Name: a three-dimensional spheroid model to investigate the tumor-stromal interaction in hepatocellular carcinoma
Uploaded: 2021-09-30T13:30:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma at JoVE.com

MYWZ er finansiert av utenriksministeren for forretnings-, energi- og industristrategi og Newtonprisen 2020 som en del av Storbritannias ODA- og Newton-fond. SS støttes av Cancer Research UK Advanced Clinician Scientist fellowship C53575/A29959. SS, FO og HR mottar finansiering som en del av HUNTER, finansiert gjennom et partnerskap mellom Cancer Research UK, Fondazione AIRC og Fundacion Cientifica de la Asociacion Espanola Contra el Cancer.

1. Celleforberedelse
<ol><li>Utfør alle forsøkene under sterile forhold i klasse II laminær strømningsmikrobiologisk sikkerhetsskap (se materialfortegnelse).<ol>
<li>Slå på hetten og la det stabilisere luftstrømmen.</li>
		<li>Spray den innvendige hetteoverflaten grundig med 70% etanol for å eliminere eventuell forurensning fra tidligere brukere.</li>
		<li>Forbered 5% av en desinfiserende løsning i et 500 ml glassbeger. Kast celle supernatant eller cellerester inne i løsningen.</li>
		<li>Rengjør alle mikropipetter og spissbokser grundig med 70% etanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered ferske cellekulturmedier ved å supplere Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) høye glukosemedier med 10% varme deaktivert foster bovint serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin (100 enhet/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin) og 2 mM L-glutamin. For LX2 lever stellate celle linje, redusere konsentrasjonen av FBS supplement til 2%.</li>
	<li>Varme kulturmedier før eksperimentet startes.</li>
	<li>Ta Huh7 og Hep3B HCC tumorcellelinjer og COS7 og LX2 fibroblastcellelinjer fra lagringsstativet i flytende nitrogen. Raskt tine kryopreserverte celler.</li>
	<li>Fortynn opptinte celler med 2 ml ferske kulturmedier. Sentrifuger celler ved 200 x g i 4 min ved romtemperatur. Kast den supernatante og resuspend cellepellet i 1 ml friske varme kulturmedier.</li>
	<li>Frøceller i T75 cellekulturflaske. Inkuber cellene i en cellekulturinkubator i 5% CO2 ved 37 °C i 95 % fuktige tilstander til cellene når 60 %-70 % samløp.</li>
</ol>2. Cellesamling
<ol><li>Aspirer kulturmedier og vask celler tre ganger med fosfatbuffers saltvann (PBS).</li>
	<li>Tilsett 2 ml forvarmet 1x Trypsin for å løsne tilhengerceller fra bunnen av T75-kolbe. Inkuber ved 37 °C i en inkubator i 4 minutter.</li>
	<li>Deaktiver trypsin ved å legge til 4 ml komplette kulturmedier. Samle cellefjæring og sentrifugeceller ved 200 x g i 4 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og resuspend cellene i 4 ml friske kulturmedier.</li>
</ol>3. Celletelling
<ol><li>Virvel cellefjæringen forsiktig for å sikre homogen fordeling av celler i sentrifugerøret.</li>
	<li>Bruk en 10 μL pipette, bland 10 μL celleoppheng med 10 μL Trypan blå. Rør blandingen forsiktig opp og ned fire ganger for å sikre fullstendig farging av den ytre celleoverflaten med fargestoffet.</li>
	<li>Tell antall celler ved hjelp av et hemocytometer.<ol>
<li>Først plasserer du en deksle over hemocytometertellingsområdet før du laster inn den fargede cellefjæringen.</li>
		<li>Plasser pipettespissen som inneholder cellefjæringen, i V-sporet på hemocytometeret. Trekk forsiktig ut spissinnholdet i telleskuffen.</li>
		<li>La slurry å bosette seg i et par minutter før du fikser det på mikroskopstadiet for celletelling. MERK: For å unngå dobbelttelling teller du bare cellene på de to sidene av den store firkanten.</li>
		<li>Tell i celler som overlapper den øverste eller høyre avgjørelsen, og unngå de som overlapper den nederste eller venstre kjennelsen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beregne totalt antall celler. MERK: Cellenummer per ml = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq01.jpg">
</li>
</ol>4. Innsamling av fibroblastkondisjonerte medier (CM)
<ol><li>Aspirer kulturmedier og vask LX2-cellene tre ganger med PBS.</li>
	<li>Tilsett 2 ml forvarmet 1x Trypsin for å løsne tilhengerceller fra bunnen av T75-kolbe. Inkuber kolben ved 37 °C i en inkubator i 4 minutter.</li>
	<li>Deaktiver trypsin ved å legge til 4 ml komplette kulturmedier. Samle cellefjæring og sentrifugeceller ved 200 x g i 4 minutter ved romtemperatur. Tell cellene i henhold til trinn 3.</li>
	<li>Frø 1 x 106 LX2 celler i 10 cm3 retter for 48 timer ved 37 °C.</li>
	<li>Samle fibroblast CM etter 48 timer. Sentrifuge ved 200 x g i 4 min ved romtemperatur for å pellets noen flytende celler. Sterilfilter CM ved hjelp av et 0,22 μm filter festet på bunnen av 20 ml sprøyter.</li>
	<li>Samle den supernatante CM. Aliquot CM i 2 ml rør og lagre ved -80 °C for videre bruk. MERK: Oppløsningen kan oppbevares i 6 måneder ved -80 °C.</li>
</ol>5. Validering av celletetthet for perfekte sfæroider
<ol><li>Aspirer kulturmedier og vask HCC-cellelinjene tre ganger med PBS.</li>
	<li>Tilsett 2 ml forvarmet 1x Trypsin for å løsne tilhengerceller fra bunnen av T75-kolbe. Inkuber ved 37 °C i en inkubator i 4 minutter.</li>
	<li>Deaktiver trypsin ved å legge til 4 ml komplette kulturmedier. Samle cellefjæring og sentrifugeceller ved 200 x g i 4 minutter ved romtemperatur.</li>
	<li>Tell cellene i henhold til trinn 3.</li>
	<li>Pipette forskjellige tettheter fra tumorcellelinjene (12000, 6000, 3000, 1500, 1000, 750, 500, 250 og 125 celler) i 20 μL medier på den indre overflaten av et 10 cm3 lokk på en Petri-tallerken.</li>
	<li>Tilsett 10 ml steril PBS på bunnen av parabolen for å gi fuktige forhold for prosessen med sfæroiddannelse.</li>
	<li>Snu lokket på 10 cm3-parabolen slik at mediet, inkludert celleopphenget, kan henge over et fuktig miljø. La de hengende dråpene stå i 3 dager.</li>
	<li>Ta bilder av sfæroidene ved 50x forstørrelse ved hjelp av et invertert mikroskop 3 dager etter å ha hengt de originale dråpene.</li>
</ol>6. Heterotypisk svulst / stromale sfæroider
<ol><li>Suspender 1500 Huh7 HCC-celler med 1500 COS7 pattedyrfibroblastceller (1:1-forhold) i hengende dråper for å danne sfærer. Tilsett 10 ml steril PBS på bunnen av parabolen for å gi fuktige forhold for sfæroidene.</li>
	<li>Snu lokket på 10 cm3-parabolen slik at mediet, inkludert celleopphenget, kan henge over et fuktig miljø. La de hengende dråpene stå i 3 dager.</li>
	<li>Ta bilder av sfæroidene ved hjelp av et omvendt mikroskop fra dag 3 til dag 10 av kulturen.<ol>
<li>Sett 10 cm3 parabolen på mikroskopstadiet. Juster forstørrelsen av mikroskopet ved 50x for alle sfæroider.</li>
		<li>Åpne mikroskopprogramvaren på den tilkoblede datamaskinen og juster fokuset for å ha et klart bilde av hver sfæroid. Bruk opptaksverktøyet på mikroskopprogramvaren til å lagre de oppkjøpte bildene.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Homotypiske Hep3B sfæroider i LX2 CM
<ol><li>Suspender 3000 Hep3B HCC-celler i de hengende dråpene for å danne sfærer. Tilsett 10 ml steril PBS på bunnen av parabolen for å gi fuktige forhold for sfæroidene.</li>
	<li>Snu lokket på 10 cm3-parabolen slik at mediet, inkludert celleopphenget, kan henge over et fuktig miljø. La de hengende dråpene stå i 3 dager.</li>
	<li>Overfør Hep3B sfæroider til 20 μL fersk CM fra LX2-celler i hengende dråper. MERK: Bruk sterile autoklavede ufiltrerte 200 μL pipettespisser i prosessen med sfæroidoverføring for å unngå forstyrrelser eller skader på de dannede sfæroidene. Dette er også for å eliminere eventuelle gjenværende celler som forblir uattrist festet til hovedsfæroiden.<ol>
<li>Bruk en autoklavert 20 μL pipette for overføringsprosessen. Juster pipettevolumet til 2 μL. Fest pipettespissen til pipetten.</li>
		<li>Snu lokket på den 10 cm3 parabolen som sfæroidene ble dannet på. Fest lokket på scenen til et lysmikroskop. Juster mikroskopets fine fokus for å gjøre hver sfæroid synlig.</li>
		<li>Tøm luften forsiktig fra mikropipetten ved å trykke på stempelknappen. Sett pipettespissen inn i dråpen, inkludert sfæroiden, som skal overføres. Kom veldig nær sfæroiden uten å berøre den med spissen.</li>
		<li>Slipp trykket forsiktig på stempelknappen for å la sfæroidens sug komme inn i mikropipettespissen i 2 μL-medier.</li>
		<li>Overfør sfæroiden til en ny dråpe som henger på en ny 10 cm3 tallerken, med nye medier / betingede medier / behandling. MERK: Sørg for at alle sfæroidene overføres til den nye 10 cm3-retten ved hjelp av lysmikroskopet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ta bilder av sfæroidene ved 50x forstørrelse ved hjelp av et invertert mikroskop fra overføringsdagen (dag 3) til dag 7 av kulturen i LX2 CM.</li>
</ol>8. Beregning av sfæroidvolum
<ol><li>Tilordne en unik numerisk identifikator for hver sfæroid slik at bilder fra samsvarende sfæroider kan tas daglig.</li>
	<li>Analyser bilder av de voksende sfæroidene ved hjelp av en programvarepakke for bildeanalyse.<ol>
<li>Åpne hvert sfæroidbilde i programvarepakken. Bruk markeringsverktøyet Frihånd og kontur hver sfæroid. Velg Angi måling på rullegardinmenyen Analyse, og velg deretter Område. Trykk OK.</li>
		<li>Tegn en sirkel manuelt rundt hver sfæroid. Når kulen er sirklet inn, trykker du CTRL + M for å la programmet beregne sfæroidområdet i piksler. Konverter arealet av sfæroiden til et volum. MERK: Volumet av sfæroidmm3 =0,09403 × <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq02.jpg">
</li>
		<li>Beregn endringen i sfæroidvolum i forhold til volumet på den første dagen av bildeopptak. MERK: Dette er for å normalisere sfæroidvolumet til startvolumet og forbedre nøyaktigheten gitt den naturlige variasjonen i startstørrelsen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

FO er styremedlem og aksjonær i Fibrofind Limited.

Konteksten der de eksperimentelle cellelinjene vokser, påvirker deres genuttrykksprofil, baneanalyse og funksjonelle kriterier. For eksempel, i brystkreftceller, beholdes koordineringen mellom forskjellige onkogene veier bare hvis kreftceller dyrkes i 3D-konformasjon27. Deregulerte gener i 3D-melanom og brystkreftsfæroider, men ikke i monolayercellene, er mer relevante for den in vivo menneskelige svulsten28,29. For eksempel var β1 integrinnivåer i pattedyr epitelceller og tumor kolleger lavere enn nivåer dyrket i et 2D-format29. Videre har fibroblaster i 3D-strukturer en tendens til å migrere tydelig når det gjelder morfologi og hastighet sammenlignet med de som dyrkes på plast30. I tillegg aktiverer den mekaniske stivheten til vekstsubstratet spesifikke veier som oppmuntrer til ondartet transformasjon av normale epitelceller via deregulering av den ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK)/Rho i epitelceller31. Disse faktorene favoriserer overgangen fra konvensjonell 2D-kultur til 3D-sfæroidmodeller, da 3D-kulturer er mer i tråd med menneskelig sykdom.
Den nåværende studien brukte konvensjonelle laboratorieverktøy og forsyninger for å produsere en 3D tumor sfæroid modell. De dannede sfæroidene reagerte på spredningssignalene som kommer fra fibroblaster, som vist av deres betydelig økte vekst. Denne modellen tilhører kategorien multicellulære tumorsfæroider. Det er tre andre kategorier av 3D tumor sfæroider, inkludert tumorosfærer32, vevsavledede tumorkuler33,34, og organotypiske multicellulære sfæroider35. I multicellulære tumorsfæroider er tumorceller suspendert under lave vedheftsforhold slik at de kan samles for å danne sfærer uten å berøre bunnen av kulturfartøyet36. Flere tilnærminger har blitt brukt for å levere denne forankringsuavhengige teknikken, alt fra roterende systemer, flytende overleggsteknikker og ubestrøket ultra-lav vedlegg U-formede plater37. I HCC bruker de fleste in vitro sfæroidkulturene de ultra-lave festeplatene 24- eller 96-brønnsplater for å danne avrundede sfæroider18,19,20,21,22. Denne teknikken er imidlertid ikke kostnadseffektiv og utelukker ikke utilsiktet celleplastkontakt. Andre systemer bruker trans-brønner23 eller leverskiver12 for å produsere levermikrovev. Bruk av humant vev i translasjonsarbeid er gullstandarden, men ikke alltid tilgjengelig eller tilgjengelig for mange forskningsgrupper. Den nåværende tilnærmingen hadde nytte av hengende dråper teori. Cellefjæring tilsetts slik at tumorsfæroidene dannes i et tilgjengelig væske-luft-grensesnitt for å danne enkle avrundede sfærer38. Fordeler med å bruke denne teknikken er mangelen på celleplastkontakt og hvor enkelt det er å studere autocrine og paracrine crosstalk mellom tumor og fibroblastceller. Denne modellen ble ytterligere validert i en annen studie som dechiffrerte betydningen av den ikke-parenchymale TREM2 i å beskytte leveren mot HCC-utvikling39. Dette arbeidet viste at volumet av både Hep3B og PLC/PRF5 sfæroider var høyere i kontroll LX2 CM versus TREM2-overekspresserende LX2 CM på en Wnt-avhengig måte39.
I den nåværende studien ble fibroblaster blandet med tumorceller før sfæroiddannelse for å undersøke den proliferative effekten av denne samkulturen. Andre har lagt til fibroblaster, endotelceller og immunceller med tumorcellefjæring etter å ha dannet en tumorsfæroid for å studere stromal cellemigrasjon i svulsten40,41. Den nåværende heterotypiske sfæroidmodellen viste et lignende vekstmønster som de tidligere rapporterte modellene og den opprinnelige in vivo-svulsten; sfæroider viser eksponentiell vekst etterfulgt av en forsinket vekstfase, sannsynligvis på grunn av uttømming av næringsstoffer og utvidelse av den nekrotiske kjernen42. I stedet for å legge til vekstfaktorer og mitogener for å hjelpe sfæroiddannelse, brukte denne studien en mer fysiologisk tilnærming ved å ha disse vekstfaktorene fra direkte kontakt med fibroblaster eller deres sekreom i fibroblast CM. Det er viktig å nevne at LX2-celler kan aktiveres ytterligere ved å behandle med TGFβ1 eller PDGF43. LX2 celler har blitt behandlet med 10 ng / ml TGFβ1 i 48 timer før du fjerner mediet for forskjellige eksperimentelle innstillinger. LX2-celler ble vasket tre ganger med PBS (for å utelukke enhver direkte TGFβ1-effekt), og deretter ble friske medier lagt til i ytterligere 24 timer før de samlet CM. CM samlet inn fra TGFβ1-stimulert LX2 induserte Hep3B sfæroidenes vekst med en høyere hastighet enn CM fra kontroll LX2 (data ikke vist). Dette fleksible systemet kan gi seg til samkulturer av forskjellige kreftceller pluss / minus fibroblaster, samt pasientavledede linjer. Det kan også tilby en middels gjennomstrømning screening analyse for legemidler som raskt kan vedtas og settes inn i en translasjonell narkotika oppdagelse rørledning for å informere dosering for in vivo studier.
En begrensning i den nåværende studien er bruken av de udødelige cellelinjene i sfæroiddannelse i stedet for nyisolerte HCC tumorceller og kreftrelaterte fibroblaster. En annen begrensning er å sammenligne den homotypiske Hep3B-sfæroidens vekst mellom CM fra LX2 og i friske medier i stedet for CM fra andre ikke-fibroblastcellelinjer. Sistnevnte begrensning kan løses ved genetisk modifikasjon av et gen av interesse i fibroblaster etterfulgt av å bruke CM fra vill type versus genetisk konstruert fibroblast til homotypiske sfæroider.

Den globale forekomsten og dødeligheten av leverkreft har fortsatt å øke, til tross for fremskritt i behandlinger for leversykdom og de fleste andre typer kreft. I 2018 overgikk leverkreft kolorektal og magekreft for å bli den nest vanligste årsaken til kreftrelatert død globalt1. I 2020 var det mer enn 9.00.000 nye diagnoser, som utgjorde 4,7% av de totale krefttilfellene over hele verden1. Dette er spesielt skuffende, gitt at de betydelige risikofaktorene for utvikling av HCC, den vanligste formen for leverkreft, er godt karakterisert2. Cirrhose er den vanligste risikofaktoren for utvikling av HCC, med 80% av tilfellene som utvikler seg på bakgrunn av etablert skrumplever2. Kroniske leversykdommer, som utvikler seg til skrumplever, og følgelig HCC, inkluderer Hepatitt B-virus (HBV), Hepatitt C-virus (HCV), alkoholrelatert leversykdom (ARLD), alkoholfrie fettleversykdommer (NAFLD) - sistnevnte tilskrives fedme og type 2 diabetes mellitus (T2DM)2,3. Dagens styringsprotokoller for HCC er sceneavhengige og begrenset for de med avansert kreft, som oftest har dårlig utfall4. Det har vært betydelige fremskritt ved bruk av kinasehemmere og, mer nylig, immun-onkologi behandlinger, men realistisk, nytte bare et mindretall av pasienter med avansert leverkreft5. Videre er det bekymring for at HCC-er som oppstår hos pasienter med NAFLD - den raskest voksende underliggende årsaken, som står for mer enn 50% av nylig diagnostiserte HCC-tilfeller i vestlige nasjoner, kan være mer motstandsdyktige mot programmert død 1 (PD1) sjekkpunkthemmerbehandling6.
Det har vært en massiv investering i kliniske studier for pasienter med HCC, inkludert betydelige forbedringer i kliniske studier og deres endepunkter7. Etter et tiår med feil har disse investeringene begynt å endre mulighetene for pasienter. Realiteten er imidlertid at den totale andelen respondere forblir relativt dårlig, med pasienter rekruttert til studier som ofte representerer de som er tatt vare på på klinikkene. Faren er at fremskrittene er kostbare og kommer de få til gode i stedet for de mange. Etter hvert som flere kandidatterapier dukker opp for engangsbruk eller kombinasjon, er det viktig å ha prekliniske modeller som er mer prediktive for in vivo-svar. Dette vil sannsynligvis være modeller som inneholder ytterligere faktorer som bidrar til variasjonen sett i pasientresponser som bedre gjenspeiler menneskelig HCC-heterogenitet og patologisk kompleksitet8. Systemer som gjenskaper de in vivo patofysiologiske forholdene til HCC er nødvendig for å forstå biologien til tumorutvikling, vekst og progresjon. De eksisterende eksperimentelle modellene av kroniske leversykdommer og HCC faller vanligvis inn under tre hovedkategorier: in vivo dyrebaserte modeller (gjennomgått i9), in vitrokulturer10 og ex vivo11,12 modeller. Dyrebaserte tilnærminger brukes mye til å studere kroniske leversykdommer, inkludert HCC; Imidlertid er den genetiske variasjonen, høye driftskostnader og de forskjellige immunsystemene mellom arter blant de viktigste begrensningene for å bruke slike modeller9. Mens noen ex vivo-modeller gir et utmerket verktøy for å fokusere på menneskelig vev sammenlignet med andre in vitro-cellelinjemodeller, hindrer vevstilgjengelighet og det begrensede eksperimentelle tidsforløpet deres utnyttelse i stor skala.
På den annen side er in vitro-cellelinjemodellene fortsatt et godt alternativ for forskere som jobber med begrensede ressurser, med et mindre behov for å ha en konstant tilførsel av friskt menneskelig vev10. Disse modellene gir også et verktøy som kan brukes som en første skjerm for å hjelpe med målvalidering av legemiddelvalg før du går videre til mer komplekse in vivo-modeller. Den nylige modifikasjonen av de tradisjonelle 2D-monolayerkulturene i 3D-kulturer har forbedret effekten av disse in vitro-modellene13,14.
3D in vitro-modeller kan rekapitulere kritiske trekk sett under menneskelige normale og patologiske forhold. Under fysiologiske forhold initieres signaltransduksjon gjennom cellulær krysstale og interaksjon med andre bindevevsmolekyler, nemlig de ekstracellulære matriseproteinene (ECM), som danner et 3D-interaksjonsnettverk15,16. Svulsten utvikler seg i en 3D sfærisk form under ondartet transformasjon, for hvilke oksygen og næringsstoffer er lett rikelig i ikke-tumor / tumor interfase. Samtidig dominerer hypoksiske forhold ved tumorkjernen. Denne heterogeniteten i næringstilgjengelighet resulterer i aktivering av romlig distinkte signalering og metabolske veier som regulerer tumorigenesis. Disse forholdene er dårlig rekapitulert i de konvensjonelle 2D-monolayerkulturene14, der celler vokser på stiv kulturplast på en fysiologisk irrelevant måte. Kreftceller kommuniserer også med andre ikke-parenchymale celler, den primære kilden til ECM, vekst og invasjonssignalering i tumormikromiljøet. I motsetning til 2D-kulturer kan 3D in vitro-modeller gi en mer passende plattform for å studere denne tumor-stromale interaksjonen17.
3D-modeller er mye brukt i HCC-feltet, og de varierer i måten mikrovevet dannes på18,19,20,21,22,23. De fleste av disse modellene brukte enten de ultra-lave bindingsplatene18,19,20,21,22 eller trans-wells23 i prosessen med sfæroiddannelse. Protokollen som er beskrevet introduserer hengende dråpeteknikk som en alternativ, plastfri og kostnadseffektiv in vitro 3D tumor sfæroid modell. Dette kan lette vurderingen av parakrine- og autocrine-rollene til fibroblaster på spredningen av tumorcellene i et 3D-format.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59429C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>Biorender.com</td>
			<td>Online</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II laminar flow BioMAT2 hood</td>
			<td>Medair Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>M-D1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel sofware</td>
			<td>Microsoft office 365</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism sofware</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat deactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>life tech</td>
			<td>105000064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (100 unit/ml penicillin and 100 &#956;g/ml streptomycin)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 90 mm, triple vented</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon&#8482; Broad Spectrum Disinfectant, 5kg Bucket</td>
			<td>Rely+On&#8482;</td>
			<td>SCI-129999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziess inverted microscope</td>
			<td>Ziess</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional spheroid model to investigate the tumor-stromal interaction in hepatocellular carcinoma

Aggressiviteten og mangelen på godt tolererte og allment effektive behandlinger for avansert hepatocellulært karsinom (HCC), den dominerende formen for leverkreft, rasjonaliserer sin rang som den nest vanligste årsaken til kreftrelatert død. Prekliniske modeller må tilpasses for å rekapitulere de menneskelige forholdene for å velge de beste terapeutiske kandidatene for klinisk utvikling og hjelpe til med levering av personlig medisin. Tredimensjonale (3D) cellulære sfæroidmodeller viser løfte som et fremvoksende in vitro-alternativ til todimensjonale (2D) monolayerkulturer. Her beskriver vi en 3D tumor sfæroid modell som utnytter individuelle cellers evne til å aggregere når de opprettholdes i hengende dråper, og er mer representativ for et in vivo-miljø enn standard monolayers. Videre kan 3D-sfæroider produseres ved å kombinere homotypiske eller heterotypiske celler, mer reflekterende av cellulær heterogenitet in vivo, noe som potensielt muliggjør studiet av miljøinteraksjoner som kan påvirke progresjon og behandlingsresponser. Den nåværende forskningen optimaliserte celletettheten for å danne 3D-homotypiske og heterotypiske tumorsfæroider ved å immobilisere cellesuspensjoner på lokkene til standard 10 cm3 Petri-retter. Langsgående analyse ble utført for å generere vekstkurver for homotypisk versus heterotypisk tumor / fibroblaster sfæroider. Til slutt ble den proliferative effekten av fibroblaster (COS7-celler) og lever myofibroblaster (LX2) på homotypisk svulst (Hep3B) sfæroider undersøkt. En såddtetthet på 3000 celler (i 20 μL media) ga vellykket Huh7 / COS7 heterotypiske sfæroider, som viste en jevn økning i størrelse opp til kultur dag 8, etterfulgt av vekstretardasjon. Dette funnet ble bekreftet ved hjelp av Hep3B homotypiske sfæroider dyrket i LX2 (humant lever stellate cellelinje) betinget medium (CM). LX2 CM utløste spredning av Hep3B sfæroider sammenlignet med kontrolltumor sfæroider. Til slutt har denne protokollen vist at 3D tumor sfæroider kan brukes som et enkelt, økonomisk og prescreen in vitro-verktøy for å studere tumor-stromale interaksjoner mer omfattende.

Celler dyrket i et flerlags 3D-format gjenspeiler mer nøyaktig kompleksiteten i tumormikromiljøet enn konvensjonelle 2D-kulturer24,25. Tidligere har mange studier supplert sfæroidenes kulturmedier med forskjellige mitogener og vekstfaktorer26 for å initiere sfæroiddannelse. I denne studien gir imidlertid tilsetning av fibroblaster, eller deres CM, essensielle mitogener og vekstfaktorer for å akselerere sfæroid vekst.
Figur 1 viser data fra en pilotstudie der Huh7 humane HCC-celler ble sådd i en synkende såingstetthet fra 12 000 til 125 celler i 20 μL friske medier i 3 dager. En såddtetthet på 12.000 celler ga sfæroider med asymmetrisk form, som ikke ble korrigert selv etter halvering av cellefrøtettheten. Sfæroider opprettet fra 3000 celler virket imidlertid mer avrundede (figur 1, øvre rad). Ytterligere reduksjon av cellekonsentrasjonen lyktes heller ikke i å danne enkeltsfærer (125, 250, 500 celletetthetssfærer) eller hadde et vanlig sfærisk utseende (1000 og 1500 celletetthetssfæroider). Det er verdt å nevne at mange små sfærer ble dannet med en tetthet på 500 tumorceller; Imidlertid ble bare en liten sfæroid fanget ved 50x forstørrelse (figur 1, øvre rad). Den samme optimaliserte protokollen ble brukt på COS7 primat nyre fibroblast celle linje (figur 1, midtre rad). Suspendering av 125, 250 og 500 COS7 fibroblaster i 20 μL hengende dråper resulterte i en avrundet sfæroid med flere mindre sfæroider, mens høyere celletetthet (1000, 1500 og 3000) dannet enkle halvavrundede sfæroider. I likhet med Huh7 tumor sfæroider, høyere celle suspensjoner (6,000 og 12,000 celler / sfære) resulterte i dannelsen av uregelmessige celle aggregater, og dermed høyere cellekonsentrasjoner ble kassert (Figur 1, midtre rad). Lave tettheter av Huh7/COS7 heterotypiske cellesuspensjoner (125, 250 og 500 celler/sfære) genererte en enkelt sfæroid med flere flytende eller todelte sfæroider (figur 1, nederste rad). 1000- og 1500-cellers heterotypiske sfæroider ble halv avrundet, mens en såddtetthet på 3000 celler (1500 per celletype) ga en avrundet 3D-sfæroid. Som nevnt tidligere resulterte høyere celletetthet i dannelsen av aggregater i stedet for veldefinerte sfæroider (figur 1, nederste rad). Til slutt ble 3000 celletetthetssfæroider avrundet, lik menneskelige HCC-svulster, og ble tilpasset for videre eksperimenter. Kultivering av cellesuspensjonene som hengende dråper i 3 dager var tilstrekkelig til å fremme sfæroiddannelse.
Etter å ha optimert den beste cellekonsentrasjonen og tidspunktet for sfæroiddannelse i den nåværende konteksten, ble den proliferative effekten av kokulturerende svulst og fibroblastcellelinjer vurdert langsgående. Figur 2 og figur 3 viser Huh7/COS7 heterotypiske sfæroider (3000 totale celletall per sfæroid) overvåket fra dag 3 til dag 10. Homotypic Huh7 og COS7 sfæroider (1500 celler hver) fungerte som kontroller. Fra dag 4 vokste heterotypiske sfæroider i en ideell rundlignende form sammenlignet med homotypiske sfæroider (figur 2). Det første volumet av den heterotypiske sfæroiden var større enn for hver homotypisk sfæroid. Veksten av sfæroider ble beregnet som endringen i volumet i forhold til det første volumet på dagen for sfæroiddannelse for å unngå normal variasjon i sfæroidvolum (dag 3, figur 3). Heterotypiske sfæroider viste i utgangspunktet en rask vekstfase fra dag 4 til dag 7 etterfulgt av en langsommere vekstfase på dag 8 (figur 2, øvre rad og figur 3). Sfæroidvolumet gikk ned på dag 9 og 10, noe som muligens gjenspeiler uttømming av næringsstoffer eller en hypoksisk kjerne- og celledød.
I kontrast vokste homotypiske Huh7- og COS7-sfæroider med en mye langsommere hastighet (figur 2, midtre og nederste rader; Figur 3). Homotypiske sfæroider viste en relativt statisk vekstkurve til den femte kulturdagen (to dager etter sfæroiddannelse). Fra dag 6 begynte de homotypiske sfæroidene å vise en gradvis økning i vekstkurven, om enn med en betydelig lavere hastighet enn de heterotypiske sfæroidene (figur 3). Til slutt vokser tumor / fibroblast heterotypiske sfæroider i høyere hastighet enn homotypiske sfæroider som antyder at direkte kontakt av tumorceller og fibroblaster øker størrelsen på tumorsfæroidene.
Til slutt, for å validere de ovennevnte funnene og for å studere den parakriminelle effekten av mesenchymale celler på spredningen av HCC-sfæroider i en leverrelatert kontekst, ble 3-dagers homotypiske Hep3B HCC-sfæroider dyrket i vanlige friske medier eller CM fra LX2 lever stellate celler (figur 4 og figur 5) i ytterligere 4 dager. Ved første øyekast dannet 3000 Hep3B-celler perfekt avrundede sfæroider etter 3 dager (figur 4). Hep3B-sfæroider viste kontinuerlig spredning i friske medier fra dag 3 til dag 7 (figur 4, øvre rad). Vekstraten ble forbedret da Hep3B-sfæroider ble opprettholdt i LX2 CM (figur 4, nedre rad). Denne medieavhengige konverteringen i Hep3B sfæroid vekst viste statistisk signifikans fra dag 4 til slutten av eksperimentet (figur 5), noe som tyder på en fibroblastdrevet spredning av tumorsfæroider.
Til slutt har denne studien vellykket modifisert de eksisterende 3D-sfæroidkulturene for å utnytte krysstale mellom HCC-tumorceller og forskjellige fibroblastcellelinjer og undersøke den proliferative betydningen av denne direkte og indirekte cellulære interaksjonen (figur 6). Videre karakterisering av de dannede sfæroidene er nødvendig for å forbedre hvordan tumorceller samhandler med det omkringliggende mikromiljøet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig01.jpg"> Figur 1: Optimalisering av optimal celletetthet for sfæroiddannelse. Kolonner representerer forskjellige cellefrøtettheter, og rader representerer sfæroider dannet fra Huh7-celler (øverste rad), COS7-celler (midtre rad) og Huh7/COS7 heterotypiske celler (nederste rad). Bilder representerer sfæroider dannet etter å ha suspendert 125, 250, 500, 1000, 1500, 3000, 6000 og 12000 celler (fra venstre til høyre) i 20 μL-medier i 3 dager. Pilotstudien inkluderte to sfæroider per tilstand, og bildene ble tatt ved 50x forstørrelse, skalalinje = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig02.jpg"> Figur 2: Heterotypisk versus homotypisk sfæroidvekst. Kolonner representerer dagen da sfæroidbilder ble tatt, og rader viser representative bilder for sfæroider dannet fra Huh7-celler (øverste rad), COS7-celler (midtre rad) og Huh7 /COS7-celler (nederste rad). Bildene representerer sfæroidene som dannes etter å ha suspendert 3000 celler fra hver tilstand (homotypisk Huh7, COS7 eller Huh7/COS7 heterotypiske sfæroider) av forskjellige tidspunkter fra venstre til høyre. Eksperimentet inkluderte 10 sfæroider per tilstand, og bildene ble tatt ved 50x forstørrelse, skalalinje = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig03.jpg"> Figur 3: Langsgående analyse av heterotypisk versus homotypisk sfæroidvekst. Grafen viser vekstkurven til heterotypiske Huh7/COS7-sfæroider versus homotypiske Huh7- og COS7-sfæroider. Data presenteres som gjennomsnittlige ± s.e.m; n = 10 uavhengige sfæroider. ** p < 0,01; p < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig04.jpg"> Figur 4: Vekst av homotypiske hep3B-sfæroider i LX2 CM. Kolonner representerer dagen da sfæroidbilder ble tatt, og rader viser representative bilder av Hep3B-sfæroider dyrket i ferske DMEM-kulturmedier (øverste rad) eller LX2 CM (nederste rad). Eksperimentet inkluderte syv sfæroider per tilstand (ferske medier eller LX2 CM), og bilder ble tatt ved 50x forstørrelse, skalalinje = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig05.jpg"> Figur 5: Langsgående analyse av den homotypiske Hep3B sfæroidveksten. Grafen viser vekstkurven til Hep3B-sfæroider i ferske DMEM-kulturmedier eller LX2 CM. Data presenteres som gjennomsnittlig ± s.e.m; n = 7 uavhengige sfæroider. p < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig06.jpg"> Figur 6: Skjematisk representasjon av sfæroiddannelsesprosessen. Celleopphenget pipetteres på det indre lokket på 10 cm3 Petri-tallerken. Lokket er invertert og holdt i 3 dager for å tillate homotypisk eller heterotypisk sfæroiddannelse. Sfæroidbilder er tatt med 50x forstørrelse. Figuren er laget ved hjelp av et nettbasert vitenskapsillustrasjonsverktøy (se Materialfortegnelse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma at JoVE.com

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Omfattende in vitro-modeller som trofast rekapitulerer den aktuelle menneskelige sykdommen mangler. Den nåværende studien presenterer tredimensjonal (3D) tumor sfæroid skapelse og kultur, et pålitelig in vitro verktøy for å studere tumor-stromal interaksjon i humant hepatocellulært karsinom.

En tredimensjonal sfæroidmodell for å undersøke tumor-stromal interaksjon i hepatocellulært karsinom

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

3D tumor sfæroider har erstattet den konvensjonelle 2D monolayer teknikken som gull standard for in vitro kreft forskning. Disse modellene tillater samkultur av flere celletyper som gjenspeiler heterogeniteten til tumormikromiljøet og tillater utnyttelse av romlige interaksjoner. Fordelene ved å bruke hengende dråper metode for å generere 3D sfæroider er mangelen på celle-plast interaksjon og den enkle å studere samspillet mellom tumorcellene og ikke-tumorcellene.Denne teknikken gir også en reproduserbar og kostnadseffektiv måte å modellere tumor-stromal interaksjon på. 3D tumoroider er verdifulle prekliniske modeller og brukes ofte som et legemiddelscreeningsverktøy. Denne metoden kan brukes til å studere de farmakologiske effektene av flere forbindelser på tumorvekst og det omkringliggende mikromiljøet.Prosessen med sfæroiddannelse er brukervennlig og krever konvensjonelt laboratorieutstyr for cellekultur. Sfæroider kan avbildes ved hjelp av et hvilket som helst benk topp invertert lysmikroskop, og analysen av sfæroidstørrelse og form kan utføres ved hjelp av allment tilgjengelig online bildeanalyseprogramvare. Til å begynne med, fjern Huh7 og Hep3B HCC tumorcellelinjer og COS-7 og LX2 fibroblastcellelinjer fra lagringsstativet i flytende nitrogen og avriming dem raskt.Etter avriming, fortynn de tinte cellene med to milliliter friskt kulturmedium. Sentrifuger cellene. Kast supernatanten og resuspend cellepellet i en milliliter friskt varmt kulturmedium.Deretter frø cellene i T75 cellekultur kolber og inkubere dem i en cellekultur inkubator til cellene når 60 til 70&confluency. For cellesamling aspirerer du kulturmediene og vasker cellene tre ganger med PBS. Deretter løsner du de tilhørende cellene fra bunnen av kolber, legger til to milliliter forvarmet trypsin og inkuberer ved 37 grader Celsius.Etter fire minutter inaktiverer du trypsin ved å legge til fire milliliter komplett kulturmedium og samle celleopphenget, deretter sentrifuger cellene og kast supernatanten før du bruker cellene på nytt i en milliliter friskt kulturmedium. Til slutt legger du til ytterligere tre milliliter friskt kulturmedium. For å telle cellene, vir forsiktig celleopphenget.Bland deretter 10 mikroliterpipetter, bland 10 mikroliter av cellefjæringen med 10 mikroliter trypanblå og rør blandingen forsiktig opp og ned fire ganger for å sikre fullstendig farging av den ytre celleoverflaten med fargestoffet. Deretter plasserer du en deksle over hemocytometertellingsområdet. Plasser deretter pipettespissen som inneholder celleblandingen ved siden av kanten av dekslene, og trekk forsiktig spissinnholdet ut i telleskuffen.Etter å ha ventet i noen minutter på at slurryen skal avgjøre, fikser du hemocytometeret på mikroskopstadiet og teller cellene som overlapper toppen eller høyre kjennelse, samtidig som du unngår de som overlapper bunnen eller venstre kjennelse. Til slutt beregner du det totale antallet celler ved hjelp av denne formelen. Etter å ha aspirert kulturmediet, vask LX2-cellene tre ganger med PBS.Løsne cellene ved hjelp av trypsin som vist tidligere og sentrifuger dem. Etter å ha talt cellene som vist tidligere, frø en ganger 10 til den sjette LX2 celler i 10 kubikkcentimeter retter og inkubere ved 37 grader Celsius. Etter 48 timer, samle fibroblast-betinget medium og sentrifuge å pellet noen flytende celler.Filtrer steriliser det kondisjonerte mediet ved hjelp av et 0,22 mikron filter festet til en 20 milliliter sprøyte. Deretter aliquot media i to milliliter rør for lagring på minus 80 grader Celsius. Tilsett 10 milliliter steril PBS til bunnen av en 10 kubikkcentimeter tallerken for å gi fuktige forhold for sfæroidene.Deretter suspendere 1500 HuH7 HCC celler med 1500 COS-7 pattedyr fibroblast celler i hengende dråper for å danne sfærer. Snu lokket på parabolen slik at mediet, inkludert cellefjæring, kan henge over et fuktig miljø. Etter tre dager, for å ta bilder av sfæroidene, legg parabolen på scenen til et invertert mikroskop og juster forstørrelsen til fem ganger.Deretter åpner du mikroskopprogramvaren på den tilkoblede datamaskinen og justerer fokuset for å ha et klart bilde av hver sfæroid. Bruk deretter snap-verktøyet på mikroskopprogramvaren for å skaffe bildene og lagre de oppkjøpte bildene. Tilsett 10 milliliter steril PBS til bunnen av en 10 kubikkcentimeter tallerken.Deretter suspendere 3000 Hep3B HCC celler i hengende dråper for å danne sfærer og invertere lokket på parabolen slik at dråpene kan henge over et fuktig miljø i tre dager. Deretter overfører du Hep3B-sfæroidene til 20 mikroliter ferske tilstandsmedier fra LX2-celler i hengende dråper. Snu deretter lokket på parabolen som sfæroidene dannes på og fest lokket på scenen til et lysmikroskop.Juster mikroskopets fine fokus for å gjøre hver sfæroid synlig som vist tidligere. Når du har trykket på stempelknappen for å tømme luften forsiktig fra mikropipetten, setter du pipettespissen inn i dråpen som inneholder sfæroiden som skal overføres. Kom veldig nær sfæroiden uten å berøre den med spissen.Slipp deretter trykket forsiktig på stempelknappen for å tillate sfæroidens sug i mikropipettespissen i to mikroliter medier. Overfør deretter sfæroiden til en ny dråpe som henger på en ny 10 kubikkcentimeter tallerken. Ta bilder av sfæroidene ved fem ganger forstørrelse ved hjelp av et invertert mikroskop fra overføringsdagen til dag syv av kulturen i LX2-betingede medier.For å analysere bildene av de voksende sfæroidene, åpne hvert sfæroidbilde i en bildeanalyseprogramvare og bruk frihåndsvalgverktøyet til å skissere hver sfæroid. Velg deretter angi måling fra rullegardinmenyen analyse, etterfulgt av område, og trykk OK. Deretter tegner du en sirkel manuelt rundt hver sfæroid, og når sfæren er sirklet, trykker du på Kontroll M for å la programmet beregne sfæroidområdet i piksler. Konverter deretter arealet av sfæroiden til et volum ved hjelp av denne formelen.Til slutt beregner du endringen i sfæroidvolum i forhold til volumet på den første dagen av bildeopptak. Under optimalisering av celletettheten for sfæroiddannelse ga høyere såddtetthet på 12 000 og 6000 celler sfæroider med asymmetrisk form, mens en såddtetthet på 3000 celler ga en perfekt avrundet 3D-sfæroid. Dermed ble 3000 celletetthetssfæroider tilpasset for videre eksperimenter.Langsgående vurdering av den proliferative effekten fra kokulturerende tumor- og fibroblastcellelinjer viste at fra dag fire og utover vokste heterotypiske sfæroider i en ideell rundlignende form sammenlignet med homotypiske sfæroider. Heterotypiske sfæroider viste i utgangspunktet en rask vekstfase fra dag fire til dag syv, etterfulgt av en langsommere fase på dag åtte. Sfæroidvolumet gikk deretter ned på dag ni og 10, noe som muligens gjenspeiler uttømming av næringsstoffer eller en hypoksisk kjerne- og celledød.I kontrast viste de homotypiske sfæroidene en relativt statisk vekstkurve til dag fem, etterfulgt av en gradvis økning i vekstkurvene fra dag seks og utover. Den høyere vekstraten for heterotypiske sfæroider antyder at den direkte kontakten mellom svulst og fibroblaster øker størrelsen på tumorsfæroidene. Da tre dager gamle homotypiske Hep3B-sfæroider ble dyrket i friske medier, dannet cellene perfekt avrundede sfæroider etter tre dager og viste fortsatt spredning til dag syv.Vekstraten ble forbedret da sfæroider ble opprettholdt i LX2-betingede medier, noe som tyder på en fibroblastdrevet spredning av tumorsfæroider. Det er viktig å sørge for at den sterile BBS legges til bunnen av oppvasken for å opprettholde egnet fuktig tilstand for sfæroiddannelse. Vær også forsiktig når du inverterer lokket slik at sfæroidene og dråpene ikke forstyrres.3D tumor sfæroider kan festes eller fryses og lagres for fremtidige applikasjoner som immunkjemi eller immunfluorescence, samt RNA-ekstraksjon for transkripsjonsanalyse. Heterotypiske sfæroider med forhåndsmerkede celler kan avbildes og spores for å gi innsikt i cellecelleinteraksjoner i tumormikromiljøet.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Studier av virale vektorer i et tredimensjonalt Liver Modell repopulated med Human leverkreft cellelinje HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Flytte oppover: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensjonale invasjonen analysen protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapi Testing i en Spheroid-basert 3D celle kultur modell for hodet og nakken Squamous celle Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Tredimensjonale bein ekstracellulær Matrix modell for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Fullt Human tumor-baserte Matrix i tredimensjonale spheroid Invasion analysen

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Transradial Access Chemoembolization for Hepatocellular Carcinoma Patients

Transradial tilgang kjemoembolisering for hepatocellulære karsinom pasienter

Transarterial chemoembolization (TACE) is the most common modality for treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) at the intermediate stage. TACE is ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/61109.jpg

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering av celledød ved hjelp av cellefri supernatant av probiotika i tredimensjonale sfæroidkulturer av kolorektale kreftceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

En tredimensjonal modell av sfæroider for å studere kolonkreft stamceller

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

En musemodell for å undersøke rollen som kreftassosierte fibroblaster i tumorvekst

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Tredimensjonal in vitro biomimetisk modell av neuroblastom ved bruk av kollagenbaserte stillas

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...