Name: a three-dimensional spheroid model to investigate the tumor-stromal interaction in hepatocellular carcinoma
Uploaded: 2021-09-30T13:30:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma at JoVE.com

MYWZ finansieras av The Secretary of State for Business, Energy and Industrial Strategy och Newton Prize 2020 som en del av Storbritanniens officiella utvecklingsbistånd "ODA" och Newton-fonden. SS stöds av Cancer Research UK Advanced Clinician Scientist fellowship C53575/A29959. SS, FO och HR erhåller finansiering som en del av HUNTER, finansierat genom ett partnerskap mellan Cancer Research UK, Fondazione AIRC och Fundacion Cientifica de la Asociacion Espanola Contra el Cancer.

1. Cellberedning
<ol><li>Utför alla experiment under sterila förhållanden i klass II laminärt flöde mikrobiologiskt säkerhetsskåp (se Tabell över material).<ol>
<li>Slå på huven och låt luftflödet stabiliseras.</li>
		<li>Spraya noggrant den inre huvens yta med 70% etanol för att eliminera eventuell förorening från tidigare användare.</li>
		<li>Förbered 5% av en desinfektionslösning i en 500 ml glasbägare. Kassera eventuella cell supernatant eller cellrester inuti lösningen.</li>
		<li>Rengör alla mikropipetter och spetslådor noggrant med 70% etanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered färska cellodlingsmedier genom att komplettera Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) högglukosmedium med 10% värmedeaktiverat fetalt bovinserum (FBS), 1% penicillin/streptomycin (100 enheter/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin) och 2 mM L-glutamin. För LX2 lever stellat cellinjen, minska koncentrationen av FBS tillägg till 2%.</li>
	<li>Varma kulturmedier innan experimentet påbörjas.</li>
	<li>Ta Huh7 och Hep3B HCC tumör cellinjer och COS7 och LX2 fibroblast cellinjer från deras förvaringsställ i flytande kväve. Snabbt tina kryopreserverade celler.</li>
	<li>Späd upptinade celler med 2 ml färska odlingsmedier. Centrifugceller vid 200 x g i 4 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten i 1 ml friskt varmkulturmedium.</li>
	<li>Fröceller i T75 cellodlingskolv. Inkubera cellerna i en cellodlingsinkubator i 5% CO2 vid 37 °C i 95% fuktade förhållanden tills cellerna når 60-70% sammanflöde.</li>
</ol>2. Cellsamling
<ol><li>Aspirera odlingsmedia och tvätta celler tre gånger med fosfatbuffertsaltlösning (PBS).</li>
	<li>Tillsätt 2 ml förvärmd 1x Trypsin för att lossa vidhäftande celler från botten av T75-kolvarna. Inkubera vid 37 °C i en inkubator i 4 min.</li>
	<li>Inaktivera trypsin genom att lägga till 4 ml kompletta kulturmedier. Samla cellfjädringen och centrifugcellerna vid 200 x g i 4 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och återanvänd cellerna i 4 ml färska kulturmedier.</li>
</ol>3. Cellräkning
<ol><li>Virvla försiktigt cellfjädringen för att säkerställa homogen fördelning av celler i centrifugröret.</li>
	<li>Blanda 10 μL cellfjädring med 10 μL Trypan blå med hjälp av en 10 μL pipett. Rör försiktigt blandningen upp och ner fyra gånger för att säkerställa fullständig färgning av den yttre cellytan med färgämnet.</li>
	<li>Räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer.<ol>
<li>Placera först ett täckblad över hemocytometerräkningsområdet innan du laddar den färgade cellupphängningen.</li>
		<li>Placera pipettens spets som innehåller cellupphängningen i hemocytometerns V-spår. Tryck försiktigt ut spetsinnehållet i räknebilden.</li>
		<li>Låt slammet nöja sig i ett par minuter innan du fixerar det på mikroskopstadiet för cellräkning. OBS: För att undvika dubbelräkning, räkna bara cellerna på de två sidorna av den stora fyrkanten.</li>
		<li>Räkna i celler som överlappar det övre eller högra avgörandet och undvik att de överlappar det nedre eller vänstra avgörandet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beräkna det totala antalet celler. OBS: Cellnummer per ml = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq01.jpg">
</li>
</ol>4. Insamling av fibroblastkonditionerade medier (CM)
<ol><li>Aspirera kulturmedia och tvätta LX2-cellerna tre gånger med PBS.</li>
	<li>Tillsätt 2 ml förvärmd 1x Trypsin för att lossa vidhäftande celler från botten av T75-kolvarna. Inkubera kolven vid 37 °C i en inkubator i 4 min.</li>
	<li>Inaktivera trypsin genom att lägga till 4 ml kompletta kulturmedier. Samla cellfjädringen och centrifugcellerna vid 200 x g i 4 min vid rumstemperatur. Räkna cellerna enligt steg 3.</li>
	<li>Frö 1 x 106 LX2 celler i 10 cm3 rätter för 48 h vid 37 °C.</li>
	<li>Samla fibroblast CM efter 48 h. Centrifugera vid 200 x g i 4 min vid rumstemperatur för att pelletera flytande celler. Sterilt filtrera CM med ett 0,22 μm-filter fastsatt på botten av 20 ml sprutor.</li>
	<li>Samla supernatanten CM. Aliquot CM i 2 ml rör och förvara vid -80 °C för ytterligare tillämpningar. OBS: Lösningen kan förvaras i 6 månader vid -80 °C.</li>
</ol>5. Validera celltätheter för perfekta sfäroider
<ol><li>Aspirera kulturmedia och tvätta HCC-cellinjerna tre gånger med PBS.</li>
	<li>Tillsätt 2 ml förvärmd 1x Trypsin för att lossa vidhäftande celler från botten av T75-kolvarna. Inkubera vid 37 °C i en inkubator i 4 min.</li>
	<li>Inaktivera trypsin genom att lägga till 4 ml kompletta kulturmedier. Samla cellfjädringen och centrifugcellerna vid 200 x g i 4 min vid rumstemperatur.</li>
	<li>Räkna cellerna enligt steg 3.</li>
	<li>Pipetter olika densiteter från tumör cellinjerna (12000, 6000, 3000, 1500, 1000, 750, 500, 250 och 125 celler) i 20 μL media på insidan av en 10 cm3 lock av en Petri maträtt.</li>
	<li>Tillsätt 10 ml steril PBS till botten av skålen för att ge fuktiga förhållanden för sfäroidbildningsprocessen.</li>
	<li>Vänd locket på 10 cm3 skålen så att mediet, inklusive cellupphängningen, kan hänga över en fuktig miljö. Lämna de hängande dropparna i 3 dagar.</li>
	<li>Ta bilder av sfäroiderna vid 50x förstoring med ett inverterat mikroskop 3 dagar efter att ha hängt de ursprungliga dropparna.</li>
</ol>6. Heterotypisk tumör/stromal sfäroider
<ol><li>Suspendera 1500 Huh7 HCC-celler med 1500 COS7 däggdjursfibblabla celler (1:1-förhållande) i hängande droppar för att bilda sfärer. Tillsätt 10 ml steril PBS i botten av skålen för att ge fuktiga förhållanden för sfäroiderna.</li>
	<li>Vänd locket på 10 cm3 skålen så att mediet, inklusive cellupphängningen, kan hänga över en fuktig miljö. Lämna de hängande dropparna i 3 dagar.</li>
	<li>Ta bilder av sfäroiderna med ett inverterat mikroskop från dag 3 till dag 10 av kulturen.<ol>
<li>Sätt 10 cm3 skålen på mikroskopstadiet. Justera mikroskopets förstoring vid 50x för alla sfäroider.</li>
		<li>Öppna mikroskopprogramvaran på den anslutna datorn och justera dess fokus för att få en tydlig bild av varje sfäroid. Använd capture tool på mikroskopprogramvaran för att spara de förvärvade bilderna.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Homotypiska Hep3B-sfäroider i LX2 CM
<ol><li>Suspendera 3000 Hep3B HCC-celler i de hängande dropparna för att bilda sfärer. Tillsätt 10 ml steril PBS i botten av skålen för att ge fuktiga förhållanden för sfäroiderna.</li>
	<li>Vänd locket på 10 cm3 skålen så att mediet, inklusive cellupphängningen, kan hänga över en fuktig miljö. Lämna de hängande dropparna i 3 dagar.</li>
	<li>Överför Hep3B-sfäroider till 20 μL färsk CM från LX2-celler i hängande droppar. OBS: Använd sterila autoklaverade ofiltrerade 200 μL pipettspetsar i samband med sfäroidöverföring för att undvika störningar eller skador på de bildade sfäroiderna. Detta är också för att eliminera eventuella restceller som förblir obundna till den huvudsakliga enskilda sfäroiden.<ol>
<li>Använd en autoklaverad pipett på 20 μL för överföringsprocessen. Justera pipettens volym till 2 μL. Fäst pipettspetsen på pipetten.</li>
		<li>Invertera locket på den 10 cm3 skål på vilken sfäroiderna bildades. Fäst locket på scenen i ett ljusmikroskop. Justera mikroskopets fina fokus för att göra varje sfäroid synlig.</li>
		<li>Töm försiktigt luften från mikropipetten genom att trycka på kolven. Sätt i pipettspetsen i droppen, inklusive sfäroiden, som ska överföras. Kom mycket nära sfäroiden utan att röra den med spetsen.</li>
		<li>Släpp försiktigt trycket på kolvens knapp så att sfäroiden sugs in i mikropipettspetsen i 2 μL-media.</li>
		<li>Överför sfäroiden till en ny droppe som hänger på en ny 10 cm3 maträtt, med nya medier / konditionerade medier / behandling. OBS: Se till att alla sfäroider framgångsrikt överförs till den nya 10 cm3 skålen med hjälp av ljusmikroskopet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ta bilder av sfäroiderna vid 50x förstoring med ett inverterat mikroskop från överföringsdagen (dag 3) till dag 7 av kultur i LX2 CM.</li>
</ol>8. Beräkning av sfäroidvolym
<ol><li>Tilldela en unik numerisk identifierare för varje sfäroid så att bilder från matchade sfäroider kan tas dagligen.</li>
	<li>Analysera bilder av de växande sfäroiderna med hjälp av ett programpaket för bildanalys.<ol>
<li>Öppna varje sfäroid avbildning i programvarupaketet. Använd freehand-markeringsverktyget och skissera varje sfäroid. Välj Ange mätning och sedan Område i listrutan Analys. Tryck på OK.</li>
		<li>Rita en cirkel manuellt runt varje sfäroid. När sfären är inringad trycker du på Ctrl + M så att programmet kan beräkna sfäroidområdet i Pixlar. Konvertera sfäroidområdet till en volym. OBS: Volym av sfäroidmm3 =0,09403 × <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq02.jpg">
</li>
		<li>Beräkna förändringen i sfäroid volym i förhållande till volymen den första dagen av bildtagningen. OBS: Detta är för att normalisera sfäroidvolymen till startvolymen och förbättra noggrannheten med tanke på den naturliga variationen i startstorleken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

FO är styrelseledamot och aktieägare i Fibrofind limited.

Det sammanhang i vilket de experimentella cellinjerna växer påverkar deras genuttrycksprofil, väganalys och funktionella kriterier. Till exempel, i bröstcancerceller, bibehållas samordningen mellan olika onkogena vägar endast om cancerceller odlas i 3D-konformation27. Avreglerade gener i 3D-melanom och bröstcancersfäroider, men inte i monolayercellerna, är mer relevanta för in vivo-tumören28,29. Till exempel var β1 integrin nivåer i bröst epitelial celler och tumör motsvarigheter lägre än nivåer som odlas i ett 2D-format29. Dessutom tenderar fibroblaster i 3D-strukturer att migrera tydligt när det gäller morfologi och hastighet jämfört med de som odlas på plast30. Dessutom aktiverar den mekaniska styvheten hos tillväxtsubstratet specifika vägar som uppmuntrar den maligna omvandlingen av normala epitelceller via avreglering av det extracellulära signalreglerade kinaset (ERK)/Rho i epitelceller31. Dessa faktorer gynnar övergången från konventionell 2D-kultur till 3D-sfäroidmodeller, eftersom 3D-kulturer är mer i linje med mänsklig sjukdom.
Den aktuella studien använde konventionella laboratorieverktyg och förnödenheter för att producera en 3D-tumörsfäroidmodell. De bildade sfäroiderna svarade på spridningssignalerna som kom från fibroblaster, vilket framgår av deras signifikant ökade tillväxt. Denna modell tillhör kategorin multicellulära tumör sfäroider. det finns tre andra kategorier av 3D tumör sfäroider, inklusive tumorospheres32, vävnad-härledda tumör sfärer33,34 och organotypiska multicellulära sfäroider35. I multicellulära tumör sfäroider suspenderas tumörceller i låg vidhäftningsförhållanden så att de kan aggregeras tillsammans för att bilda sfärer utan att röra botten av odlingskärlet36. Flera metoder har använts för att leverera denna förankringsoberoende teknik, allt från roterande system, vätskeöverläggstekniker och obestrukna ultralåga fastsättning U-formade plattor37. I HCC använder de flesta in vitro-sfäroidkulturer de ultralåga 24- eller 96-brunnsplattorna för att bilda rundade sfäroider18,19,20,21,22. Denna teknik är dock inte kostnadseffektiv och utesluter inte oavsiktlig kontakt med cell-plast. Andra system använder transbrunnar23 eller leverskivor12 för att producera levermikrovävnader. Att använda mänskliga vävnader i translationellt arbete är guldstandarden men inte alltid tillgänglig eller tillgänglig för många forskargrupper. Det nuvarande tillvägagångssättet gynnades av den hängande droppteorin. Cell suspension läggs till så att tumör sfäroiderna bildas i ett tillgängligt vätskeluftgränssnitt för att bilda enkel rundade sfärer38. Fördelarna med att använda denna teknik är bristen på någon cell-plast kontakt och lättheten att studera autokrina och parakrina korstalk mellan tumör och fibroblast celler. Denna modell validerades ytterligare i en annan studie dechiffrera vikten av icke-parenchymal TREM2 för att skydda levern från HCC utveckling39. Detta arbete visade att volymen av både Hep3B och PLC/PRF5 sfäroider var högre i kontroll LX2 CM jämfört med TREM2-överuttryck LX2 CM på ett Wnt-beroende sätt39.
I den aktuella studien blandades fibroblaster med tumörceller före sfäroidbildning för att undersöka den proliferativa effekten av denna samkultur. Andra har lagt till fibroblaster, endotelceller och immunceller med tumörcellsupphängning efter att ha bildat en tumörsfäroid för att studera stromal cellmigration till tumören40,41. Den nuvarande heterotypiska sfäroid modellen visade ett liknande tillväxtmönster som de tidigare rapporterade modellerna och den ursprungliga in vivo tumör. sfäroider visar exponentiell tillväxt följt av en fördröjd tillväxtfas, troligen på grund av utarmning av näringsämnen och utvidgningen av den necrotic core42. Istället för att lägga till tillväxtfaktorer och mitogener för att hjälpa sfäroidbildning, använde denna studie ett mer fysiologiskt tillvägagångssätt genom att ha dessa tillväxtfaktorer från direkt kontakt med fibroblaster eller deras sekret i fibroblast CM. Det är viktigt att nämna att LX2-celler kan aktiveras ytterligare genom behandling med TGFβ1 eller PDGF43. LX2 celler har behandlats med 10 ng/mL TGFβ1 för 48 h innan du tar bort media för olika experimentella inställningar. LX2 celler tvättades tre gånger med PBS (för att utesluta någon direkt TGFβ1 effekt), och sedan färska medier lades till i ytterligare 24 h innan du samlar CM. Cm som samlats in från TGFβ1-stimulerad LX2 inducerade Hep3B-sfäroidernas tillväxt i en högre takt än CM från kontroll LX2 (data visas inte). Detta flexibla system kan låna sig till samkulturer av olika cancerceller plus / minus fibroblaster, liksom patientbaserade linjer. Det kan också erbjuda en medium-throughput screening analys för läkemedel som snabbt kan antas och infogas i en translationell drogupptäckt pipeline för att informera dosering för in vivo studier.
En begränsning av den aktuella studien är användningen av de odödliga cellinjerna i sfäroidbildning snarare än nyisolerade HCC-tumörceller och cancerassocierade fibroblaster. En annan begränsning är att jämföra homotypiska Hep3B sfäroid tillväxt mellan CM från LX2 och i färska medier snarare än CM från andra icke-fibroblast cellinjer. Den senare begränsningen kan åtgärdas genom genetisk modifiering av en gen av intresse för fibroblaster följt av tillämpning av CM från vild typ kontra genetiskt konstruerad fibroblast på homotypiska sfäroider.

Den globala incidensen och dödligheten i levercancer har fortsatt att öka, trots framsteg i behandlingarna av leversjukdom och de flesta andra typer av cancer. Under 2018 överträffade levercancer kolorektal- och magcancer för att bli den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död globalt1. År 2020 fanns det mer än 9 00 000 nya diagnoser, vilket motsvarar 4,7% av de totala cancerfallen över hela världen1. Detta är särskilt nedslående, med tanke på att de betydande riskfaktorerna för utvecklingen av HCC, den vanligaste formen av levercancer, är väl karakteriserade2. Cirros är den vanligaste riskfaktorn för utvecklingen av HCC, med 80% av fallen som utvecklas mot bakgrund av etablerad cirros2. Kroniska leversjukdomar, som utvecklas till cirros, och följaktligen HCC, inkluderar hepatit B-virus (HBV), hepatit C-virus (HCV), alkoholrelaterad leversjukdom (ARLD), alkoholfria fettleversjukdomar (NAFLD) - den senare tillskrivs fetma och typ 2-diabetes mellitus (T2DM)2,3. De nuvarande hanteringsprotokollen för HCC är stegberoende och begränsade för dem med avancerad cancer, som oftast har ett dåligt resultat4. Det har gjorts betydande framsteg med kinashämmare och, mer nyligen, immun-onkologi behandlingar, även om realistiskt, gynnar endast en minoritet av patienter med avancerad levercancer5. Dessutom finns det en oro för att HCCs som uppstår hos patienter med NAFLD - den snabbast växande underliggande orsaken, som står för mer än 50% av nydiagnostiserade HCC-fall i västländer, kan vara mer resistenta mot programmerad död 1 (PD1) checkpoint inhibitor terapi6.
Det har gjorts en massiv investering i kliniska prövningar för patienter med HCC, inklusive betydande förbättringar i kliniska prövningar och deras endpoints7. Efter ett decennium av misslyckanden har dessa investeringar börjat förändra möjligheterna för patienter. Verkligheten är dock att den totala andelen svarande fortfarande är relativt dålig, med patienter som rekryteras till prövningar som ofta dåligt representerar dem som vårdas på klinikerna. Faran är att förskotten blir kostsamma och gynnar de få snarare än de många. Eftersom fler kandidatterapier dyker upp för engångsanvändning eller kombination är det viktigt att ha prekliniska modeller som är mer prediktiva för in vivo-svar. Dessa är sannolikt modeller som innehåller ytterligare faktorer som bidrar till den variabilitet som ses i patientens svar som bättre återspeglar mänskliga HCC heterogenitet och patologisk komplexitet8. System som återskapar de in vivo patofysiologiska förhållandena i HCC behövs för att förstå biologin för tumör evolution, tillväxt och progression. De befintliga experimentella modellerna av kroniska leversjukdomar och HCC faller vanligtvis under tre huvudkategorier: in vivo djurbaserade modeller (granskade i9), in vitro-kulturer10 och ex vivo11,12-modeller. Djurbaserade metoder används i stor utsträckning för att studera kroniska leversjukdomar, inklusive HCC; Den genetiska variabiliteten, de höga driftskostnaderna och de olika immunsystemen mellan arter är dock några av de viktigaste begränsningarna för tillämpningen av sådana modeller9. Medan vissa ex vivo-modeller ger ett utmärkt verktyg för att fokusera på mänskliga vävnader jämfört med andra in vitro-celllinjemodeller, hindrar vävnadstillgänglighet och den begränsade experimentella tidskursen deras användning i stor skala.
Å andra sidan är in vitro-celllinjemodellerna fortfarande ett bra alternativ för forskare som arbetar med begränsade resurser, med ett mindre behov av att ha en konstant tillgång på färska mänskliga vävnader10. Dessa modeller ger också ett verktyg som kan användas som en första skärm för att hjälpa till med målval av läkemedelsval innan de fortsätter till mer komplexa in vivo-modeller. Den senaste ändringen av de traditionella 2D-monolayerkulturerna i 3D-kulturer har förbättrat effekten av dessa in vitro-modeller13,14.
3D in vitro modeller kan rekapitulera kritiska funktioner sett i mänskliga normala och patologiska villkor. Under fysiologiska förhållanden initieras signaltransduktion genom cellulär korsstjälk och interaktion med andra bindvävsmolekyler, nämligen de extracellulära matrisproteinerna (ECM), som bildar ett 3D-interaktionsnätverk15,16. Tumör utvecklas i en 3D sfärisk form under maligna omvandling, för vilka syre och näringsämnen är lätt rikliga i icke-tumör/tumör interfas. Samtidigt dominerar hypoxiska tillstånd vid tumörkärnan. Denna heterogenitet i näringsämne tillgänglighet resulterar i aktivering av rumsligt distinkt signalering och metaboliska vägar som reglerar tumorigenesis. Dessa villkor är dåligt rekapitulerade i de konventionella 2D monolayerkulturerna14, där celler växer på styv kulturplast på ett fysiologiskt irrelevant sätt. Cancerceller kommunicerar också med andra icke-parenkymala celler, den primära källan till ECM, tillväxt och invasion signalering inom tumör microenvironment. Till skillnad från 2D-kulturer kan 3D in vitro-modeller ge en mer lämplig plattform för att studera denna tumör-stromal interaktion17.
3D-modeller används ofta inom HCC-fältet, och de varierar i hur mikrovävnaden bildas18,19,20,21,22,23. De flesta av dessa modeller använde antingen de ultralåga bindningsplattorna18,19,20,21,22 eller transbrunnarna23 i processen för sfäroidbildning. Protokollet beskrivs introducerar hängande dropp teknik som en alternativ, plastfri och kostnadseffektiv in vitro 3D tumör sfäroid modell. Detta kan underlätta bedömning av parakrina och autokrin roller fibroblaster på spridningen av tumör cellerna i ett 3D-format.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59429C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>Biorender.com</td>
			<td>Online</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II laminar flow BioMAT2 hood</td>
			<td>Medair Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>M-D1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel sofware</td>
			<td>Microsoft office 365</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism sofware</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat deactivated fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>life tech</td>
			<td>105000064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (100 unit/ml penicillin and 100 &#956;g/ml streptomycin)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 90 mm, triple vented</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>633175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon&#8482; Broad Spectrum Disinfectant, 5kg Bucket</td>
			<td>Rely+On&#8482;</td>
			<td>SCI-129999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziess inverted microscope</td>
			<td>Ziess</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional spheroid model to investigate the tumor-stromal interaction in hepatocellular carcinoma

Aggressivitet och brist på väl tolererade och allmänt effektiva behandlingar för avancerade hepatocellulära carcinom (HCC), den dominerande formen av levercancer, rationaliserar sin rang som den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död. Prekliniska modeller måste anpassas för att rekapitulera de mänskliga förhållandena för att välja de bästa terapeutiska kandidaterna för klinisk utveckling och hjälpa till att leverera personlig medicin. Tredimensionella (3D) cellulära sfäroidmodeller visar löfte som ett framväxande in vitro-alternativ till tvådimensionella (2D) monolayerkulturer. Här beskriver vi en 3D tumör sfäroid modell som utnyttjar enskilda cellers förmåga att aggregera när den underhålls i hängande droppar, och är mer representativ för en in vivo miljö än vanliga monolayers. Dessutom kan 3D-sfäroider produceras genom att kombinera homotypiska eller heterotypiska celler, mer reflekterande av den cellulära heterogeniteten in vivo, vilket potentiellt möjliggör studier av miljöinteraktioner som kan påverka progression och behandlingssvar. Den aktuella forskningen optimerade celltätheten för att bilda 3D homotypiska och heterotypiska tumörsfäroider genom att immobilisera cellupphängningar på locken på standard 10 cm3 Petri-rätter. Longitudinell analys utfördes för att generera tillväxt kurvor för homotypiska kontra heterotypiska tumör/fibroblasts sfäroider. Slutligen undersöktes proliferative effekten av fibroblaster (COS7 celler) och lever myofibroblasts (LX2) på homotypiska tumör (Hep3B) sfäroider. En såddtäthet på 3 000 celler (i 20 μL-media) gav framgångsrikt Huh7/COS7 heterotypiska sfäroider, som visade en stadig ökning av storleken upp till kulturdag 8, följt av tillväxtstörning. Detta konstaterande bekräftades med Hjälp av Hep3B homotypiska sfäroider odlade i LX2 (mänskliga lever stellate cellinjen) betingade medium (CM). LX2 CM utlöste spridningen av Hep3B sfäroider jämfört med kontroll tumör sfäroider. Sammanfattningsvis har detta protokoll visat att 3D tumör sfäroider kan användas som ett enkelt, ekonomiskt och prescreen in vitro verktyg för att studera tumör-stromal interaktioner mer omfattande.

Celler odlade i ett flerskiktat 3D-format återspeglar mer exakt komplexiteten i tumörmikromiljön än konventionella 2D-kulturer24,25. Tidigare har många studier kompletterat sfäroidernas kulturmedier med olika mitogener och tillväxtfaktorer26 för att initiera sfäroidbildning. I denna studie ger dock tillsats av fibroblaster, eller deras CM, viktiga mitogener och tillväxtfaktorer för att påskynda sfäroidtillväxt.
Figur 1 visar data från en pilotstudie där Huh7 mänskliga HCC-celler såddes i en fallande sådddensitet från 12 000 till 125 celler i 20 μL färska medier i 3 dagar. En såddtäthet på 12 000 celler gav sfäroider med asymmetrisk form, vilket inte korrigerades även efter halveringen av cellsåddtätheten. Sfäroider som skapats från 3000 celler verkade dock mer rundade (bild 1, övre raden). Ytterligare minskning av cellkoncentrationen lyckades varken bilda enstaka sfärer (125, 250, 500 celldensitetssfärer) eller hade ett regelbundet sfäriskt utseende (1000 och 1500 celldensitetssfäroider). Det är värt att nämna att många små sfärer bildades med en densitet av 500 tumörceller; Dock fångades endast en liten sfäroid vid 50x förstoring (bild 1, övre raden). Samma optimerade protokoll tillämpades på COS7 primat njurs fibroblast cellinje (figur 1, mellersta raden). Suspendering 125, 250 och 500 COS7 fibroblaster i 20 μL hängande droppar resulterade i en rundad sfäroid med flera mindre sfäroider, medan högre celltätheter (1000, 1500 och 3000) bildade enstaka halvrundade sfäroider. I likhet med Huh7 tumör sfäroider resulterade högre cell suspensioner (6 000 och 12 000 celler/sfär) i bildandet av oregelbundna cellaggregat, och därför högre cellkoncentrationer kasserades (figur 1, mitten rad). Låg densitet av Huh7/COS7 heterotypiska cell suspensioner (125, 250 och 500 celler/sfär) genererade en enda sfäroid med flera flytande eller halvanslutna sfäroider (figur 1, nedre raden). 1000- och 1500-cells heterotypiska sfäroider var halvrundade, medan en såddtäthet på 3000 celler (1500 per celltyp) gav en rundad 3D-sfäroid. Som tidigare nämnts resulterade högre celltätheter i bildandet av aggregat snarare än väldefinierade sfäroider (figur 1, nedre raden). Sammanfattningsvis avrundades 3000 celldensitetssfäroider, liknande mänskliga HCC-tumörer, och anpassades för ytterligare experiment. Odling av cellen suspensioner som hängande droppar i 3 dagar var tillräckligt för att främja sfäroid bildas.
Efter att ha optimerat den bästa cell koncentration och tid punkt för sfäroid bildas i det aktuella sammanhanget, den proliferative effekten av co-odling tumör och fibroblast cellinjer bedömdes longitudinellt. Figurerna 2 och figur 3 visar Huh7/COS7 heterotypiska sfäroider (3000 totala cellnummer per sfäroid) övervakade från dag 3 till dag 10. Homotypiska Huh7 och COS7 sfäroider (1500 celler vardera) fungerade som kontroller. Från och med dag 4 växte heterotypiska sfäroider i en idealisk rundliknande form jämfört med homotypiska sfäroider (figur 2). Den ursprungliga volymen av heterotypiska sfäroid var större än för varje homotypisk sfäroid. Tillväxten av sfäroider beräknades som förändringen i volym i förhållande till den ursprungliga volymen på dagen för sfäroidbildning för att undvika normal variation i sfäroid volym (dag 3, figur 3). Heterotypiska sfäroider visade inledningsvis en snabb tillväxtfas från dag 4 fram till dag 7 följt av en långsammare tillväxtfas dag 8 (figur 2, övre raden och figur 3). Sfäroid volymen minskade på dag 9 och 10, möjligen återspeglar utarmning av näringsämnen eller en hypoxic kärna och cell död.
Homotypiska Huh7- och COS7-sfäroider växte däremot i mycket långsammare takt (figur 2, mitten och nedre raden; Figur 3). Homotypiska sfäroider uppvisade en relativt statisk tillväxtkurva fram till den femte kulturdagen (två dagar efter sfäroidbildning). Från och med dag 6 började de homotypiska sfäroiderna visa en gradvis ökning av deras tillväxtkurva, om än i en betydligt lägre takt än för heterotypiska sfäroider (figur 3). Sammanfattningsvis växer tumör/fibroblast heterotypiska sfäroider i en högre takt än homotypiska sfäroider tyder på att direktkontakt med tumörceller och fibroblaster ökar storleken på tumör sfäroider.
Slutligen, för att validera ovanstående resultat och studera parakrinan inverkan av mesenchymal celler på spridningen av HCC sfäroider i ett lever-relaterade sammanhang, 3-dagars homotypiska Hep3B HCC spheroids odlades i regelbundna färska medier eller CM från LX2 lever stellat celler (figur 4 och figur 5) för ytterligare 4 dagar. Vid första anblicken bildade 3000 Hep3B-celler perfekt rundade sfäroider efter 3 dagar (figur 4). Hep3B sfäroider visade kontinuerlig spridning i färska medier från dag 3 till dag 7 (figur 4, övre raden). Tillväxttakten förbättrades när Hep3B-sfäroider bibehölls i LX2 CM (figur 4, nedre raden). Denna media-beroende konvertering i Hep3B sfäroid tillväxt uppvisade statistisk signifikans från dag 4 fram till slutet av experimentet (figur 5), vilket tyder på en fibroblast-driven spridning av tumör sfäroider.
Sammanfattningsvis har denna studie framgångsrikt modifierat de befintliga 3D-sfäroidkulturerna för att utnyttja korstalk mellan HCC tumörceller och olika fibroblast cellinjer och undersöka den proliferativa betydelsen av denna direkta och indirekta cellulära interaktion (figur 6). Ytterligare karakterisering av de bildade sfäroiderna behövs för att förbättra hur tumörceller interagerar med den omgivande mikromiljön.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig01.jpg"> Bild 1: Optimering av den optimala celltätheten för sfäroidbildning. Kolumner representerar olika cellutsädetätheter och rader representerar sfäroider som bildas av Huh7-celler (översta raden), COS7-celler (mellersta raden) och Huh7/COS7 heterotypiska celler (nedre raden). Bilder representerar sfäroider som bildats efter att ha suspenderat 125, 250, 500, 1000, 1500, 3000, 6000 och 12000 celler (från vänster till höger) i 20 μL-media i 3 dagar. Pilotstudien inkluderade två sfäroider per tillstånd, och bilderna togs vid 50x förstoring, skalstång = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig02.jpg"> Figur 2: Heterotypisk kontra homotypisk sfäroid tillväxt. Kolumner representerar dagen då sfäroidbilder togs, och rader visar representativa bilder för sfäroider som bildas av Huh7-celler (översta raden), COS7-celler (mittenrad) och Huh7/COS7-celler (nedre raden). Bilderna representerar de sfäroider som bildas efter att ha suspenderat 3000 celler från varje tillstånd (homotypiska Huh7, COS7 eller Huh7/COS7 heterotypiska sfäroider) av olika tidpunkter från vänster till höger. Experimentet inkluderade 10 sfäroider per tillstånd, och bilderna togs vid 50x förstoring, skalstång = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig03.jpg"> Figur 3: Longitudinell analys av heterotypisk kontra homotypisk sfäroid tillväxt. Diagrammet visar tillväxtkurvan för heterotypiska Huh7/COS7-sfäroider kontra homotypiska Huh7 och COS7-sfäroider. Uppgifterna presenteras som medelvärde ± s.e.m; n = 10 oberoende sfäroider. ** p < 0,01; p < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig04.jpg"> Figur 4: Tillväxt av homotypiska hep3B-sfäroider i LX2 CM. Kolumner representerar dagen då sfäroidbilder togs, och rader visar representativa bilder av Hep3B-sfäroider odlade i färska DMEM-kulturmedier (översta raden) eller LX2 CM (nedre raden). Experimentet omfattade sju sfäroider per tillstånd (färska medier eller LX2 CM), och bilder togs vid 50x förstoring, skalstång = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig05.jpg"> Figur 5: Longitudinell analys av den homotypiska Hep3B sfäroid tillväxt. Diagrammet visar tillväxtkurvan för Hep3B-sfäroider i färska DMEM-kulturmedier eller LX2 CM. Data presenteras som medelvärde ± s.e.m; n = 7 oberoende sfäroider. p < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig06.jpg"> Figur 6: Schematisk representation av sfäroidbildningsprocessen. Cellfjädringen är pipetted på innerlocket på 10 cm3 Petriskål. Locket vänds och hålls i 3 dagar för att möjliggöra homotypisk eller heterotypisk sfäroidbildning. Sfäroidbilder tas vid 50x förstoring. Figuren skapas med hjälp av ett webbaserat vetenskapligt illustrationsverktyg (se Tabell över material). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma at JoVE.com

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Omfattande in vitro-modeller som troget rekapitulerar den relevanta mänskliga sjukdomen saknas. Den aktuella studien presenterar tredimensionella (3D) tumör sfäroid skapande och kultur, ett tillförlitligt in vitro verktyg för att studera tumör-stromal interaktion i mänskliga hepatocellular carcinom.

En tredimensionell sfäroidmodell för att undersöka tumör-stromal interaktion i hepatocellulärt karcinom

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

3D tumör sfäroider har ersatt den konventionella 2D monolayer tekniken som guldstandarden för in vitro cancer forskning. Dessa modeller tillåter samkultur av flera celltyper som återspeglar heterogeniteten i tumörmikromiljön och tillåter utnyttjande av rumsliga interaktioner. Fördelarna med att använda hängande droppar för att generera 3D-sfäroider är bristen på cell-plastinteraktion och hur lätt det är att studera interaktionen mellan tumörcellerna och icke-tumörcellerna.Denna teknik ger också ett reproducerbart och kostnadseffektivt sätt att modellera tumör-stromal interaktion. 3D-tumoroids är värdefulla prekliniska modeller och används ofta som ett verktyg för läkemedelsscreening. Denna metod kan tillämpas för att studera de farmakologiska effekterna av flera föreningar på tumörtillväxt och den omgivande mikromiljön.Processen med sfäroidbildning är användarvänlig och kräver konventionell cellkulturlabbutrustning. Sfäroider kan avbildas med alla bänkskivor inverterat ljusmikroskop, och analysen av sfäroid storlek och form kan utföras med hjälp av allmänt tillgänglig online bildanalys programvara. Till att börja med, ta bort Huh7 och Hep3B HCC tumör cellinjer och COS-7 och LX2 fibroblast cellinjer från deras lagringsställ i flytande kväve och snabbt tina dem.Efter avfrostning späd de tinade cellerna med två milliliter färskt odlingsmedium. Centrifugera cellerna. Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten i en milliliter friskt varmt odlingsmedium.Frö sedan cellerna i T75-cellodlingskolvar och inkubera dem i en cellodlingsinkubator tills cellerna når 60 till 70&confluency. För cellsamling, aspirera odlingsmediet och tvätta cellerna tre gånger med PBS. För att sedan lossa de vidhäftande cellerna från botten av kolvarna, tillsätt två milliliter förvärmd trypsin och inkubera vid 37 grader Celsius.Efter fyra minuter inaktiverar du trypsin genom att tillsätta fyra milliliter komplett odlingsmedium och samla cellupphängningen, centrifugera sedan cellerna och kassera supernatanten innan cellerna återanvänds i en milliliter färskt odlingsmedium. Slutligen tillsätt ytterligare tre milliliter färskt odlingsmedium. För att räkna cellerna, virvla försiktigt cellupphängningen.Blanda sedan 10 mikroliter av cellupphängningen med 10 mikroliter trypanblå och rör försiktigt blandningen upp och ner fyra gånger för att säkerställa fullständig färgning av den yttre cellytan med färgämnet. Placera sedan ett täckslip över hemocytometerräkningsområdet. Placera sedan pipettspetsen som innehåller cellblandningen bredvid kanten på täcket och tryck försiktigt ut spetsinnehållet i räknebilden.Efter att ha väntat i några minuter på att slammet ska sätta sig, fixa hemocytometern på mikroskopstadiet och räkna cellerna som överlappar toppen eller höger avgörandet samtidigt som de som överlappar botten eller vänster avgörandet undviks. Beräkna slutligen det totala antalet celler med den här formeln. Tvätta LX2-cellerna tre gånger med PBS efter att ha aspirerat odlingsmediet.Lossa cellerna med trypsin som visats tidigare och centrifugera dem. Efter att ha räknat cellerna som visats tidigare, frö en gånger 10 till de sjätte LX2-cellerna i 10 kubikcentimeter rätter och inkubera vid 37 grader Celsius. Efter 48 timmar samlar du in det fibroblastkonditionerade mediet och centrifugerar för att pelletera flytande celler.Filtrera sterilisera det konditionerade mediet med hjälp av ett 0,22 mikronfilter fäst vid en 20 ml spruta. Lägg sedan mediet i två milliliterrör för förvaring vid minus 80 grader Celsius. Tillsätt 10 ml steril PBS till botten av en 10 kubikcentimeter skål för att ge fuktiga förhållanden för sfäroiderna.Suspendera sedan 1 500 HuH7 HCC-celler med 1 500 COS-7 däggdjursfibblas celler i hängande droppar för att bilda sfärer. Vänd på locket på skålen så att mediet, inklusive cellfjädring, kan hänga över en fuktig miljö. Efter tre dagar, för att ta bilder av sfäroiderna, sätt skålen på scenen i ett inverterat mikroskop och justera förstoringen till fem gånger.Öppna sedan mikroskopprogramvaran på den anslutna datorn och justera dess fokus för att ha en tydlig bild av varje sfäroid. Använd sedan snapverktyget på mikroskopprogramvaran för att hämta bilderna och spara de förvärvade bilderna. Tillsätt 10 ml steril PBS till botten av en 10 kubikcentimeter skål.Suspendera sedan 3 000 Hep3B HCC-celler i de hängande dropparna för att bilda sfärer och invertera locket på skålen så att dropparna kan hänga över en fuktig miljö i tre dagar. Överför sedan Hep3B-sfäroiderna till 20 mikroliter av färska tillståndsmedier från LX2-celler i hängande droppar. Vänd sedan locket på skålen där sfäroiderna bildas och fixa locket på scenen i ett ljusmikroskop.Justera mikroskopets fina fokus för att göra varje sfäroid synlig som visats tidigare. När du har tryckt på kolven för att försiktigt tömma luften från mikropipetten, sätt in pipettens spets i droppen som innehåller sfäroiden som ska överföras. Kom mycket nära sfäroiden utan att röra den med spetsen.Släpp sedan försiktigt trycket på kolvens knapp så att sfäroiden sugs in i mikropipettspetsen i två mikroliter media. Överför sedan sfäroiden till en ny droppe som hänger på en ny 10 kubikcentimeter skål. Ta bilder av sfäroiderna vid fem gånger förstoring med hjälp av ett inverterat mikroskop från överföringsdagen till dag sju av kultur i LX2-betingade medier.Om du vill analysera bilderna av de växande sfäroiderna öppnar du varje sfäroidbild i en bildanalysprogramvara och använder freehand-markeringsverktyget för att beskriva varje sfäroid. Välj sedan setmätning efter område efter område och tryck på OK från listrutan analys. Rita sedan en cirkel manuellt runt varje sfäroid och när sfären är inringad trycker du på Kontroll M så att programmet kan beräkna sfäroidområdet i pixlar. Konvertera sedan området för sfäroiden till en volym med den här formeln.Slutligen beräknar du ändringen i sfäroid volym i förhållande till volymen på den första dagen av bildinspelningen. Under optimering av celldensiteten för sfäroidbildning gav högre såddtäthet på 12 000 och 6 000 celler sfäroider med asymmetrisk form, medan en såddtäthet på 3 000 celler gav en perfekt rundad 3D-sfäroid. Således anpassades 3 000 celldensitetssfäroider för ytterligare experiment.Longitudinell bedömning av proliferative inverkan från co-culturing tumör och fibroblast cellinjer visade att från dag fyra och framåt, heterotypiska sfäroider växte i en idealisk rund-liknande form jämfört med homotypiska sfäroider. Heterotypiska sfäroider visade inledningsvis en snabb tillväxtfas från dag fyra till dag sju, följt av en långsammare fas dag åtta. Sfäroidvolymen minskade sedan på dag nio och 10, möjligen återspeglar utarmningen av näringsämnen eller en hypoxisk kärna och celldöd.Däremot uppvisade homotypiska sfäroider en relativt statisk tillväxtkurva fram till dag fem, följt av en gradvis ökning av deras tillväxtkurvor från dag sex och framåt. Den högre tillväxttakten för heterotypiska sfäroider tyder på att direktkontakt mellan tumör och fibroblaster ökar storleken på tumör sfäroider. När tre-dag gamla homotypiska Hep3B sfäroider odlades i färska medier, cellerna bildas perfekt rundade sfäroider efter tre dagar och visade fortsatt spridning fram till dag sju.Tillväxttakten förbättrades när sfäroider bibehölls i LX2 betingade medier, vilket tyder på en fibroblast-driven spridning av tumör sfäroider. Det är viktigt att se till att den sterila BBS läggs till botten av disken för att upprätthålla lämpligt fuktigt tillstånd för sfäroidbildning. Var också försiktig när du inverterar locket så att sfäroiderna och dropparna inte störs.3D tumör sfäroider kan fixas eller frysas och lagras för framtida tillämpningar såsom immunokemi eller immunofluorescens, samt RNA-extraktion för transkriptomisk analys. Heterotypiska sfäroider med förmärkta celler kan avbildas och spåras för att ge insikter om cell-cell interaktioner inom tumör mikromiljön.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Studie av virala vektorer i en Tredimensionell Lever modell nyinsatta med Human Hepatocellulär cancer HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Flytta uppåt: Ett enkelt och flexibelt In Vitro tredimensionella Invasion Assay protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapi testning i sfäroid-baserat 3D Cell kultur modell för huvud och hals skivepitelcancer

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Tredimensionella ben extracellulärmatrix modell för osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Helt mänsklig tumör-baserade Matrix i tredimensionell sfäroid invasion assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Transradial Access Chemoembolization for Hepatocellular Carcinoma Patients

Transradial åtkomst chemoembolization för hepatocellulära carcinom patienter

Transarterial chemoembolization (TACE) is the most common modality for treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) at the intermediate stage. TACE is ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/61109.jpg

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Utvärdera celldöd med hjälp av cellfri supernatant av probiotika i tredimensionella sfäroidkulturer av kolorektalcancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

En tredimensionell modell av sfäroider för att studera tjocktarmscancerstamceller

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

En musmodell för att undersöka rollen av cancerassocierade fibroblaster i tumörtillväxt

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Tredimensionell in vitro biomimetisk modell av neuroblastom med hjälp av kollagenbaserade strukturer

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...