Name: a three-dimensional spheroid model to investigate the tumor-stromal interaction in hepatocellular carcinoma
Uploaded: 2021-09-30T13:30:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma at JoVE.com

MYWZ è finanziato dal Segretario di Stato per le imprese, l'energia e la strategia industriale e dal Premio Newton 2020 come parte dell'aiuto pubblico allo sviluppo del Regno Unito "ODA" e del fondo Newton. SS è supportato dalla borsa di studio Cancer Research UK Advanced Clinician Scientist C53575 / A29959. SS, FO e HR ricevono finanziamenti come parte di HUNTER, finanziato attraverso una partnership tra Cancer Research UK, Fondazione AIRC e Fundacion Cientifica de la Asociacion Espanola Contra el Cancer.

1. Preparazione cellulare
<ol><li>Eseguire tutti gli esperimenti in condizioni sterili in armadio di sicurezza microbiologica a flusso laminare di Classe II (vedi Tabella dei materiali).<ol>
<li>Accendere il cofano e consentire la stabilizzazione del flusso d'aria.</li>
		<li>Spruzzare accuratamente la superficie interna della cappa con il 70% di etanolo per eliminare ogni possibile contaminazione da parte degli utenti precedenti.</li>
		<li>Preparare il 5% di una soluzione disinfettante in un becher di vetro da 500 ml. Scartare qualsiasi surnatante cellulare o detriti cellulari all'interno della soluzione.</li>
		<li>Pulire accuratamente tutte le micropipette e le scatole di punta con il 70% di etanolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare terreni di coltura cellulare freschi integrando il mezzo ad alto contenuto di glucosio dell'Eagle's medium (DMEM) modificato di Dulbecco con il 10% di siero bovino fetale disattivato dal calore (FBS), l'1% di penicillina / streptomicina (100 unità / mL di penicillina e 100 μg / mL di streptomicina) e 2 mM di L-glutammina. Per la linea cellulare stellata epatica LX2, ridurre la concentrazione del supplemento FBS al 2%.</li>
	<li>Terreni di coltura caldi prima di iniziare l'esperimento.</li>
	<li>Prendi le linee cellulari tumorali HCC Huh7 e Hep3B e le linee cellulari dei fibroblasti COS7 e LX2 dal loro rack di stoccaggio in azoto liquido. Scongelare rapidamente le cellule crioconservate.</li>
	<li>Cellule diluite scongelate con 2 ml di terreno di coltura fresco. Centrifugare le celle a 200 x g per 4 min a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet cellulare in 1 mL di terreno di coltura caldo fresco.</li>
	<li>Cellule di seme in pallone di coltura cellulare T75. Incubare le cellule in un incubatore di colture cellulari in CO2 al 5% a 37 °C in condizioni umidificate al 95% fino a quando le cellule raggiungono il 60%-70% di confluenza.</li>
</ol>2. Raccolta di celle
<ol><li>Aspirare i terreni di coltura e lavare le cellule tre volte con soluzione salina tampone fosfato (PBS).</li>
	<li>Aggiungere 2 ml di tripsina 1x preriscaldata per staccare le cellule aderenti dal fondo dei palloni T75. Incubare a 37 °C in un incubatore per 4 min.</li>
	<li>Inattivare la tripsina aggiungendo 4 ml di terreno di coltura completo. Raccogliere la sospensione cellulare e le celle centrifughe a 200 x g per 4 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospese le cellule in 4 ml di terreno di coltura fresco.</li>
</ol>3. Conteggio delle celle
<ol><li>Ruotare delicatamente la sospensione cellulare per garantire una distribuzione omogenea delle cellule nel tubo della centrifuga.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta da 10 μL, mescolare 10 μL di sospensione cellulare con 10 μL di tripano blu. Pipettare delicatamente la miscela su e giù quattro volte per garantire la completa colorazione della superficie cellulare esterna con il colorante.</li>
	<li>Contare il numero di cellule usando un emocitometro.<ol>
<li>In primo luogo, posizionare un coverslip sopra l'area di conteggio dell'emocitometro prima di caricare la sospensione cellulare colorata.</li>
		<li>Posizionare la punta della pipetta contenente la sospensione cellulare nella scanalatura a V dell'emocitometro. Espellere delicatamente il contenuto della punta nella diapositiva di conteggio.</li>
		<li>Lasciare riposare il liquame per un paio di minuti prima di fissarlo sul palco del microscopio per il conteggio delle cellule. NOTA: per evitare il doppio conteggio, contare solo le celle sui due lati del quadrato grande.</li>
		<li>Conta nelle celle che si sovrappongono alla regola in alto o a destra ed evita quelle che si sovrappongono alla regola in basso o a sinistra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcola il numero totale di celle. NOTA: Numero di cella per ml = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq01.jpg">
</li>
</ol>4. Raccolta di fibroblasti condizionati (CM)
<ol><li>Aspirare i terreni di coltura e lavare le celle LX2 tre volte con PBS.</li>
	<li>Aggiungere 2 ml di tripsina 1x preriscaldata per staccare le cellule aderenti dal fondo dei palloni T75. Incubare il matraccio a 37 °C in un incubatore per 4 min.</li>
	<li>Inattivare la tripsina aggiungendo 4 ml di terreno di coltura completo. Raccogliere la sospensione cellulare e le celle centrifughe a 200 x g per 4 minuti a temperatura ambiente. Contare le celle come da passaggio 3.</li>
	<li>Seme 1 x 106 celle LX2 in piatti da 10 cm3 per 48 h a 37 °C.</li>
	<li>Raccogliere il fibroblasto CM dopo 48 h. Centrifugare a 200 x g per 4 minuti a temperatura ambiente per pellettizzare eventuali celle galleggianti. Filtrare sterile il CM utilizzando un filtro da 0,22 μm fissato sul fondo di siringhe da 20 mL.</li>
	<li>Prelevare il surnatante CM. Aliquota il CM in tubi da 2 ml e conservare a -80 °C per ulteriori applicazioni. NOTA: La soluzione può essere conservata per 6 mesi a -80 °C.</li>
</ol>5. Convalida delle densità cellulari per sferoidi perfetti
<ol><li>Aspirare i terreni di coltura e lavare le linee cellulari HCC tre volte con PBS.</li>
	<li>Aggiungere 2 ml di tripsina 1x preriscaldata per staccare le cellule aderenti dal fondo dei palloni T75. Incubare a 37 °C in un incubatore per 4 min.</li>
	<li>Inattivare la tripsina aggiungendo 4 ml di terreno di coltura completo. Raccogliere la sospensione cellulare e le celle centrifughe a 200 x g per 4 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Contare le celle come da passaggio 3.</li>
	<li>Pipettare diverse densità dalle linee cellulari tumorali (12000, 6000, 3000, 1500, 1000, 750, 500, 250 e 125 cellule) in 20 μL di media sulla superficie interna di un coperchio di 10 cm3 di una capsula di Petri.</li>
	<li>Aggiungere 10 ml di PBS sterile sul fondo del piatto per fornire condizioni umide per il processo di formazione di sferoidi.</li>
	<li>Invertire il coperchio della parabola da 10 cm3 per consentire al supporto, compresa la sospensione cellulare, di appendere su un ambiente umido. Lasciare le goccioline appese per 3 giorni.</li>
	<li>Scatta immagini degli sferoidi con ingrandimento 50x usando un microscopio invertito 3 giorni dopo aver appeso le goccioline originali.</li>
</ol>6. Tumore eterotipico/sferoidi stromali
<ol><li>Sospendere 1500 cellule HCC Huh7 con 1500 cellule di fibroblasti di mammiferi COS7 (rapporto 1:1) in goccioline appese per formare sfere. Aggiungere 10 ml di PBS sterile sul fondo del piatto per fornire condizioni umide per gli sferoidi.</li>
	<li>Invertire il coperchio della parabola da 10 cm3 per consentire al supporto, compresa la sospensione cellulare, di appendere su un ambiente umido. Lasciare le goccioline appese per 3 giorni.</li>
	<li>Scatta immagini degli sferoidi usando un microscopio invertito dal giorno 3 fino al giorno 10 della cultura.<ol>
<li>Metti il piatto da 10 cm3 sul palco del microscopio. Regolare l'ingrandimento del microscopio a 50x per tutti gli sferoidi.</li>
		<li>Aprire il software del microscopio sul computer collegato e regolare la messa a fuoco per avere un'immagine chiara di ogni sferoide. Utilizzare lo strumento di acquisizione sul software del microscopio per salvare le immagini acquisite.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Sferoidi omotipici Hep3B in LX2 CM
<ol><li>Sospendere 3000 celle HCC Hep3B nelle goccioline appese per formare sfere. Aggiungere 10 ml di PBS sterile sul fondo del piatto per fornire condizioni umide per gli sferoidi.</li>
	<li>Invertire il coperchio della parabola da 10 cm3 per consentire al supporto, compresa la sospensione cellulare, di appendere su un ambiente umido. Lasciare le goccioline appese per 3 giorni.</li>
	<li>Trasferire sferoidi Hep3B in 20 μL di CM fresco da cellule LX2 in goccioline pendenti. NOTA: Utilizzare punte per pipette sterili autoclavate non filtrate da 200 μL nel processo di trasferimento di sferoidi per evitare interruzioni o lesioni agli sferoidi formati. Questo anche per eliminare eventuali cellule residue che rimangono non attaccate al singolo sferoide principale.<ol>
<li>Utilizzare una pipetta autoclavata da 20 μL per il processo di trasferimento. Regolare il volume della pipetta a 2 μL. Collegare la punta della pipetta alla pipetta.</li>
		<li>Invertire il coperchio del piatto da 10 cm3 su cui si sono formati gli sferoidi. Fissare il coperchio sul palco di un microscopio ottico. Regolare la messa a fuoco fine del microscopio per rendere visibile ogni sferoide.</li>
		<li>Svuotare con cura l'aria dalla micropipetta premendo il pulsante dello stantuffo. Inserire la punta della pipetta nella goccia, incluso lo sferoide, da trasferire. Avvicinati molto allo sferoide senza toccarlo con la punta.</li>
		<li>Rilasciare delicatamente la pressione sul pulsante dello stantuffo per consentire l'aspirazione dello sferoide nella punta della micropipetta in un mezzo da 2 μL.</li>
		<li>Trasferire lo sferoide in una nuova goccia appesa a un nuovo piatto da 10 cm3 , con nuovi supporti / supporti condizionati / trattamento. NOTA: Assicurarsi che tutti gli sferoidi siano trasferiti correttamente al nuovo piatto da 10 cm3 utilizzando il microscopio ottico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scatta immagini degli sferoidi con ingrandimento 50x usando un microscopio invertito dal giorno del trasferimento (giorno 3) fino al giorno 7 della coltura in LX2 CM.</li>
</ol>8. Calcolo del volume sferoidale
<ol><li>Assegna un identificatore numerico univoco per ogni sferoide in modo che le immagini degli sferoidi corrispondenti possano essere acquisite quotidianamente.</li>
	<li>Analizza le immagini degli sferoidi in crescita utilizzando un pacchetto software di analisi delle immagini.<ol>
<li>Aprire ogni immagine sferoide all'interno del pacchetto software. Utilizzando lo strumento di selezione a mano libera e delineare ogni sferoide. Dal pulsante a discesa Analisi selezionare Imposta misurazione, quindi Area. Premere OK.</li>
		<li>Disegna manualmente un cerchio attorno a ciascun sferoide. Una volta cerchiata la sfera, premere Ctrl + M per consentire al programma di calcolare l'area sferoide in Pixel. Convertire l'area dello sferoide in un volume. NOTA: volume di spheroidmm3 = 0,09403 × <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq02.jpg">
</li>
		<li>Calcolare la variazione del volume sferoide rispetto al suo volume il primo giorno di acquisizione dell'immagine. NOTA: Questo per normalizzare il volume sferoide al volume iniziale e migliorare la precisione data la variazione naturale della dimensione iniziale.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

FO è amministratore e azionista di Fibrofind limited.

Il contesto in cui crescono le linee cellulari sperimentali influenza il loro profilo di espressione genica, l'analisi del percorso e i criteri funzionali. Ad esempio, nelle cellule del cancro al seno, la coordinazione tra diverse vie oncogeniche viene mantenuta solo se le cellule tumorali vengono coltivate in conformazione 3D27. I geni deregolati nel melanoma 3D e negli sferoidi del cancro al seno, ma non nelle cellule monostrato, sono più rilevanti per il tumore umano in vivo28,29. Ad esempio, i livelli di integrina β1 nelle cellule epiteliali mammarie e nelle controparti tumorali erano inferiori ai livelli coltivati in formato 2D29. Inoltre, i fibroblasti nelle strutture 3D tendono a migrare distintamente in termini di morfologia e velocità rispetto a quelli coltivati su plastica30. Inoltre, la rigidità meccanica del substrato di crescita attiva percorsi specifici che favoriscono la trasformazione maligna delle cellule epiteliali normali attraverso la deregolazione della chinasi extracellulare regolata dal segnale (ERK)/Rho nelle cellule epiteliali31. Questi fattori favoriscono la transizione dalla cultura 2D convenzionale ai modelli sferoidi 3D, poiché le colture 3D sono più in linea con la malattia umana.
L'attuale studio ha utilizzato strumenti e forniture di laboratorio convenzionali per produrre un modello sferoide tumorale 3D. Gli sferoidi formati hanno risposto ai segnali di proliferazione provenienti dai fibroblasti, come dimostrato dalla loro crescita significativamente aumentata. Questo modello appartiene alla categoria degli sferoidi tumorali multicellulari. Esistono altre tre categorie di sferoidi tumorali 3D, tra cui tumorosfere32, sfere tumorali derivate da tessuti33,34 e sferoidi multicellulari organotipici35. Negli sferoidi tumorali multicellulari, le cellule tumorali sono sospese in condizioni di bassa adesione per consentire loro di aggregarsi insieme per formare sfere senza toccare il fondo del vaso di coltura36. Sono stati impiegati diversi approcci per fornire questa tecnica indipendente dall'ancoraggio, che vanno dai sistemi rotanti, alle tecniche di sovrapposizione liquida e alle piastre a forma di U di attacco ultra-basso non rivestite37. Nell'HCC, la maggior parte delle colture sferoidi in vitro utilizzano le piastre a 24 o 96 pozzetti ad attacco ultra-basso per formare sferoidi arrotondati18,19,20,21,22. Questa tecnica, tuttavia, non è conveniente e non esclude alcun contatto accidentale cellula-plastica. Altri sistemi utilizzano trans-pozzetti23 o fette di fegato12 per produrre micro-tessuti epatici. L'uso di tessuti umani nel lavoro traslazionale è il gold standard, ma non sempre disponibile o accessibile da molti gruppi di ricerca. L'approccio attuale ha beneficiato della teoria delle goccioline appese. La sospensione cellulare viene aggiunta in modo che gli sferoidi tumorali si formino in un'interfaccia liquido-aria accessibile per formare singole sfere arrotondate38. I vantaggi dell'utilizzo di questa tecnica sono la mancanza di qualsiasi contatto cellula-plastica e la facilità di studiare la diafonia autocrina e paracrina tra cellule tumorali e fibroblastiche. Questo modello è stato ulteriormente convalidato in un altro studio che ha decifrato l'importanza del TREM2 non parenchimale nella protezione del fegato dallo sviluppo di HCC39. Questo lavoro ha dimostrato che il volume degli sferoidi Hep3B e PLC/PRF5 era più elevato nel controllo LX2 CM rispetto a TREM2-overexpressing LX2 CM in modo Wnt-dipendente39.
Nel presente studio, i fibroblasti sono stati mescolati con cellule tumorali prima della formazione di sferoidi per studiare l'impatto proliferativo di questa co-coltura. Altri hanno aggiunto fibroblasti, cellule endoteliali e cellule immunitarie con sospensione di cellule tumorali dopo aver formato uno sferoide tumorale per studiare la migrazione delle cellule stromali nel tumore40,41. L'attuale modello sferoide eterotipico ha mostrato un modello di crescita simile ai modelli precedentemente riportati e al tumore originale in vivo; gli sferoidi mostrano una crescita esponenziale seguita da una fase di crescita ritardata, molto probabilmente a causa dell'esaurimento dei nutrienti e dell'allargamento del nucleo necrotico42. Invece di aggiungere fattori di crescita e mitogeni per aiutare la formazione di sferoidi, questo studio ha utilizzato un approccio più fisiologico avendo questi fattori di crescita dal contatto diretto con i fibroblasti o il loro secretoma nel fibroblasto CM. È essenziale ricordare che le cellule LX2 possono essere ulteriormente attivate trattando con TGFβ1 o PDGF43. Le cellule LX2 sono state trattate con 10 ng/mL TGFβ1 per 48 ore prima di rimuovere il supporto per diverse impostazioni sperimentali. Le cellule LX2 sono state lavate tre volte con PBS (per escludere qualsiasi effetto diretto TGFβ1), e quindi è stato aggiunto un supporto fresco per altre 24 ore prima di raccogliere il CM. Il CM raccolto da LX2 stimolato da TGFβ1 ha indotto la crescita degli sferoidi Hep3B ad un tasso superiore rispetto al CM da controllo LX2 (dati non mostrati). Questo sistema flessibile può prestarsi a co-colture di diverse cellule tumorali più / meno fibroblasti, nonché linee derivate dal paziente. Può anche offrire un test di screening a medio rendimento per farmaci che potrebbero essere rapidamente adottati e inseriti in una pipeline di scoperta di farmaci traslazionale per informare il dosaggio per studi in vivo.
Una limitazione del presente studio è l'uso delle linee cellulari immortalizzate nella formazione sferoide piuttosto che delle cellule tumorali HCC appena isolate e dei fibroblasti associati al cancro. Un'altra limitazione è il confronto della crescita dello sferoide omotipico Hep3B tra CM da LX2 e in mezzi freschi piuttosto che CM da altre linee cellulari non fibroblastiche. Quest'ultima limitazione potrebbe essere affrontata con la modificazione genetica di un gene di interesse nei fibroblasti seguita dall'applicazione del CM da wild type rispetto a fibroblasti geneticamente modificati a sferoidi omotipici.

L'incidenza globale e la mortalità per cancro al fegato hanno continuato ad aumentare, nonostante i progressi nei trattamenti per le malattie del fegato e la maggior parte degli altri tipi di cancro. Nel 2018, il cancro al fegato ha superato il cancro del colon-retto e dello stomaco per diventare la seconda causa più comune di morte correlata al cancro a livello globale1. Nel 2020, ci sono state più di 9.00.000 nuove diagnosi, pari al 4,7% dei casi totali di cancro in tutto il mondo1. Ciò è particolarmente deludente, dato che i fattori di rischio significativi per lo sviluppo dell'HCC, la forma più comune di cancro al fegato, sono ben caratterizzati2. La cirrosi è il fattore di rischio più comune per lo sviluppo di HCC, con l'80% dei casi che si sviluppano sullo sfondo della cirrosi accertata2. Le malattie croniche del fegato, che progrediscono verso la cirrosi, e di conseguenza l'HCC, includono il virus dell'epatite B (HBV), il virus dell'epatite C (HCV), la malattia epatica alcol-correlata (ARLD), le malattie del fegato grasso non alcoliche (NAFLD) - quest'ultimo attribuito all'obesità e al diabete mellito di tipo 2 (T2DM)2,3. Gli attuali protocolli di gestione per l'HCC sono dipendenti dallo stadio e limitati per quelli con cancro avanzato, che il più delle volte hanno un esito scarso4. Ci sono stati progressi significativi nell'uso di inibitori delle chinasi e, più recentemente, trattamenti immuno-oncologici, anche se realisticamente, avvantaggiano solo una minoranza di pazienti con tumori epatici avanzati5. Inoltre, vi è la preoccupazione che gli HCC che si verificano nei pazienti con NAFLD - la causa sottostante in più rapida crescita, che rappresenta oltre il 50% dei casi di HCC di nuova diagnosi nei paesi occidentali, possano essere più resistenti alla terapia con inibitori del checkpoint di morte programmata 1 (PD1)6.
C'è stato un massiccio investimento in studi clinici per i pazienti con HCC, compresi miglioramenti significativi negli studi clinici e nei loro endpoint7. Dopo un decennio di fallimenti, questi investimenti hanno iniziato a cambiare le opportunità per i pazienti. Tuttavia, la realtà è che la percentuale complessiva di responder rimane relativamente scarsa, con pazienti reclutati negli studi che spesso rappresentano male quelli curati nelle cliniche. Il pericolo è che i progressi siano costosi e vadano a beneficio di pochi piuttosto che di molti. Man mano che emergono più terapie candidate per uso singolo o combinazione, è essenziale disporre di modelli preclinici più predittivi delle risposte in vivo. È probabile che si tratti di modelli che incorporano ulteriori fattori che contribuiscono alla variabilità osservata nelle risposte dei pazienti che riflettono meglio l'eterogeneità dell'HCC umano e la complessità patologica8. I sistemi che ricreano le condizioni fisiopatologiche in vivo dell'HCC sono necessari per aiutare a comprendere la biologia dell'evoluzione, della crescita e della progressione del tumore. I modelli sperimentali esistenti di malattie epatiche croniche e HCC di solito rientrano in tre categorie principali: modelli in vivo basati su animali (recensiti in9), colture in vitro10 ed ex vivo11,12 modelli. Gli approcci basati sugli animali sono ampiamente utilizzati per studiare le malattie croniche del fegato, tra cui l'HCC; tuttavia, la variabilità genetica, gli elevati costi di gestione e i diversi sistemi immunitari tra le specie sono tra i principali limiti per l'applicazione di tali modelli9. Mentre alcuni modelli ex vivo forniscono uno strumento eccellente per concentrarsi sui tessuti umani rispetto ad altri modelli di linee cellulari in vitro, la disponibilità di tessuti e il limitato corso di tempo sperimentale ostacolano il loro utilizzo su larga scala.
D'altra parte, i modelli di linee cellulari in vitro rimangono una buona opzione per gli scienziati che lavorano con risorse limitate, con una minore necessità di avere una fornitura costante di tessuti umani freschi10. Questi modelli forniscono anche uno strumento che può essere utilizzato come primo schermo per aiutare con la convalida del target della selezione dei farmaci prima di procedere a modelli in vivo più complessi. La recente modifica delle tradizionali colture monostrato 2D in colture 3D ha migliorato l'efficacia di questi modelli in vitro13,14.
I modelli 3D in vitro possono ricapitolare le caratteristiche critiche osservate in condizioni normali e patologiche umane. In condizioni fisiologiche, la trasduzione del segnale viene avviata attraverso la diafonia cellulare e l'interazione con altre molecole del tessuto connettivo, vale a dire le proteine della matrice extracellulare (ECM), formando una rete di interazione 3D15,16. Il tumore si evolve in una forma sferica 3D durante la trasformazione maligna, per la quale l'ossigeno e le sostanze nutritive sono prontamente abbondanti nell'interfase non tumorale / tumorale. Allo stesso tempo, le condizioni ipossiche predominano nel nucleo del tumore. Questa eterogeneità nella disponibilità di nutrienti si traduce nell'attivazione di segnali spazialmente distinti e vie metaboliche che regolano la tumorigenesi. Queste condizioni sono scarsamente ricapitolate nelle colture monostrato 2D convenzionali14, in cui le cellule crescono su plastica di coltura rigida in modo fisiologicamente irrilevante. Le cellule tumorali comunicano anche con altre cellule non parenchimali, la fonte primaria di ECM, crescita e segnalazione di invasione all'interno del microambiente tumorale. A differenza delle colture 2D, i modelli 3D in vitro possono fornire una piattaforma più adatta per studiare questa interazione tumore-stromale17.
I modelli 3D sono ampiamente utilizzati nel campo dell'HCC e variano nel modo in cui si forma il micro-tessuto18,19,20,21,22,23. La maggior parte di questi modelli utilizzava le piastre di legame ultra-basse18,19,20,21,22 o trans-wells23 nel processo di formazione di sferoidi. Il protocollo descritto introduce la tecnica delle goccioline sospese come modello sferoide tumorale 3D in vitro alternativo, privo di plastica ed economico. Ciò può facilitare la valutazione dei ruoli paracrini e autocrini dei fibroblasti sulla proliferazione delle cellule tumorali in formato 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59429C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>Biorender.com</td>
			<td>Online</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II laminar flow BioMAT2 hood</td>
			<td>Medair Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>M-D1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel sofware</td>
			<td>Microsoft office 365</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism sofware</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat deactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>life tech</td>
			<td>105000064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (100 unit/ml penicillin and 100 &#956;g/ml streptomycin)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 90 mm, triple vented</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon&#8482; Broad Spectrum Disinfectant, 5kg Bucket</td>
			<td>Rely+On&#8482;</td>
			<td>SCI-129999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziess inverted microscope</td>
			<td>Ziess</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional spheroid model to investigate the tumor-stromal interaction in hepatocellular carcinoma

L'aggressività e la mancanza di trattamenti ben tollerati e ampiamente efficaci per il carcinoma epatocellulare avanzato (HCC), la forma predominante di cancro al fegato, razionalizzano il suo rango come la seconda causa più comune di morte correlata al cancro. I modelli preclinici devono essere adattati per ricapitolare le condizioni umane per selezionare i migliori candidati terapeutici per lo sviluppo clinico e aiutare la consegna della medicina personalizzata. I modelli sferoidi cellulari tridimensionali (3D) mostrano promesse come alternativa emergente in vitro alle colture monostrato bidimensionali (2D). Qui, descriviamo un modello sferoide tumorale 3D che sfrutta la capacità delle singole cellule di aggregarsi quando mantenuto in goccioline sospese ed è più rappresentativo di un ambiente in vivo rispetto ai monostrati standard. Inoltre, gli sferoidi 3D possono essere prodotti combinando cellule omotipiche o eterotipiche, più riflettenti dell'eterogeneità cellulare in vivo, consentendo potenzialmente lo studio delle interazioni ambientali che possono influenzare la progressione e le risposte al trattamento. L'attuale ricerca ha ottimizzato la densità cellulare per formare sferoidi tumorali omotipici ed eterotipici 3D immobilizzando le sospensioni cellulari sui coperchi delle piastre di Petri standard da 10 cm3 . L'analisi longitudinale è stata eseguita per generare curve di crescita per gli sferoidi tumorali / fibroblasti omotipici rispetto a quelli eterotipici. Infine, è stato studiato l'impatto proliferativo dei fibroblasti (cellule COS7) e dei miofibroblasti epatici (LX2) sugli sferoidi del tumore omotipico (Hep3B). Una densità di semina di 3.000 cellule (in mezzi da 20 μL) ha prodotto con successo sferoidi eterotipici Huh7 / COS7, che hanno mostrato un costante aumento delle dimensioni fino al giorno di coltura 8, seguito da ritardo della crescita. Questa scoperta è stata corroborata utilizzando sferoidi omotipici Hep3B coltivati in LX2 (linea cellulare stellata epatica umana) mezzo condizionato (CM). LX2 CM ha innescato la proliferazione degli sferoidi Hep3B rispetto agli sferoidi tumorali di controllo. In conclusione, questo protocollo ha dimostrato che gli sferoidi tumorali 3D possono essere utilizzati come strumento semplice, economico e prescreening in vitro per studiare le interazioni tumore-stromale in modo più completo.

Le cellule coltivate in un formato 3D multistrato riflettono in modo più accurato la complessità del microambiente tumorale rispetto alle colture 2D convenzionali24,25. In precedenza, molti studi hanno integrato i terreni di coltura degli sferoidi con diversi mitogeni e fattori di crescita26 per avviare la formazione di sferoidi. In questo studio, tuttavia, l'aggiunta di fibroblasti, o il loro CM, fornisce mitogeni e fattori di crescita essenziali per accelerare la crescita degli sferoidi.
La Figura 1 illustra i dati di uno studio pilota in cui le cellule HCC umane Huh7 sono state seminate in una densità di semina discendente a partire da 12.000 fino a 125 cellule in 20 μL di mezzi freschi per 3 giorni. Una densità di semina di 12.000 cellule ha prodotto sferoidi con una forma asimmetrica, che non è stata corretta anche dopo aver dimezzato la densità di semina cellulare. Tuttavia, gli sferoidi creati da 3000 celle apparivano più arrotondati (Figura 1, riga superiore). Un'ulteriore riduzione della concentrazione cellulare non è riuscita a formare singole sfere (125, 250, 500 sfere a densità cellulare) né ha avuto un aspetto regolare di tipo sferico (1000 e 1500 sferoidi a densità cellulare). Vale la pena ricordare che molte piccole sfere si sono formate ad una densità di 500 cellule tumorali; tuttavia, solo un piccolo sferoide è stato catturato con ingrandimento 50x (Figura 1, riga superiore). Lo stesso protocollo ottimizzato è stato applicato alla linea cellulare dei fibroblasti renali primati COS7 (Figura 1, riga centrale). La sospensione di 125, 250 e 500 fibroblasti COS7 in goccioline pendenti da 20 μL ha portato a uno sferoide arrotondato con più sferoidi più piccoli, mentre densità cellulari più elevate (1000, 1500 e 3000) formavano singoli sferoidi semi-arrotondati. Simile agli sferoidi tumorali Huh7, sospensioni cellulari più elevate (6.000 e 12.000 cellule / sfera) hanno provocato la formazione di aggregati cellulari irregolari, e quindi concentrazioni cellulari più elevate sono state scartate (Figura 1, riga centrale). Basse densità di sospensioni cellulari eterotipiche Huh7/COS7 (125, 250 e 500 cellule/sfera) hanno generato un singolo sferoide con più sferoidi fluttuanti o semi-attaccati (Figura 1, riga inferiore). Gli sferoidi eterotipici a 1000 e 1500 cellule erano semi-arrotondati, mentre una densità di semina di 3000 cellule (1500 per tipo di cellula) dava uno sferoide 3D arrotondato. Come notato in precedenza, densità cellulari più elevate hanno portato alla formazione di aggregati piuttosto che di sferoidi ben definiti (Figura 1, riga inferiore). In conclusione, 3000 sferoidi a densità cellulare sono stati arrotondati, simili ai tumori HCC umani, e sono stati adattati per ulteriori esperimenti. Coltivare le sospensioni cellulari come goccioline appese per 3 giorni è stato sufficiente per promuovere la formazione di sferoidi.
Dopo aver ottimizzato la migliore concentrazione cellulare e il punto temporale per la formazione di sferoidi nel contesto attuale, l'impatto proliferativo delle linee cellulari tumorali e fibroblasti co-colturali è stato valutato longitudinalmente. Le figure 2 e 3 mostrano sferoidi eterotipici Huh7/COS7 (3000 numeri totali di cellule per sferoide) monitorati dal giorno 3 al giorno 10. Gli sferoidi omotipici Huh7 e COS7 (1500 cellule ciascuno) fungevano da controlli. A partire dal giorno 4, gli sferoidi eterotipici sono cresciuti in una forma rotonda ideale rispetto agli sferoidi omotipici (Figura 2). Il volume iniziale dello sferoide eterotipico era più grande di quello di ogni sferoide omotipico. La crescita degli sferoidi è stata calcolata come la variazione del loro volume rispetto al volume iniziale al giorno della formazione degli sferoidi per evitare la normale variazione del volume sferoide (giorno 3, Figura 3). Gli sferoidi eterotipici hanno inizialmente mostrato una rapida fase di crescita a partire dal giorno 4 fino al giorno 7, seguita da una fase più lenta di crescita al giorno 8 (Figure 2, riga superiore e Figura 3). Il volume sferoide è diminuito nei giorni 9 e 10, probabilmente riflettendo l'esaurimento dei nutrienti o un nucleo ipossico e la morte cellulare.
Al contrario, gli sferoidi omotipici Huh7 e COS7 sono cresciuti a un ritmo molto più lento (Figura 2, righe centrali e inferiori; Figura 3). Gli sferoidi omotipici hanno mostrato una curva di crescita relativamente statica fino al quinto giorno di coltura (due giorni dopo la formazione degli sferoidi). A partire dal giorno 6, gli sferoidi omotipici hanno iniziato a mostrare un graduale aumento della loro curva di crescita, anche se ad un tasso significativamente inferiore a quello degli sferoidi eterotipici (Figura 3). In conclusione, gli sferoidi eterotipici tumorali / fibroblasti crescono ad un tasso più elevato rispetto agli sferoidi omotipici suggerendo che il contatto diretto delle cellule tumorali e dei fibroblasti aumenta le dimensioni degli sferoidi tumorali.
Infine, per convalidare i risultati di cui sopra e per studiare l'impatto paracrino delle cellule mesenchimali sulla proliferazione degli sferoidi HCC in un contesto correlato al fegato, gli sferoidi omotipici Hep3B HCC di 3 giorni sono stati coltivati in mezzi freschi regolari o CM da cellule stellate epatiche LX2 (Figura 4 e Figura 5) per altri 4 giorni. A prima vista, 3000 cellule Hep3B hanno formato sferoidi perfettamente arrotondati dopo 3 giorni (Figura 4). Gli sferoidi Hep3B hanno mostrato una proliferazione continua nei media freschi dal giorno 3 al giorno 7 (Figura 4, riga superiore). Il tasso di crescita è stato migliorato quando gli sferoidi Hep3B sono stati mantenuti in LX2 CM (Figura 4, riga inferiore). Questa conversione media-dipendente nella crescita sferoide Hep3B ha mostrato una significatività statistica dal giorno 4 fino alla fine dell'esperimento (Figura 5), suggerendo una proliferazione guidata dai fibroblasti degli sferoidi tumorali.
In conclusione, questo studio ha modificato con successo le colture sferoidi 3D esistenti per sfruttare la diafonia tra cellule tumorali HCC e diverse linee cellulari di fibroblasti e studiare il significato proliferativo di questa interazione cellulare diretta e indiretta (Figura 6). È necessaria un'ulteriore caratterizzazione degli sferoidi formati per migliorare il modo in cui le cellule tumorali interagiscono con il microambiente circostante.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig01.jpg"> Figura 1: Ottimizzazione della densità cellulare ottimale per la formazione di sferoidi. Le colonne rappresentano diverse densità di semina delle celle e le righe rappresentano gli sferoidi formati da celle Huh7 (riga superiore), celle COS7 (riga centrale) e celle eterotipiche Huh7/COS7 (riga inferiore). Le immagini rappresentano sferoidi formati dopo aver sospeso 125, 250, 500, 1000, 1500, 3000, 6000 e 12000 celle (da sinistra a destra) in supporti da 20 μL per 3 giorni. Lo studio pilota ha incluso due sferoidi per condizione e le immagini sono state scattate con ingrandimento 50x, barra di scala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig02.jpg"> Figura 2: Crescita sferoide eterotipica rispetto a quella omotipica. Le colonne rappresentano il giorno in cui sono state scattate le immagini sferoidi e le righe mostrano immagini rappresentative per gli sferoidi formati da celle Huh7 (riga superiore), celle COS7 (riga centrale) e celle Huh7 / COS7 (riga inferiore). Le immagini rappresentano gli sferoidi formatisi dopo aver sospeso 3000 cellule da ogni condizione (omotipico Huh7, COS7 o gli sferoidi eterotipici Huh7/COS7) di diversi punti temporali da sinistra a destra. L'esperimento ha incluso 10 sferoidi per condizione e le immagini sono state scattate con ingrandimento 50x, barra di scala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig03.jpg"> Figura 3: Analisi longitudinale della crescita sferoide eterotipica rispetto a quella omotipica. Il grafico mostra la curva di crescita degli sferoidi eterotipici Huh7/COS7 rispetto agli sferoidi omotipici Huh7 e COS7. I dati sono presentati come ± medi s.e.m; n = 10 sferoidi indipendenti. ** p < 0,01; p < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig04.jpg"> Figura 4: Crescita degli sferoidi omotipici Hep3B in LX2 CM. Le colonne rappresentano il giorno in cui sono state acquisite le immagini sferoidi e le righe mostrano immagini rappresentative di sferoidi Hep3B coltivati in terreni di coltura DMEM freschi (riga superiore) o LX2 CM (riga inferiore). L'esperimento ha incluso sette sferoidi per condizione (nuovi media o LX2 CM) e le immagini sono state scattate con ingrandimento 50x, barra di scala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig05.jpg"> Figura 5: Analisi longitudinale della crescita omotipica dello sferoide Hep3B. Il grafico mostra la curva di crescita degli sferoidi Hep3B nei terreni di coltura DMEM freschi o LX2 CM. I dati sono presentati come ± medi s.e.m; n = 7 sferoidi indipendenti. p < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig06.jpg"> Figura 6: Rappresentazione schematica del processo di formazione sferoide. La sospensione cellulare è pipettata sul coperchio interno della capsula di Petri da 10 cm3 . Il coperchio viene invertito e mantenuto per 3 giorni per consentire la formazione di sferoidi omotipici o eterotipici. Le immagini sferoidi sono scattate con un ingrandimento di 50x. La figura viene creata utilizzando uno strumento di illustrazione scientifica basato sul Web (vedere Tabella dei materiali). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Mancano modelli completi in vitro che ricapitolino fedelmente la malattia umana pertinente. Il presente studio presenta la creazione e la coltura tridimensionale (3D) di sferoidi tumorali, uno strumento affidabile in vitro per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare umano.

Un modello sferoide tridimensionale per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

Gli sferoidi tumorali 3D hanno sostituito la tradizionale tecnica 2D monostrato come gold standard per la ricerca sul cancro in vitro. Questi modelli consentono la co-coltura di più tipi di cellule che riflettono l'eterogeneità del microambiente tumorale e consentono lo sfruttamento delle interazioni spaziali. I vantaggi dell'utilizzo del metodo delle goccioline sospese per generare sferoidi 3D sono la mancanza di interazione cellula-plastica e la facilità di studiare l'interazione tra le cellule tumorali e le cellule non tumorali.Questa tecnica fornisce anche un modo riproducibile ed economico per modellare l'interazione tumore-stromale. I tumoroidi 3D sono preziosi modelli preclinici e sono spesso usati come strumento di screening farmacologico. Questo metodo può essere applicato per studiare gli effetti farmacologici di più composti sulla crescita tumorale e sul microambiente circostante.Il processo di formazione degli sferoidi è facile da usare e richiede attrezzature di laboratorio di coltura cellulare convenzionali. Gli sferoidi possono essere ripresi utilizzando qualsiasi microscopio a luce invertita da banco e l'analisi delle dimensioni e della forma dello sferoide può essere eseguita utilizzando un software di analisi delle immagini online ampiamente disponibile. Per iniziare, rimuovere le linee cellulari tumorali HCC Huh7 e Hep3B e le linee cellulari dei fibroblasti COS-7 e LX2 dal loro rack di stoccaggio in azoto liquido e scongelarle rapidamente.Dopo lo scongelamento, diluire le cellule scongelate con due millilitri di terreno di coltura fresco. Centrifugare le cellule. Scartare il surnatante e risospescere il pellet cellulare in un millilitro di terreno di coltura caldo fresco.Quindi seminare le cellule in palloni di coltura cellulare T75 e incubarle in un incubatore di colture cellulari fino a quando le cellule raggiungono da 60 a 70 e confluenza. Per la raccolta cellulare, aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule tre volte con PBS. Quindi, per staccare le cellule aderenti dal fondo dei palloni, aggiungere due millilitri di tripsina preriscaldata e incubare a 37 gradi Celsius.Dopo quattro minuti, inattivare la tripsina aggiungendo quattro millilitri di terreno di coltura completo e raccogliere la sospensione cellulare, quindi centrifugare le cellule ed eliminare il surnatante prima di risospendere le cellule in un millilitro di terreno di coltura fresco. Infine, aggiungere altri tre millilitri di terreno di coltura fresco. Per contare le cellule, ruotare delicatamente la sospensione cellulare.Quindi utilizzando una pipetta da 10 microlitri, mescolare 10 microlitri della sospensione cellulare con 10 microlitri di tripano blu e pipettare delicatamente la miscela su e giù quattro volte per garantire la completa colorazione della superficie cellulare esterna con il colorante. Quindi, posizionare una coverslip sopra l'area di conteggio dell'emocitometro. Quindi posizionare la punta della pipetta contenente la miscela di cellule accanto al bordo del coperchio ed espellere delicatamente il contenuto della punta nella diapositiva di conteggio.Dopo aver atteso qualche minuto che il liquame si depositi, fissare l'emocitometro sullo stadio del microscopio e contare le cellule che si sovrappongono alla riga superiore o destra evitando quelle che si sovrappongono alla regolazione inferiore o sinistra. Infine, calcola il numero totale di celle usando questa formula. Dopo aver aspirato il terreno di coltura, lavare le cellule LX2 tre volte con PBS.Staccare le cellule usando la tripsina come dimostrato in precedenza e centrifugarle. Dopo aver contato le cellule come dimostrato in precedenza, seminare una volta 10 alla sesta cella LX2 in piatti da 10 centimetri cubici e incubare a 37 gradi Celsius. Dopo 48 ore, raccogliere il mezzo condizionato dai fibroblasti e centrifugare per pellettizzare eventuali cellule galleggianti.Il filtro sterilizza il mezzo condizionato utilizzando un filtro da 0,22 micron collegato a una siringa da 20 millilitri. Quindi aliquotare il fluido in due tubi millilitri per la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Aggiungere 10 millilitri di PBS sterile sul fondo di un piatto da 10 centimetri cubici per fornire condizioni umide per gli sferoidi.Quindi sospendere 1.500 cellule HCC HuH7 con 1.500 cellule di fibroblasti di mammiferi COS-7 in goccioline appese per formare sfere. Capovolgere il coperchio del piatto per consentire al supporto, compresa la sospensione cellulare, di appendere su un ambiente umido. Dopo tre giorni, per scattare immagini degli sferoidi, metti il piatto sul palco di un microscopio invertito e regola l'ingrandimento a cinque volte.Quindi, aprire il software del microscopio sul computer collegato e regolare la messa a fuoco per avere un'immagine chiara di ogni sferoide. Quindi utilizzare lo strumento snap sul software del microscopio per acquisire le immagini e salvare le immagini acquisite. Aggiungere 10 millilitri di PBS sterile sul fondo di un piatto di 10 centimetri cubici.Quindi sospendere 3.000 cellule HCC Hep3B nelle goccioline appese per formare sfere e invertire il coperchio del piatto permettendo alle goccioline di appendere su un ambiente umido per tre giorni. Quindi, trasferire gli sferoidi Hep3B in 20 microlitri di mezzi di condizione freschi da cellule LX2 in goccioline sospese. Quindi capovolgere il coperchio del piatto su cui si formano gli sferoidi e fissare il coperchio sul palco di un microscopio ottico.Regolare la messa a fuoco fine del microscopio per rendere visibile ogni sferoide come dimostrato in precedenza. Dopo aver premuto il pulsante dello stantuffo per svuotare accuratamente l'aria dalla micropipetta, inserire la punta della pipetta nella goccia contenente lo sferoide da trasferire. Avvicinati molto allo sferoide senza toccarlo con la punta.Quindi, rilasciare delicatamente la pressione sul pulsante dello stantuffo per consentire l'aspirazione dello sferoide nella punta della micropipetta in due microlitri di media. Quindi trasferire lo sferoide in una nuova goccia appesa a un nuovo piatto di 10 centimetri cubici. Scatta immagini degli sferoidi a cinque volte l'ingrandimento usando un microscopio invertito dal giorno del trasferimento fino al settimo giorno di coltura nel supporto condizionato LX2.Per analizzare le immagini degli sferoidi in crescita, aprire ogni immagine sferoide in un software di analisi delle immagini e utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per delineare ogni sferoide. Quindi, dal pulsante a discesa dell'analisi, selezionare Imposta misurazione, quindi Area e premere OK. Quindi, disegna manualmente un cerchio attorno a ciascun sferoide e una volta che la sfera è cerchiata, premi Ctrl M per consentire al programma di calcolare l'area sferoide in pixel. Quindi convertire l'area dello sferoide in un volume utilizzando questa formula.Infine, calcola la variazione del volume sferoide rispetto al suo volume il primo giorno di acquisizione dell'immagine. Durante l'ottimizzazione della densità cellulare per la formazione di sferoidi, densità di semina più elevate di 12.000 e 6.000 cellule hanno prodotto sferoidi con una forma asimmetrica, mentre una densità di semina di 3.000 cellule ha dato un perfetto sferoide 3D arrotondato. Pertanto, 3.000 sferoidi a densità cellulare sono stati adattati per ulteriori esperimenti.La valutazione longitudinale dell'impatto proliferativo delle linee cellulari tumorali e fibroblasti co-coltivatrici ha mostrato che dal quarto giorno in poi, gli sferoidi eterotipici sono cresciuti in una forma rotonda ideale rispetto agli sferoidi omotipici. Gli sferoidi eterotipici hanno inizialmente mostrato una rapida fase di crescita a partire dal quarto al settimo giorno, seguita da una fase più lenta all'ottavo giorno. Il volume sferoide è poi diminuito nei giorni nove e 10, probabilmente riflettendo l'esaurimento dei nutrienti o un nucleo ipossico e la morte cellulare.Al contrario, gli sferoidi omotipici hanno mostrato una curva di crescita relativamente statica fino al quinto giorno, seguita da un graduale aumento delle loro curve di crescita dal sesto giorno in poi. Il più alto tasso di crescita degli sferoidi eterotipici suggerisce che il contatto diretto tra tumore e fibroblasti aumenta le dimensioni degli sferoidi tumorali. Quando gli sferoidi omotipici Hep3B di tre giorni sono stati coltivati in terreni freschi, le cellule hanno formato sferoidi perfettamente arrotondati dopo tre giorni e hanno mostrato una proliferazione continua fino al settimo giorno.Il tasso di crescita è stato migliorato quando gli sferoidi sono stati mantenuti in terreni condizionati LX2, suggerendo una proliferazione guidata dai fibroblasti degli sferoidi tumorali. È fondamentale assicurarsi che il BBS sterile venga aggiunto sul fondo dei piatti per mantenere condizioni umide adeguate per la formazione di sferoidi. Inoltre, fai attenzione mentre inverti il coperchio in modo che gli sferoidi e le goccioline non vengano interrotti.Gli sferoidi tumorali 3D possono essere fissati o congelati e conservati per applicazioni future come l'immunochimica o l'immunofluorescenza, nonché l'estrazione dell'RNA per l'analisi trascrittomica. Gli sferoidi eterotipici con cellule pre-marcate possono essere ripresi e tracciati per fornire informazioni sulle interazioni cellula-cellula all'interno del microambiente tumorale.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Studio di vettori virali in un tridimensionale fegato Modello ripopolata con l&#39;Umano carcinoma epatocellulare Linea cellulare HepG2

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Ricerca

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Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

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Lo spostamento verso l'alto: Un semplice e flessibile In Vitro tridimensionale invasione protocollo di analisi

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

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