Name: a three-dimensional spheroid model to investigate the tumor-stromal interaction in hepatocellular carcinoma
Uploaded: 2021-09-30T13:30:00
Duration: 12 min 24 s
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MYWZは、英国の公式開発援助「ODA」とニュートン基金の一環として、ビジネス、エネルギー、産業戦略担当国務長官とニュートン賞2020によって資金提供されています。SSは、がん研究英国先端臨床科学者フェローシップC53575 / A29959によってサポートされています。SS、FO、HRは、がん研究英国、フォンダツィオーネAIRC、フンダシオン・シエンティフィカ・デ・ラ・アソシアシオン・エスパニョーラ・コントラ・エル・ガンズとのパートナーシップを通じて資金提供を受け、HUNTERの一環として資金を受け取っています。

1. 細胞の調製
<ol><li>クラスIIの層流微生物学的安全キャビネットで滅菌条件下ですべての実験を行います( 材料表を参照)。<ol>
<li>フードをオンにして、気流の安定化を可能にします。</li>
		<li>内部フード表面に70%エタノールを十分にスプレーして、以前のユーザーからの汚染を排除します。</li>
		<li>500 mL ガラスビーカーに消毒液の5%を準備します。溶液内の細胞上清または細胞デブリを捨てます。</li>
		<li>70%エタノールでマイクロピペットとチップボックスをすべて十分に洗浄してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ダルベックの修飾イーグル培地(DMEM)高グルコース培地を10%熱失活ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン/ストレプトマイシン1%(ペニシリン100単位/mL、ストレプトマイシン100μg/mL)、2mM-LLを添加して、新鮮な細胞培養培地を調製します。LX2肝星状細胞株の場合、FBSサプリメントの濃度を2%に下げる。</li>
	<li>実験を開始する前に温かい培養メディア。</li>
	<li>フー7とHep3B HCC腫瘍細胞株とCOS7およびLX2線維芽細胞株を液体窒素の貯蔵ラックから取り出します。急速に凍結保存細胞を解凍する。</li>
	<li>2 mLの新鮮な培養培地で解凍した細胞を希釈します。遠心分離細胞は室温で4分間200× g で。上清を捨て、新鮮な温かい培養培地の1mLで細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>T75細胞培養フラスコの種子細胞。細胞が60%~70%のコンフルエンスに達するまで、95%加湿条件下で37°Cで5%CO2 の細胞培養インキュベーターで細胞をインキュベートします。</li>
</ol>2. セルコレクション
<ol><li>吸引培養培地及びリン酸緩衝塩(PBS)で細胞を3回洗浄する。</li>
	<li>2 mLのプリウォームド 1x トリプシンを加えて、T75 フラスコの底部から接着細胞を取り外します。インキュベーターで37°Cで4分間インキュベートします。</li>
	<li>完全な培養培地の4 mLを加えることによってトリプシンを不活性化する。細胞懸濁液と遠心分離細胞を室温で4分間200xgで回収します。上清を捨て、4mLの新鮮な培養培地で細胞を再懸濁する。</li>
</ol>3. セルカウント
<ol><li>遠心分離管内の細胞の均質な分布を確保するために細胞懸濁液を穏やかに渦巻く。</li>
	<li>10 μL ピペットを使用して、10 μL のセル懸濁液を 10 μL の Trypan ブルーと混合します。混合物を上下に4回軽くピペット化し、染料で外細胞表面の完全な染色を確実にします。</li>
	<li>ヘモサイトメーターを使用して細胞の数を数えます。<ol>
<li>まず、染色された細胞懸濁液を積み込む前に、血球計計面積の上にカバースリップを置きます。</li>
		<li>細胞懸濁液を含むピペットチップをヘモサイトメーターのV溝に入れる。チップの内容をカウントスライドにそっと出します。</li>
		<li>スラリーを残して、細胞数を数える顕微鏡の段階で固定する前に数分間沈着します。 注: 二重カウントを避けるために、大きい四角形の両側のセルのみをカウントします。</li>
		<li>上または右の判決を重ねるセル内でカウントし、下または左の判決をオーバーラップするセルを避けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>セルの総数を計算します。 注: 1 ml あたりのセル数 = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq01.jpg">
</li>
</ol>4. 繊維芽細胞コンディションメディア(CM)の収集
<ol><li>吸引培養培地をPBSでLX2細胞を3回洗浄する。</li>
	<li>2 mLのプリウォームド 1x トリプシンを加えて、T75 フラスコの底部から接着細胞を取り外します。フラスコを37°Cでインキュベーターで4分間インキュベーターします。</li>
	<li>完全な培養培地の4 mLを加えることによってトリプシンを不活性化する。細胞懸濁液と遠心分離細胞を室温で4分間200xgで回収します。ステップ 3 に従ってセルをカウントします。</li>
	<li>シード 1 x 106 LX2 細胞を 10 cm3 の皿で 37 °C で 48 時間のために。</li>
	<li>48時間後に線維芽細胞CMを収集する。200 x g で 4 分間の遠心分離機を室温で任意の浮遊細胞をペレットにします。20 mL シリンジの底部に固定された 0.22 μm フィルタを使用して、CM を滅菌フィルターします。</li>
	<li>CMを2 mLチューブに上清CM.アリコートを回収し、-80°Cで保管して、さらなる用途に向けて保管してください。 注:溶液は-80°Cで6ヶ月間保存することができます。</li>
</ol>5. 完璧な回転楕円体のための細胞密度の検証
<ol><li>吸引培養培地を、PBSでHCC細胞株を3回洗浄する。</li>
	<li>2 mLのプリウォームド 1x トリプシンを加えて、T75 フラスコの底部から接着細胞を取り外します。インキュベーターで37°Cで4分間インキュベートします。</li>
	<li>完全な培養培地の4 mLを加えることによってトリプシンを不活性化する。細胞懸濁液と遠心分離細胞を室温で4分間200xgで回収します。</li>
	<li>ステップ 3 に従ってセルをカウントします。</li>
	<li>ペトリ皿の10cm3 蓋の内部表面上の20μLの培地における腫瘍細胞株(12000、6000、3000、1500、1500、1000、1000、500、250、および125細胞)とは異なる密度のピペット。</li>
	<li>皿の底に10mLの無菌PBSを加えて、スフェロイド形成のプロセスに湿気の多い条件を提供します。</li>
	<li>10 cm3 皿の蓋を反転させて、細胞懸濁液を含むメディアが湿気の多い環境にぶら下がることができるようにします。ぶら下がった液滴を3日間放置します。</li>
	<li>元の液滴を吊り下げてから3日後に反転した顕微鏡を使用して、50倍の倍率で回転楕円体の画像を撮ります。</li>
</ol>6. 不均一性腫瘍/間質スフェロイド
<ol><li>1500個のCOS7哺乳動物線維芽細胞を有する1500のHuh7 HCC細胞を吊り下げて(1:1比)、球体を形成する垂滴を下す。皿の底に10mLの無菌PBSを加えて、スフェロイドに湿度の高い条件を提供します。</li>
	<li>10 cm3 皿の蓋を反転させて、細胞懸濁液を含むメディアが湿気の多い環境にぶら下がることができるようにします。ぶら下がった液滴を3日間放置します。</li>
	<li>3日目から10日目までの逆顕微鏡を使用して、スフェロイドの画像を撮影します。<ol>
<li>10cm3の皿を顕微鏡のステージに置きます。すべての回転楕円体の50倍で顕微鏡の倍率を調整します。</li>
		<li>取り付けられたコンピュータで顕微鏡ソフトウェアを開き、すべての回転楕円体の鮮明な画像を持つフォーカスを調整します。取得した画像を保存するには、顕微鏡ソフトウェアの キャプチャツール を使用してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. LX2 CMのホモタイプHep3Bスフェロイド
<ol><li>吊り下げ液滴に3000 Hep3B HCC細胞を懸濁させて球体を形成する。皿の底に10mLの無菌PBSを加えて、スフェロイドに湿度の高い条件を提供します。</li>
	<li>10 cm3 皿の蓋を反転させて、細胞懸濁液を含むメディアが湿気の多い環境にぶら下がることができるようにします。ぶら下がった液滴を3日間放置します。</li>
	<li>ヘプ3BスフェロイドをLX2細胞から20μLの新鮮なCMに吊り下げ液滴に移します。 注:形成されたスフェロイドへの中断や損傷を避けるために、スフェロイド転送の過程で無菌オートクレーブされた200 μLピペットチップを使用してください。これはまた、メインの単一の回転楕円体に未接続のまま残存細胞を除去する。<ol>
<li>トランスファープロセスにはオートクレーブ20μLピペットを使用してください。ピペットのボリュームを2 μLに調整し、ピペットチップをピペットに取り付けます。</li>
		<li>スフェロイドが形成された10 cm3 皿の蓋を反転させます。軽い顕微鏡のステージでふたを固定します。顕微鏡の細かい焦点を合わせて、各回転楕円体を見えるようにします。</li>
		<li>プランジャーボタンを押して、マイクロピペットから空気を慎重に空にします。移すピペットチップを、回転楕円体を含む液滴に挿入する。先端で触れることなく、スフェロイドに非常に近づく。</li>
		<li>プランジャーボタンの圧力を静かに放して、2μLメディアのマイクロピペットチップにスフェロイドを吸い込みます。</li>
		<li>新しい10 cm3 皿にぶら下がっている新しい液滴にスフェロイドを移し、新しいメディア/コンディショナ付きのメディア/トリートメントを受けます。 メモ:すべての回転楕円体が、光顕微鏡を使用して新しい10 cm3 皿に正常に転送されていることを確認してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>LX2 CMで転写した日(3日目)から7日目までの逆顕微鏡を使用して、50倍の倍率でスフェロイドの画像を撮ります。</li>
</ol>8. スフェロイド体積の計算
<ol><li>一致した回転楕円体の画像を毎日キャプチャできるように、各回転楕円体に一意の数値識別子を割り当てます。</li>
	<li>画像解析ソフトウェア パッケージを使用して、成長するスフェロイドの画像を解析します。<ol>
<li>ソフトウェア パッケージ内の各回転楕円体イメージを開きます。 フリーハンド 選択ツールを使用して、各回転楕円体の輪郭を描きます。 [分析 ] ドロップダウン ボタンで、[ 測定の設定]、[ 面積] の順に選択します。 [OK] をクリックします。</li>
		<li>各回転楕円体の周りに手動で円を描きます。球が丸で囲まれたら、 Ctrl + M を押して、プログラムがピクセル単位で回転楕円体領域を計算できるようにします。回転楕円体の面積をボリュームに変換します。 メモ:回転楕円体3=0.09403× <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq02.jpg">
</li>
		<li>イメージ キャプチャの初日の体積に対する回転楕円体体積の変化を計算します。 注: これは、回転楕円体の体積を開始ボリュームに正規化し、開始サイズの自然な変動を考慮して精度を向上させるためです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

FOは、フィブロフィンド・リミテッドの取締役および株主です。

実験細胞株が成長するコンテキストは、その遺伝子発現プロファイル、経路解析、および機能基準に影響を与えます。例えば、乳癌細胞では、がん細胞が3Dコンフォメーション27で増殖した場合にのみ、異なる発癌経路間の協調が保持される。3D黒色腫および乳癌スフェロイドにおける調節緩和された遺伝子は、単層細胞には含まれていないが、生体内ヒト腫瘍28,29に関連する。例えば、乳腺上皮細胞および腫瘍の対応するβ1インテグリンレベルは、2Dフォーマット29で増殖したレベルよりも低かった。さらに、3D構造の線維芽細胞は、plastic30で培養されたものと比較して、形態および速度の点で明確に移行する傾向がある。さらに、成長基質の機械的剛性は、上皮細胞31における細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)/Rhoの調節緩和を介して正常上皮細胞の悪性形質転換を促進する特定の経路を活性化する。これらの要因は、3D培養がヒト疾患に合致するため、従来の2D培養から3Dスフェロイドモデルへの移行を優先する。
現在の研究では、従来の実験室用ツールと供給を使用して、3D腫瘍回転楕円体モデルを作成しました。形成されたスフェロイドは、線維芽細胞から来る増殖信号に反応した。このモデルは多細胞腫瘍スフェロイドカテゴリーに属する。3D腫瘍スフェロイドには、腫瘍球32、組織由来腫瘍球体33、34、およびorganotypic多細胞スフェロイド35を含む3つのカテゴリーがあります。多細胞腫瘍スフェロイドにおいて、腫瘍細胞は、培養容器36の底部に触れることなく、それらを凝集させて球体を形成できるように、低接着条件で懸濁される。回転システム、液体オーバーレイ技術、およびコーティングされていない超低い取り付けU字型プレート37に至るまで、このアンカレッジ非依存技術を提供するためにいくつかのアプローチが採用されています。HCCでは、 インビトロ スフェロイド培養物の大部分は、超低結合24-または96ウェルプレートを使用して、丸みを帯びたスフェロイド18、19、20、21、22を形成する。しかし、この技術は費用対効果が高くなく、偶発的なセルプラスチック接触を排除するものではありません。他のシステムは、肝臓の微小組織を生成するためにトランスウェル23 または肝臓スライス12 を使用します。翻訳作業で人間の組織を使用することはゴールドスタンダードですが、多くの研究グループが常に利用できるわけではありません。現在のアプローチは、ぶら下がった液滴理論の恩恵を受けた。細胞懸濁液は、腫瘍回転楕円体が単一の丸い球体38を形成するためにアクセス可能な液体空気界面で形成されるように加えられる。この技術を使用する利点は、細胞とプラスチックの接触の欠如と腫瘍と線維芽細胞の間のオートクリンとパラクリンクロストークの研究の容易さである。このモデルは、HCC開発39から肝臓を保護する上で非層状TREM2の重要性を解読する別の研究でさらに検証された。この研究は、Hep3BおよびPLC/PRF5スフェロイドの両方の体積が、制御LX2 CMとTREM2過剰発現LX2 CMのWnt依存的な方法で高いことを示した39。
今回の研究では、線維芽細胞をスフェロイド形成前に腫瘍細胞と混合し、この共培養の増殖影響を調べた。他の人は、腫瘍40,41への間質細胞の移行を研究するために腫瘍スフェロイドを形成した後、線維芽細胞、内皮細胞、および腫瘍細胞懸濁液を有する免疫細胞を添加した。現在のヘテロジピックスフェロイドモデルは、以前に報告されたモデルと元のin vivo腫瘍と同様の成長パターンを示した。スフェロイドは、栄養分の枯渇と壊死的なコア42の拡大のために、成長期の遅れが続く指数関数的成長を示す。この研究は、スフェロイド形成を助けるために成長因子およびマイトゲンを追加する代わりに、線維芽細胞CMにおける線維芽細胞またはその分泌物との直接接触からこれらの成長因子を有することによって、より生理学的なアプローチを用いた。LX2細胞は、TGFβ1またはPDGF43で処理することによってさらに活性化することができることを言及することが不可欠である。LX2細胞は、異なる実験設定のために培地を除去する前に、48時間10ng/mL TGFβ1で処理されています。LX2細胞をPBSで3回洗浄し(直接TGFβ1効果を除く)、CMを採取する前にさらに24時間新鮮な培地を添加した。TGFβ1刺激LX2から収集されたCMは、コントロールLX2からCMよりも高い速度でHep3Bスフェロイドの成長を誘導した(データは示していない)。この柔軟なシステムは、異なる癌細胞の共培養に適しています プラス/マイナス線維芽細胞, だけでなく、患者由来のライン.また、インビボ研究の投薬を知らせるために、翻訳創薬パイプラインに迅速に採用され、挿入できる薬物に対する中スループットスクリーニングアッセイを提供することもできます。
現在の研究の限界は、新たに単離されたHCC腫瘍細胞および癌関連線維芽細胞ではなく、スフェロイド形成における不死化細胞株の使用である。もう一つの制限は、LX2からのCMと他の非線維芽細胞株からのCMではなく新鮮な培地におけるCMの間でホモタイプHep3Bスフェロイドの成長を比較することです。後者の制限は、線維芽細胞の関心のある遺伝子の遺伝子組み換えによって対処することができ、続いてCMを野生型から遺伝子組み換え線維芽細胞に適用してホモタイピックスフェロイドに適用する。

肝臓疾患および他のほとんどのタイプの癌の治療の進歩にもかかわらず、肝臓癌による世界的な発生率と死亡率は増加し続けている。2018年、肝臓癌は大腸癌と胃癌を上回り、世界的に癌関連死の2番目に一般的な原因となった。2020年には9,000件以上の新しい診断があり、世界のがん症例全体の4.7%を占めています。これは、肝臓癌の最も一般的な形態であるHCCの発症に対する重大な危険因子が十分に特徴付かされていることを考えると、特に残念です2。肝硬変はHCCの発症に最も一般的な危険因子であり、80%の症例が確立された肝硬変の背景に発症する2。肝硬変に進行し、その結果HCCに進行する慢性肝疾患には、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、アルコール関連肝疾患(ARLD)、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、後者は肥満および2型糖尿病(T2DM)2,3に起因する。HCCの現在の管理プロトコルはステージに依存し、進行癌の患者には限られており、ほとんどの場合、結果が悪い4。キナーゼ阻害剤を使用して大きな進歩があり、最近では免疫腫瘍学の治療は、現実的には、進行した肝臓癌を有する患者の少数派にしか利益をもたらさない5。さらに、NAFLD患者に生じるHCCが、最も急速に成長している根本的な原因である、西側諸国で新たに診断されたHCC症例の50%以上を占める、プログラム死亡1(PD1)チェックポイント阻害剤療法に対してより耐性があるかもしれないという懸念がある6。
HCC患者の臨床試験には、臨床試験とそのエンドポイントの大幅な改善を含む大規模な投資が行われています。10年間の失敗の後、これらの投資は患者の機会を変え始めました。しかし、実際には、回答者の全体的な割合は比較的貧しいままであり、患者はしばしば診療所で世話をしている患者を不十分に表す試験に採用されています。危険なのは、進歩は高価であり、多くの人ではなく少数の人々に利益をもたらすことです。単回使用または組み合わせに対してより多くの候補療法が出現するにつれて、前臨床モデルをin vivo応答のより予測的にすることが不可欠である。これらは、ヒトHCCの不均一性および病理学的複雑性をより良く反映する患者応答に見られる変動性に寄与する追加の要因を組み込んだモデルである可能性が高い8。HCCの生体内病態を再現するシステムは、腫瘍の進化、成長、および進行の生物学を理解するのに役立つ必要がある。慢性肝疾患とHCCの既存の実験モデルは、通常、生体内動物ベースのモデル(レビューin9)、インビトロ培養10、およびex vivo11,12モデルの3つの主要なカテゴリに該当します。動物ベースのアプローチは、広範囲に慢性肝疾患を研究するために使用されます, HCCを含む;しかし、遺伝的変動、高い実行コスト、および種間の異なる免疫系は、このようなmodel9を適用するための主な制限の一つです。一部のex vivoモデルは、他のインビトロ細胞系モデルと比較してヒト組織に焦点を当てるための優れたツールを提供しますが、組織の可用性と限られた実験時間コースは、大規模での使用を妨げます。
一方、インビトロ細胞系モデルは、限られた資源で作業する科学者にとって良い選択肢であり、新鮮なヒト組織10の一定の供給を必要としない。これらのモデルはまた、より複雑なin vivoモデルに進む前に、薬物選択のターゲット検証を支援する最初の画面として使用できるツールを提供します。従来の2D単層培養物を3D培養物に最近改変することで、これらのin vitroモデル13,14の有効性が向上した。
3D in vitroモデルは、ヒトの正常および病理学的状態で見られる重要な特徴を再現することができます。生理学的条件下では、シグナル伝達は細胞クロストークおよび他の結合組織分子との相互作用、すなわち細胞外マトリックス(ECM)タンパク質との相互作用を通じて開始され、3D相互作用ネットワーク15,16を形成する。腫瘍は悪性形転換の間に3次元球形で進化し、酸素および栄養素は非腫瘍/腫瘍間相に容易に豊富である。同時に、低酸素状態は腫瘍コアで優勢である。栄養の可用性のこの不均一性は、腫瘍形成を調節する空間的に明確なシグナル伝達および代謝経路の活性化をもたらす。これらの条件は、従来の2D単層培養14では、細胞が生理学的に無関係な方法で硬い培養プラスチック上で成長する14の不十分な再現である。癌細胞はまた、他の非縮脈細胞、ECMの主要な供給源、増殖、および腫瘍微小環境内の浸潤シグナル伝達と通信する。2D培養とは異なり、3D in vitroモデルは、この腫瘍間質相互作用を研究するためのより適切なプラットフォームを提供することができます17。
HCC分野では3Dモデルが広く用いられており、微細組織の形成方法が異なります18,19,20,21,22,23。これらのモデルのほとんどは、スフェロイド形成の過程で超低結合プレート18、19、20、21、22またはトランスウェル23のいずれかを使用しました。記載されたプロトコルは、代替として吊り下げ液滴技術を導入し、プラスチックフリーで、かつ、インビトロ3D腫瘍スフェロイドモデルで費用対効果が高い。これは、3D形式での腫瘍細胞の増殖に対する線維芽細胞のパラクリンおよびオートクリンの役割の評価を容易にし得る。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59429C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>Biorender.com</td>
			<td>Online</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II laminar flow BioMAT2 hood</td>
			<td>Medair Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>M-D1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel sofware</td>
			<td>Microsoft office 365</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism sofware</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat deactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>life tech</td>
			<td>105000064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (100 unit/ml penicillin and 100 &#956;g/ml streptomycin)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 90 mm, triple vented</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon&#8482; Broad Spectrum Disinfectant, 5kg Bucket</td>
			<td>Rely+On&#8482;</td>
			<td>SCI-129999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziess inverted microscope</td>
			<td>Ziess</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional spheroid model to investigate the tumor-stromal interaction in hepatocellular carcinoma

肝臓癌の主な形態である進行性肝細胞癌(HCC)に対する攻撃性と十分に許容され、広く有効な治療法の欠如は、癌関連死の2番目に一般的な原因としてのランクを合理化する。前臨床モデルは、臨床開発のための最良の治療候補を選択し、個別化された医療の提供を支援するために、人間の状態を再現するために適応する必要があります。3次元(3D)細胞回転楕円体モデルは、2次元(2D)単層培養に代わる新たな インビトロ の代替として約束を示す。ここでは、吊り下げ液滴に維持される場合に個々の細胞が凝集する能力を利用する3D腫瘍スフェロイドモデルについて述べ、標準的な単層よりも インビボ 環境を代表するものである。さらに、3Dスフェロイドは、均質または異質性細胞を組み合わせることによって生成することができ、 生体内の細胞異質性をより反射し、進行および治療応答に影響を与える可能性のある環境相互作用の研究を可能にする可能性がある。現在の研究では、標準的な10 cm3 ペトリ皿の蓋に細胞懸濁液を固定化することによって、細胞密度を最適化して3Dホモタイピックおよび異質腫瘍スフェロイドを形成しました。縦方向解析を行い、均質対異形腫瘍/線維芽細胞スフェロイドの成長曲線を生成した。最後に、線維芽細胞(COS7細胞)および肝臓筋線維芽細胞(LX2)がホモタイプ腫瘍(Hep3B)スフェロイドに及ぼす増殖性の影響について検討した。3,000個の細胞(20μL培地)の播種密度は、Huh7/COS7ヘテロジピックスフェロイドの生成に成功し、培養8日目まで着実にサイズが増加し、続いて成長遅滞が生じた。この知見は、LX2(ヒト肝星細胞株)コンディション培地(CM)で培養したHep3Bホモタイプスフェロイドを用いて裏付けられた。LX2 CMは、対照腫瘍スフェロイドと比較してHep3Bスフェロイドの増殖を引き起こした。結論として、このプロトコルは、3D腫瘍スフェロイドが、腫瘍間質相互作用をより包括的に研究するための単純で経済的でプレスクリーン インビトロ ツールとして使用できることを示している。

多層3D形式で培養した細胞は、従来の2D培養物24,25よりも腫瘍微小環境の複雑さをより正確に反映する。以前は、多くの研究は、異なるマイトゲンと成長因子26とスフェロイド培養培地を補充して、スフェロイド形成を開始した。しかし、本研究では、線維芽細胞、またはそれらのCMの添加は、スフェロイド成長を促進するために必須のマイトゲンおよび成長因子を提供する。
図1は、20μLの新鮮な培地で、12,000個から125個までの細胞を3日間、12,000個から125個まで下降して播種した、ヒトHCC細胞を試験研究のデータで示しています。12,000個の細胞の播種密度は、非対称形状のスフェロイドを生み出し、細胞の播種密度を半減させた後も修正されなかった。しかし、3000個の細胞から作成された回転楕円体は、より丸みを帯びているように見えた(図1、上段)。細胞濃度のさらなる低下は、単球(125、250、500細胞密度球)の形成にも、球状の外観(1000および1500細胞密度スフェロイド)も正常に形成することには成功しなかった。500個の腫瘍細胞の密度で多くの小球が形成されたことを言及する価値があります。ただし、50 倍の倍率でキャプチャされた小さな回転楕円体は 1 つだけです (図 1、上行)。同じ最適化されたプロトコルを、COS7霊長類腎線維芽細胞株に適用した(図1、中央行)。吊り下げ 125, 250, 500 COS7 線維芽細胞を 20 μL 吊り下げ液滴で、複数の小さなスフェロイドを持つ1つの丸みを帯びたスフェロイドをもたらし、一方、より高い細胞密度(1000、1500、および3000)は単一の半円球状のスフェロイドを形成した。Huh7腫瘍スフェロイドと同様に、より高い細胞懸濁液(6,000および12,000細胞/球)が不規則な細胞凝集体の形成をもたらし、したがってより高い細胞濃度が廃棄された(図1、中央列)。Huh7/COS7ヘテロティピック細胞懸濁液(125、250、および500細胞/球)の低密度は、複数の浮動または半結合したスフェロイドを有する単一の回転楕円体を生成した(図1、下列)。1000細胞および1500細胞ヘテロピックスフェロイドは半円形であり、3000細胞(1細胞種あたり1500個)の播種密度は丸い3Dスフェロイドを与えた。前述のように、より高い細胞密度は、明確に定義されたスフェロイドではなく凝集体の形成をもたらした(図1、下段)。結論として、3000個の細胞密度スフェロイドは、ヒトHCC腫瘍と同様に丸め、さらなる実験に適応した。細胞懸濁液を3日間吊り下げ液として培養すれば、スフェロイド形成を促進するのに十分であった。
現在の文脈においてスフェロイド形成のための最良の細胞濃度およびタイムポイントを最適化した後、腫瘍と線維芽細胞株の共培養の増殖影響を縦断的に評価した。 図2 と 図3 は、3日目から10日目まで監視されるHuh7/COS7ヘテロピックスフェロイド(スフェロイド当たり3000個の総細胞数)を示しています。ホモティピックHuh7およびCOS7スフェロイド(それぞれ1500細胞)がコントロールとして機能した。4日目から、異質球状回転楕円体は、ホモタイピックスフェロイドに比べて理想的な円形形状に成長しました(図2)。ヘテロジピックスフェロイドの初期体積は、各ホモジピックスフェロイドのそれよりも大きかった。スフェロイドの成長は、回転楕円体体積の正常な変動を避けるために、スフェロイド形成の日における初期体積に対する体積の変化として計算した(3日目、 図3)。ヘテロチピックスフェロイドは、当初、4日目から7日目まで急速な成長段階を示し、8日目に成長の遅い段階を示した(図2、上段、図 3)。スフェロイド体積は9日目と10日目に減少し、栄養素の枯渇や低酸素コアおよび細胞死を反映している可能性がある。
対照的に、ホモタイピックHuh7とCOS7回転楕円体は、はるかに遅い速度で成長しました(図2、中央および下の行。 図3)。ホモタイピックスフェロイドは、培養5日目(スフェロイド形成の2日後)まで比較的静的な成長曲線を示した。6日目から、ホモタイプスフェロイドは、異量体スフェロイドのそれよりも著しく低い速度ではあるが、その成長曲線の緩やかな増加を示し始めた(図3)。結論として、腫瘍/線維芽細胞異形性スフェロイドは、腫瘍細胞と線維芽細胞の直接接触が腫瘍スフェロイドのサイズを増加することを示唆するホモタイプスフェロイドよりも高い速度で成長する。
最後に、上記の知見を検証し、肝臓関連の文脈におけるHCCスフェロイドの増殖に対する間葉細胞のパラクリンの影響を研究するために、3日間のホモタイプHep3B HCCスフェロイドをLX2肝ステル酸細胞から定期的な新鮮な培地またはCMで増殖させた(図4 および 図5)。一見すると、3日後に3000個のHep3B細胞が完全に丸みを帯びたスフェロイドを形成した(図4)。Hep3Bスフェロイドは、3日目から7日目まで、新鮮な培地において絶え間ない増殖を示した(図4、上段)。LX2 CMでHep3Bスフェロイドを維持した場合の増殖速度が向上した(図4、下列)。この培地依存性の回転楕円体成長は、4日目から実験終了時までの統計的有意性を示し(図5)、腫瘍スフェロイドの線維芽細胞駆動増殖を示唆した。
結論として、この研究は、HCC腫瘍細胞と異なる線維芽細胞細胞株とのクロストークを利用し、この直接的および間接的な細胞相互作用の増殖意義を調査するために、既存の3Dスフェロイド培養を修正することに成功した(図6)。形成されたスフェロイドのさらなる特徴付けは、腫瘍細胞が周囲の微小環境と相互作用する方法を改善するために必要である。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig01.jpg"> 図1:スフェロイド形成に最適な細胞密度の最適化 列は異なる細胞シード密度を表し、行は Huh7 細胞(上行)、COS7 細胞(中央行)、および Huh7/COS7 異数細胞(下段)から形成されたスフェロイドを表します。画像は、125、250、500、1000、1500、3000、6000、および12000細胞(左から右)を3日間20μLで中断した後に形成されたスフェロイドを表しています。パイロットスタディには、条件ごとに2つのスフェロイドが含まれており、画像は50倍の倍率、スケールバー= 200 μmで撮影されました <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig01large.jpg" target="_blank">。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig02.jpg"> 図2:ヘテロチピック対ホモタイプスフェロイド成長。 列はスフェロイド画像が撮影された日を表し、行は、Huh7細胞(上段)、COS7細胞(中央行)、およびHuh7/COS7細胞(下段)から形成されたスフェロイドの代表的な画像を示しています。画像は、左から右に異なる時間ポイントの各条件(ホモチピックHuh7、COS7、またはHuh7 7異数回転楕円体)から3000個の細胞を中断した後に形成されたスフェロイドを表しています。実験には条件ごとに10個のスフェロイドが含まれており、画像は50倍の倍率で撮影され、スケールバー= 200μmです <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig02large.jpg" target="_blank">。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig03.jpg"> 図3:異質性スフェロイド成長とホモタイプ性スフェロイド成長の縦方向解析グラフは、ヘテロティピックHuh7/COS7スフェロイド対ホモタイプヒュー7およびCOS7スフェロイドの成長曲線を示しています。データは平均±s.e.mとして表示されます。n = 10個の独立したスフェロイド。** p < 0.01;p < 0.001.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig04.jpg"> 図4:LX2 CMにおけるホモチピックHep3Bスフェロイドの成長 列は、スフェロイド画像が撮影された日を表し、行は新鮮なDMEM培養メディア(上段)またはLX2 CM(下段)で培養されたHep3Bスフェロイドの代表的な画像を示しています。実験には条件ごとに7個のスフェロイド(フレッシュメディアまたはLX2 CM)が含まれており、画像は50倍の倍率で撮影され、スケールバー= 200μmです <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig04large.jpg" target="_blank">。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig05.jpg"> 図5:ホモタイプHep3Bスフェロイド成長の縦方向解析。 グラフは、新鮮なDMEM培養メディアまたはLX2 CMにおけるHep3Bスフェロイドの成長曲線.m ±を示しています。n = 7独立したスフェロイド。p < 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig06.jpg"> 図6:スフェロイド形成過程の概略図。 細胞懸濁液は10 cm3 ペトリ皿の内側のふたにピペットで入れられます。蓋は反転し、ホモタイピックまたは異質なスフェロイド形成を可能にするために3日間保たれる。スフェロイド画像は50倍の倍率で撮影されます。図は、Web ベースの科学イラストツールを使用して作成されます( 表を参照)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

関連するヒト疾患を忠実に再現する包括的な インビトロ モデルが欠けている。現在の研究は、ヒト肝細胞癌における腫瘍間質相互作用を研究するための信頼性の高い インビトロ ツールである3次元(3D)腫瘍スフェロイドの作成および培養を提示する。

肝細胞癌における腫瘍間質相互作用を調べる三次元スフェロイドモデル

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

3D腫瘍スフェロイドは、インビトロがん研究のゴールドスタンダードとして従来の2D単層技術に取って代わりました。これらのモデルは、腫瘍微小環境の不均一性を反映し、空間相互作用の活用を可能にする複数の細胞タイプの共培養を可能にする。3Dスフェロイドを生成するために吊り下げ液滴法を使用することの利点は、細胞とプラスチックの相互作用の欠如と腫瘍細胞と非腫瘍細胞との相互作用を研究する容易さである。この技術はまた、腫瘍間質相互作用をモデル化する再現性と費用対効果の高い方法を提供します。3D腫瘍性腫瘍は、貴重な前臨床モデルであり、しばしば薬物スクリーニングツールとして使用されます。この方法は、腫瘍増殖および周囲の微小環境に対する複数の化合物の薬理学的効果を研究するために適用することができる。スフェロイド形成のプロセスはユーザーフレンドリーであり、従来の細胞培養ラボ装置を必要とします。回転楕円体は、任意のベンチトップ反転光顕微鏡を使用して画像化することができ、広く利用可能なオンライン画像解析ソフトウェアを使用して、スフェロイドのサイズと形状の解析を行うことができます。まず、フー7とHep3B HCC腫瘍細胞株とCOS-7およびLX2線維芽細胞株を液体窒素中の貯蔵ラックから取り出し、急速に解凍します。解凍後、解凍した細胞を2ミリリットルの新鮮な培養培地で希釈します。細胞を遠心分離します。上清を捨て、新鮮な温かい培養培地の1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。次に、T75細胞培養フラスコに細胞を播種し、細胞が60〜70&合流するまで細胞培養インキュベーターにインキュベートします。細胞採取のために、培養培地を吸引し、PBSで細胞を3回洗浄する。その後、フラスコの底から付着細胞を取り外し、2ミリリットルの予め温めたトリプシンを加え、摂氏37度でインキュベートします。4分後、完全な培養培地を4ミリリットル添加してトリプシンを不活性化し、細胞懸濁液を回収し、その後、細胞を遠心分離し、上清を捨ててから、新鮮な培養培地の1ミリリットルで細胞を再懸濁する。最後に、新鮮な培養培地を3ミリリットル追加します。細胞を数えるために、細胞懸濁液を穏やかに渦液する。その後、10マイクロリットルのピペットを使用し、10マイクロリットルのトリパンブルーとセルサスペンションを混合し、混合物を上下に4回穏やかにピペットして、外細胞表面の完全な染色を確実にします。次に、ヘモサイトメーター計の計数面積の上にカバースリップを置きます。次に、セル混合物を含むピペットチップをカバースリップの端の隣に置き、チップ含有量をカウントスライドに静かに排出します。スラリーが沈着するまで数分待った後、顕微鏡ステージでヘモサイトメーターを固定し、下または左の判決を重ね合わしたものを避けながら、上または右の支配を重ね合わされた細胞を数えます。最後に、この数式を使用してセルの合計数を計算します。培養液を吸引した後、LX2細胞をPBSで3回洗浄する。先に示したようにトリプシンを使用して細胞を取り外し、遠心分離します。先に示したように細胞を数えた後、10立方センチメートルの皿の6番目のLX2細胞に10回種を入れ、摂氏37度でインキュベートする。48時間後、繊維芽細胞調整培地及び遠心分離機を集めて、任意の浮遊細胞をペレットにする。フィルターは、20ミリリットルシリンジに取り付けられた0.22ミクロンフィルターを使用して、コンディショナー培地を殺菌します。その後、マイナス80°Cで貯蔵するための2ミリリットルのチューブにメディアをアリクォート。10立方センチメートル皿の底に10ミリリットルの無菌PBSを加えて、スフェロイドに湿度の高い条件を提供します。次いで、1,500 HuH7 HCC細胞を吊り下げ、1,500個のCOS-7哺乳動物線維芽細胞を吊り下げ液滴で細胞球を形成する。皿のふたを反転させて、細胞懸濁液を含むメディアが湿気の多い環境にかかわるのを可能にする。3日後、回転楕円体の画像を撮るために、逆顕微鏡のステージに皿を置き、倍率を5倍に調整します。次に、取り付けたコンピュータで顕微鏡ソフトウエアを開き、焦点を合わせて、すべての回転楕円体の鮮明な画像を持つ。次に、画像を取得し、取得した画像を保存するために顕微鏡ソフトウェア上のスナップツールを使用しています。10立方センチメートル皿の底に10ミリリットルの無菌PBSを加えます。その後、吊り下げ液滴に3,000 Hep3B HCC細胞を懸濁させて球体を形成し、皿の蓋を反転させ、液滴が湿度の高い環境に3日間ぶら下がるようにします。次に、ヘプ3Bスフェロイドを、吊り下げ液滴のLX2細胞から20マイクロリットルの新鮮な状態培地に移す。次に、回転楕円体が形成された皿の蓋を反転し、光顕微鏡のステージに蓋を固定します。顕微鏡の細かい焦点を調整して、前に示したように各回転楕円体を見えるようにします。プランジャーボタンを押してマイクロピペットから空気を慎重に空にした後、移すスフェロイドを含む液滴にピペットチップを挿入します。先端で触れることなく、スフェロイドに非常に近づく。次に、プランジャーボタンの圧力を静かに放出し、2マイクロリットルの媒体でスフェロイドをマイクロピペット先端に吸引できるようにします。その後、新しい10立方センチメートルの皿にぶら下がっている新しい液滴に回転楕円体を転送します。LX2コンディショネな培地で転写された顕微鏡を用いて5倍の倍率でスフェロイドの画像を撮影します。成長する回転楕円体の画像を解析するには、画像解析ソフトウェアで各回転楕円体画像を開き、フリーハンド選択ツールを使用して各回転楕円体の輪郭を描きます。次に、解析ドロップダウンボタンから、設定測定を選択し、続いて面積を選択して[OK]を押します。次に、各回転楕円の周囲に手動で円を描き、球が丸にくらんだら、Control M を押して、プログラムがピクセル単位で回転楕円体領域を計算できるようにします。次に、この式を使用して、回転楕円体の面積を体積に変換します。最後に、イメージキャプチャの初日の体積に対する回転数の変化を計算します。スフェロイド形成のための細胞密度の最適化中に、12,000および6の高い播種密度は、000細胞が非対称形状のスフェロイドを生み出し、3,000細胞の播種密度は完全に丸められた3D回転楕円体を与えた。したがって、3,000個の細胞密度スフェロイドがさらなる実験に適応した。共培養腫瘍と線維芽細胞株からの増殖性影響の縦断評価は、4日目以降、異質球形がホモタイプスフェロイドと比較して理想的な丸状の形で成長したことを示した。ヘテロチピックスフェロイドは当初、4日目から7日目まで急速な成長段階を示し、その後8日目には遅い段階が続いた。その後、スフェロイド量は9日目と10日目に減少し、栄養素の枯渇や低酸素コアおよび細胞死を反映している可能性がある。対照的に、ホモタイピックスフェロイドは5日目まで比較的静的な成長曲線を示し、その後6日目以降の成長曲線の徐々な増加を示した。ヘテロチピックスフェロイドの高い成長速度は、腫瘍と線維芽細胞の間の直接接触が腫瘍スフェロイドのサイズを増加することを示唆している。3日齢のホモタイプHep3Bスフェロイドが新鮮な培地で成長した場合、細胞は3日後に完全に丸みを帯びたスフェロイドを形成し、7日目まで増殖を続けることを示した。LX2コンディショネド培地でスフェロイドを維持した場合の増殖速度が増強され、腫瘍スフェロイドの線維芽細胞駆動増殖を示唆した。スフェロイド形成に適した湿度の高い状態を維持するために、皿の底に滅菌BBSを確実に加える必要があります。また、蓋を逆にして、回転楕円体や液滴が乱れないように注意してください。3D腫瘍スフェロイドは、免疫化学や免疫蛍光などの将来の用途のために固定または凍結保存することができ、また、トランスクリプトミック分析のためのRNA抽出も可能です。細胞に予め標識されたヘテロチピックスフェロイドを画像化し、追跡して、腫瘍微小環境内の細胞間相互作用に関する洞察を提供することができる。

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