paillasse, et l’analyse de la taille et de la forme des sphéroïdes peut être effectuée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images en ligne largement disponible. Pour commencer, retirez les lignées cellulaires tumorales Huh7 et Hep3B HCC et les lignées cellulaires de fibroblastes COS-7 et LX2 de leur rack de stockage dans de l’azote liquide et décongérez-les rapidement.Après décongélation, diluer les cellules décongelées avec deux millilitres de milieu de culture frais. Centrifuger les cellules. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu de culture chaud et frais.Ensuite, ensemencez les cellules dans des flacons de culture cellulaire T75 et incubez-les dans un incubateur de culture cellulaire jusqu’à ce que les cellules atteignent 60 à 70 et confluence. Pour la collecte des cellules, aspirer le milieu de culture et laver les cellules trois fois avec du PBS. Ensuite, pour détacher les cellules adhérentes du fond des flacons, ajoutez deux millilitres de trypsine préchauffée et incubez à 37 degrés Celsius.Après quatre minutes, inactiver la trypsine en ajoutant quatre millilitres de milieu de culture complet et recueillir la suspension cellulaire, puis centrifuger les cellules et jeter le surnageant avant de remettre les cellules en suspension dans un millilitre de milieu de culture frais. Enfin, ajoutez trois millilitres supplémentaires de milieu de culture frais. Pour compter les cellules, vortexez doucement la suspension cellulaire.Ensuite, à l’aide d’une pipette de 10 microlitres, mélangez 10 microlitres de la suspension cellulaire avec 10 microlitres de bleu trypan et pipetez doucement le mélange de haut en bas quatre fois pour assurer une coloration complète de la surface externe de la cellule avec le colorant. Ensuite, placez un couvercle sur la zone de comptage de l’hémocytomètre. Placez ensuite l’embout de la pipette contenant le mélange de cellules à côté du bord du couvercle et expulsez doucement le contenu de la pointe dans la glissière de comptage.Après avoir attendu quelques minutes que la boue se dépose, fixez l’hémocytomètre sur la scène du microscope et comptez les cellules chevauchant la règle supérieure ou droite tout en évitant celles qui chevauchent la règle inférieure ou gauche. Enfin, calculez le nombre total de cellules à l’aide de cette formule. Après avoir aspiré le milieu de culture, lavez les cellules LX2 trois fois avec du PBS.Détachez les cellules à l’aide de trypsine comme démontré précédemment et centrifugez-les. Après avoir compté les cellules comme démontré précédemment, ensemencez une fois 10 à la sixième cellule LX2 dans des plats de 10 centimètres cubes et incubez à 37 degrés Celsius. Après 48 heures, recueillir le milieu conditionné par les fibroblastes et centrifuger pour granuler les cellules flottantes.Filtrer le milieu conditionné à l’aide d’un filtre de 0,22 micron attaché à une seringue de 20 millilitres. Ensuite, aliquotez le média dans deux tubes millilitres pour le stockage à moins 80 degrés Celsius. Ajouter 10 millilitres de PBS stérile au fond d’une antenne de 10 centimètres cubes pour fournir des conditions humides aux sphéroïdes.Ensuite, suspendez 1 500 cellules HCC HuH7 avec 1 500 cellules de fibroblastes de mammifères COS-7 dans des gouttelettes suspendues pour former des sphères. Inverser le couvercle du plat pour permettre au milieu, y compris la suspension cellulaire, de pendre au-dessus d’un environnement humide. Après trois jours, pour prendre des images des sphéroïdes, mettez le plat sur la scène d’un microscope inversé et ajustez le grossissement à cinq fois.Ensuite, ouvrez le logiciel de microscope sur l’ordinateur connecté et ajustez sa mise au point pour avoir une image claire de chaque sphéroïde. Utilisez ensuite l’outil d’accrochage du logiciel de microscope pour acquérir les images et enregistrer les images acquises. Ajouter 10 millilitres de PBS stérile au fond d’un plat de 10 centimètres cubes.Suspendez ensuite 3 000 cellules Hep3B HCC dans les gouttelettes suspendues pour former des sphères et inverser le couvercle du plat permettant aux gouttelettes de pendre au-dessus d’un environnement humide pendant trois jours. Ensuite, transférez les sphéroïdes Hep3B dans 20 microlitres de milieux frais provenant de cellules LX2 dans des gouttelettes suspendues. Ensuite, inversez le couvercle du plat sur lequel les sphéroïdes sont formés et fixez le couvercle sur la scène d’un microscope optique.Ajustez la mise au point fine du microscope pour rendre chaque sphéroïde visible comme démontré précédemment. Après avoir appuyé sur le bouton du piston pour vider soigneusement l’air de la micropipette, insérez l’embout de la pipette dans la gouttelette contenant le sphéroïde à transférer. Approchez-vous très près du sphéroïde sans le toucher avec la pointe.Ensuite, relâchez doucement la pression sur le bouton du piston pour permettre l’aspiration du sphéroïde dans la pointe de la micropipette dans deux microlitres de média. Ensuite, transférez le sphéroïde dans une nouvelle gouttelette suspendue à un nouveau plat de 10 centimètres cubes. Prenez des images des sphéroïdes à un grossissement de cinq fois à l’aide d’un microscope inversé du jour du transfert jusqu’au septième jour de culture dans le milieu conditionné LX2.Pour analyser les images des sphéroïdes en croissance, ouvrez chaque image sphéroïde dans un logiciel d’analyse d’images et utilisez l’outil de sélection à main levée pour décrire chaque sphéroïde. Ensuite, à partir du bouton déroulant analyse, sélectionnez Définir la mesure, puis la zone et appuyez sur OK. Ensuite, dessinez manuellement un cercle autour de chaque sphéroïde et une fois la sphère encerclée, appuyez sur Ctrl M pour permettre au programme de calculer la zone sphéroïde en pixels. Convertissez ensuite la zone du sphéroïde en volume à l’aide de cette formule.Enfin, calculez la variation du volume sphéroïde par rapport à son volume le premier jour de la capture de l’image. Lors de l’optimisation de la densité cellulaire pour la formation de sphéroïdes, des densités d’ensemencement plus élevées de 12 000 et 6 000 cellules ont donné des sphéroïdes de forme asymétrique, tandis qu’une densité d’ensemencement de 3 000 cellules a donné un sphéroïde 3D arrondi parfait. Ainsi, 3 000 sphéroïdes de densité cellulaire ont été adaptés pour d’autres expériences.L’évaluation longitudinale de l’impact prolifératif de la co-culture de lignées cellulaires tumorales et fibroblastiques a montré qu’à partir du quatrième jour, les sphéroïdes hétérotypiques se développaient dans une forme ronde idéale par rapport aux sphéroïdes homotypiques. Les sphéroïdes hétérotypiques ont d’abord montré une phase de croissance rapide à partir du quatrième au septième jour, suivie d’une phase plus lente au huitième jour. Le volume sphéroïde a ensuite diminué aux neuvième et 10 jours, reflétant peut-être l’épuisement des nutriments ou un noyau hypoxique et la mort cellulaire.En revanche, les sphéroïdes homotypiques ont présenté une courbe de croissance relativement statique jusqu’au cinquième jour, suivie d’une augmentation progressive de leurs courbes de croissance à partir du sixième jour. Le taux de croissance plus élevé des sphéroïdes hétérotypiques suggère que le contact direct entre la tumeur et les fibroblastes augmente la taille des sphéroïdes tumoraux. Lorsque des sphéroïdes homotypiques Hep3B âgés de trois jours ont été cultivés dans des milieux frais, les cellules ont formé des sphéroïdes parfaitement arrondis après trois jours et ont montré une prolifération continue jusqu’au septième jour.Le taux de croissance a été amélioré lorsque les sphéroïdes ont été maintenus dans des milieux conditionnés LX2, suggérant une prolifération de sphéroïdes tumoraux induite par les fibroblastes. Il est crucial de s’assurer que le BBS stérile est ajouté au fond de la vaisselle pour maintenir une condition humide appropriée pour la formation de sphéroïdes. Aussi, soyez prudent lors de l’inversion du couvercle afin que les sphéroïdes et les gouttelettes ne soient pas perturbés.Les sphéroïdes tumoraux 3D peuvent être fixés ou congelés et stockés pour des applications futures telles que l’immunochimie ou l’immunofluorescence, ainsi que l’extraction d’ARN pour l’analyse transcriptomique. Les sphéroïdes hétérotypiques avec des cellules prémarquées peuvent être imagés et suivis pour fournir des informations sur les interactions cellule-cellule dans le microenvironnement tumoral.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Etude des vecteurs viraux dans un trois dimensions du foie Modèle repeuplée avec le Human Carcinome hépatocellulaire Cell Line HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Déplacement vers le haut : Un Simple et Flexible In Vitro Invasion en trois dimensions Assay protocole

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Vérifier dans un modèle de Culture cellulaire 3D basé sur l’ellipsoïde tête et cou, carcinome épidermoïde de la thérapie

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Modèle de matrice extracellulaire OS en trois dimensions pour l’ostéosarcome

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Matrice entièrement humaine basée sur la tumeur dans l’essai d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Transradial Access Chemoembolization for Hepatocellular Carcinoma Patients

Chemoembolization d’accès transradial pour des patients hepatocellulaires de carcinome

Transarterial chemoembolization (TACE) is the most common modality for treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) at the intermediate stage. TACE is ...

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Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Évaluation de la mort cellulaire à l’aide d’un surnageant sans cellules de probiotiques dans des cultures sphéroïdes tridimensionnelles de cellules cancéreuses colorectales

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Un modèle tridimensionnel des sphéroïdes pour étudier les cellules souches du cancer du côlon

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Un modèle murin pour étudier le rôle des fibroblastes associés au cancer dans la croissance tumorale

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Modèle biomimétique in vitro tridimensionnel de neuroblastome à l’aide d’échafaudages à base de collagène

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...