Name: optogenetic phase transition of tdp-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae
Uploaded: 2022-02-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant nummers JP19K06933 (KA) en JP20H05345 (KA).

Al het viswerk werd uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van het Institutional Animal Care and Use Committee (goedkeuringsidentificatienummer 24-2) van het National Institute of Genetics (Japan), dat een Animal Welfare Assurance in het bestand heeft (zekerheidsnummer A5561-01) bij het Office of Laboratory Animal Welfare van de National Institutes of Health (NIH, VERENIGDE STATEN).
1. Constructie van BACs voor expressie van het optog...

<ol>
	<li>Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+transitions+and+size+scaling+of+membrane-less+organelles.">Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles.</a> Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).</li><li>Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+in+biology.">Liquid-liquid phase separation in biology.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).</li><li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+rna+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development.">Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).</li><li>Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+biophysics+and+neurology:+aberrant+phase+transitions+in+neurodegenerative+disease.">Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).</li><li>Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+ribostasis:+RNA-protein+granules+in+degenerative+disorders.">Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders.</a> Cell. 154 (4), 727-736 (2013).</li><li>Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+genes+in+the+genomic+era+and+their+implications+for+FTD.">ALS genes in the genomic era and their implications for FTD.</a> Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).</li><li>Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+and+therapeutic+potential+of+liquid-liquid+phase+separation+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).</li><li>Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+disorder+in+proteins+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).</li><li>Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rethinking+ALS:+the+FUS+about+TDP-43.">Rethinking ALS: the FUS about TDP-43.</a> Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).</li><li>Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-phaseted+problems+of+TDP-43+in+selective+neuronal+vulnerability+in+ALS.">Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optodroplets.">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optogenetic+induction+of+stress+granules+is+cytotoxic+and+reveals+the+evolution+of+ALS-FTD+pathology.">Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology.</a> Elife. 8, 39578 (2019).</li><li>Mann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Binding+Antagonizes+Neurotoxic+Phase+Transitions+of+TDP-43.">RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43.</a> Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).</li><li>Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+modulation+of+TDP-43+oligomerization+accelerates+ALS-related+pathologies+in+the+spinal+motor+neurons.">Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).</li><li>Otte, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+TDP-43+nucleation+induces+persistent+insoluble+species+and+progressive+motor+dysfunction+in+vivo.">Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo.</a> Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).</li><li>Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mnx+genes+in+endocrine+and+exocrine+pancreas+formation.">Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation.</a> Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).</li><li>Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Mnx+proteins+specify+one+motoneuron+subtype+and+suppress+acquisition+of+interneuron+characteristics.">Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics.</a> Neural Development. 7, 35 (2012).</li><li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).</li><li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish.">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li><li>Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+the+spinal+cord+motor+column+by+BAC+transgenesis+and+gene+trapping+in+zebrafish.">Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function.">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nature Communications. 5, 4925 (2014).</li><li>Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocadherin-mediated+cell+repulsion+controls+the+central+topography+and+efferent+projections+of+the+abducens+nucleus.">Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus.</a> Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).</li><li>Redchuk, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+regulation+of+endogenous+proteins.">Optogenetic regulation of endogenous proteins.</a> Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).</li></ol>

De mnr2b-BAC-gemedieerde expressie van opTDP-43h en EGFP-TDP-43z in zebravissen biedt een unieke kans voor live beeldvorming van TDP-43 faseovergang in de spinale motorneuronen. De optische transparantie van lichaamsweefsels van zebravislarven zorgt voor de eenvoudige en niet-invasieve optogenetische stimulatie van opTDP-43h. Vergelijkingen tussen enkele spinale motorneuronen in de loop van de tijd toonden aan dat de lichtafhankelijke oligomerisatie van opTDP-43h de cytoplasmatische clustering veroorzaakt, wat d...

Ribonucleoproteïne (RNP) korrels regelen een groot aantal cellulaire activiteiten in de kern en het cytoplasma door membraanloze partities te assembleren via vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS), een fenomeen waarbij een homogene vloeistof zich ontmengt in twee verschillende vloeibare fasen1,2. De ontregelde LLPS van RNA-bindende eiwitten die normaal functioneren als RNP-korrelcomponenten bevorderen abnormale faseovergang, wat leidt tot eiwitaggregatie. Dit proces is betrokken bij neurologische en neurodegeneratieve ziekten3,4,5. De precieze evaluatie van een oorzakelijk verband tussen afwijkende LLPS van RNA-bindende eiwitten en ziektepathogenese is cruciaal om te bepalen of en hoe LLPS kan worden benut als een effectief therapeutisch doelwit. LLPS van RNA-bindende eiwitten is relatief eenvoudig te bestuderen in vitro en in eencellige modellen, maar is moeilijk in meercellige organismen, vooral bij gewervelde dieren. Een kritieke vereiste voor het analyseren van dergelijke LLPS in individuele cellen in een weefselomgeving is om stabiel een sonde uit te drukken voor de beeldvorming en manipulatie van LLPS in een ziektegevoelig celtype van belang.
Amyotrofische laterale sclerose (ALS) is een uiteindelijk fatale neurologische aandoening waarbij motorneuronen van de hersenen en het ruggenmerg selectief en progressief verloren gaan als gevolg van degeneratie. Tot op heden zijn mutaties in meer dan 25 genen geassocieerd met de erfelijke (of familiale) vorm van ALS, die goed is voor 5%-10% van de totale ALS-gevallen, en sommige van deze ALS-veroorzakende genen coderen voor RNA-bindende eiwitten bestaande uit RRP's, zoals hnRNPA1, TDP-43 en FUS6,7. Bovendien wordt de sporadische vorm van ALS, die goed is voor 90%-95% van de totale ALS-gevallen, gekenmerkt door de cytoplasmatische aggregatie van TDP-43 afgezet in degenererende motorneuronen. Een belangrijk kenmerk van deze ALS-geassocieerde RNA-bindende eiwitten zijn hun intrinsiek ongeordende regio's (IDR's) of laagcomplexe domeinen die geordende driedimensionale structuren missen en zwakke eiwit-eiwitinteracties bemiddelen met veel verschillende eiwitten die LLPS7,8 aandrijven. Het feit dat ALS-veroorzakende mutaties vaak voorkomen in de IDR's heeft geleid tot het idee dat afwijkende LLPS en faseovergang van deze ALS-gerelateerde eiwitten ten grondslag kunnen liggen aan als pathogenese9,10.
Onlangs werd de optoDroplet-methode ontwikkeld, een op Cryptochrome 2 gebaseerde optogenetische techniek die de modulatie van eiwit-eiwitinteracties door licht mogelijk maakt, om faseovergang van eiwitten met IDR's te induceren11. Aangezien deze techniek met succes is uitgebreid tot TDP-43, is het begonnen met het blootleggen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathologische faseovergang van TDP-43 en de bijbehorende cytotoxiciteit12,13,14,15. In dit protocol schetsen we een genetische methode om een optogenetische TDP-43 af te leveren aan ALS-kwetsbare celtypen, namelijk spinale motorneuronen in zebravissen met behulp van de BAC voor het mnr2b/mnx2b-gen dat codeert voor een homeodomain-eiwit voor motorneuronspecificatie16,17. De hoge doorschijnendheid van zebravislarven zorgt voor eenvoudige, niet-invasieve lichtstimulatie van de optogenetische TDP-43 die de faseovergang in de spinale motorneuronen veroorzaakt. We presenteren ook een basisworkflow voor de live beeldvorming van de spinale motorneuronen van de zebravis en beeldanalyse met behulp van de vrij beschikbare Fiji / ImageJ-software om de reacties van de optogenetische TDP-43 op de lichtstimulatie te karakteriseren. Deze methoden maken een onderzoek mogelijk naar de TDP-43-faseovergang in een ALS-kwetsbare cellulaire omgeving en moeten helpen om de pathologische gevolgen ervan op cellulair en gedragsmatig niveau te onderzoeken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axioimager Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>MEE</td>
			<td>CN-25C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED panel</td>
			<td>Nanoleaf Limited</td>
			<td>Nanoleaf AURORA smarter kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-2plus</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>AD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond BAC100</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>50181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPlanFL N 20&#215;/1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Plan-Neofluar 5x/0.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>HIOKI</td>
			<td>3664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical sensor</td>
			<td>HIOKI</td>
			<td>9742-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red solution 0.5%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>R050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well dish</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer probe BLUE-Wave</td>
			<td>StellerNet Inc.</td>
			<td>VIS-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2725R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish BAC clone CH211-172N16</td>
			<td>BACPAC Genomics</td>
			<td>CH211-172N16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic phase transition of tdp-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae

Abnormale eiwitaggregatie en selectieve neuronale kwetsbaarheid zijn twee belangrijke kenmerken van neurodegeneratieve ziekten. Causale relaties tussen deze kenmerken kunnen worden onderzocht door de faseovergang van een ziekte-geassocieerd eiwit in een kwetsbaar celtype te beheersen, hoewel deze experimentele benadering tot nu toe beperkt is geweest. Hier beschrijven we een protocol om faseovergang van het RNA /DNA-bindende eiwit TDP-43 in spinale motorneuronen van zebravislarven te induceren voor het modelleren van cytoplasmatische aggregatie van TDP-43 die optreedt in degenererende motorneuronen bij amyotrofische laterale sclerose (ALS). We beschrijven een bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC) -gebaseerde genetische methode om selectief een optogenetische TDP-43-variant af te leveren aan spinale motorneuronen van zebravissen. De hoge doorschijnendheid van zebravislarven zorgt voor de faseovergang van de optogenetische TDP-43 in de spinale motorneuronen door een eenvoudige externe verlichting met behulp van een lichtgevende diode (LED) tegen ongeremde vissen. We presenteren ook een basisworkflow van live beeldvorming van de spinale motorneuronen van de zebravis en beeldanalyse met vrij beschikbare Fiji / ImageJ-software om reacties van de optogenetische TDP-43 op de lichtverlichting te karakteriseren. Dit protocol maakt de karakterisering van TDP-43 faseovergang en geaggregeerde vorming in een ALS-kwetsbare cellulaire omgeving mogelijk, wat een onderzoek naar de cellulaire en gedragsmatige gevolgen ervan zou moeten vergemakkelijken.

Live beeldvorming van optogenetische en niet-optogenetische TDP-43 eiwitten in de mnr2b+ spinale motorneuronen van zebravislarven Om TDP-43 faseovergang in de spinale motorneuronen bij zebravissen te induceren, werd een menselijke TDP-43h die is getagd met mRFP1 en CRY2olig22 op respectievelijk de N- en C-termini geconstrueerd en aangeduid als opTDP-43h14 (figuur 1A). Het opTDP-43h ...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae at JoVE.com

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

We beschrijven een protocol om faseovergang van TAR DNA-bindend eiwit 43 (TDP-43) te induceren door licht in de spinale motorneuronen met zebravissen als model.

Optogenetische faseovergang van TDP-43 in spinale motorneuronen van zebravislarven

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

Dit protocol stelt ons dus in staat om pathologische faseovergangen van TDP-43 te induceren en hun cellulaire gevolgen in de spinale motorneuronen in vivo aan te pakken, wat relevant is om te begrijpen waarom motorneuronen degenereren bij ALS. Door de hoge transparantie van zebravislarven zijn de motorneuronen in het ruggenmerg direct zichtbaar. Zo kan men het dynamische gedrag visualiseren van TDP-43 die faseovergangen ondergaat in enkele spinale motorneuronen.Deze methode biedt een nieuw diermodel van ALS. Wij geloven dat elke methode die de door licht geïnduceerde TDP-43 faseovergang en aggregatie in dit ALS-model kan voorkomen, een potentiële kandidaat kan zijn voor ALS-therapie. Andere ALS-gerelateerde eiwitten met intrinsiek ongeordende regio's kunnen tot expressie worden gebracht om neurotoxiciteit geassocieerd met de abnormale faseovergangen te onderzoeken.De sleutel tot succes in deze aanpak is om de optogenetische TDP-43 in de spinale motorneuronen op niet-toxisch niveau tot expressie te brengen. BAC-transgenese is een tijdrovende stap, maar als je eenmaal een goede transgene vis hebt gemaakt, zijn de volgende stappen relatief eenvoudiger en eenvoudiger. Schakel om te beginnen de lichtgevende diode of het LED-paneel in met behulp van de bijbehorende toepassing die op een tablet of telefoon is geïnstalleerd.Plaats vervolgens de spectrometersonde in een lege put van een 6-well schotel. Pas vervolgens met behulp van de applicatie het LED-licht aan op een golflengte met een piek van 456 nm. Plaats de optische sensor van een optische vermogensmeter in de lege put en pas het vermogen van het LED-licht aan.Plaats vervolgens de schaal met de LED-paneelinstelling in een incubator op 28 C.Voor beeldvorming van de zebravislarven die optogenetische TDP-43 tot expressie brengen, dechorioneer de dubbeltransgene vis en verdoof ze in E3-buffer met 250 g / ml Tricane. Verwarm vervolgens 1% lage smelttemperatuur agarose met 250 g / ml ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat bij 42 C.Leg vervolgens een druppel van de agarose op de glazen basisschaal. De diameter van de koepelvormige agarose-druppel op de glazen schaal moet 8 tot 10 mm zijn.Voeg vervolgens met behulp van een Pasteur-pipet de verdoofde vis toe aan de agarose op de glazen schaal. Minimaliseer de hoeveelheid E3-buffer die samen met de vis aan de agarose wordt toegevoegd. Meng vervolgens door een paar keer te pipetteren.Houd tijdens het stollen van de agarose de vis op zijn kant met behulp van een spuitnaald, zodat het ruggenmerg zich in een geschikte horizontale positie bevindt. Nadat de agarose is gestold, voeg je een paar druppels E3-buffer toe aan de koepelvormige agarose-gemonteerde vis. Met behulp van een confocale microscoop uitgerust met een 20 keer water onderdompeling objectief lens, verwerven seriële confocale z-secties van het ruggenmerg.Neem de cloaca aan de ventrale kant van de vis in de interessante gebieden op als referentie om de spinale segmenten over de tijdspunten te identificeren en te vergelijken. Zodra de beeldvorming is voltooid, gebruikt u een spuitnaald om de agarose voorzichtig te kraken en de vis uit de agarose te verwijderen. Houd de hoeveelheid tijd dat de vis is ingebed in de agarose zo kort mogelijk, hoewel agarose die minder dan 30 minuten wordt ingebed, de levensvatbaarheid van de vis niet beïnvloedt.Voeg 7,5 ml E3-buffer toe aan een put van een 6-well schotel en plaats de afgebeelde dubbeltransgene vis in die put. Plaats vervolgens de schotel op het LED-paneel, houd de schotel en het LED-paneel 5 mm uit elkaar met een afstandhouder en schakel het blauwe LED-lampje in. Bewaar wat dubbeltransgene vis in een aparte 6-well schotel bedekt met aluminiumfolie voor niet-gealumineerde controlevissen.Na de gewenste verlichtingstijd, beeldde het ruggenmerg van de verlichte vis af zoals eerder aangetoond. Cytoplasmatische verplaatsing van de opTDP-43h in enkele spinale motorneuronen werd gevisualiseerd door de z-serie beelden verkregen op 48 te scheiden. en 72 uur na de bevruchting in elk EGFP-TDP-43z- en opTDP-43h-kanaal.Uit maximale intensiteit projectiebeelden van EGFP-TDP-43z, een enkel geïsoleerd spinale neuron identificeerbaar bij beide 48. en 72 uur na de bevruchting werd geselecteerd. Gebieden van belang die de soma's van de motorneuronen bedekten, werden ingesteld door de rand van het EGFP-signaal op 48 te volgen.en 72 uur na de bevruchting. De genormaliseerde fluorescerende intensiteit langs de hoofdas van de soma werd uitgezet. En 48 uur na de bevruchting overlapten de patronen van beide signalen elkaar grotendeels.Daarentegen werd na 72 uur de piek voor het opTDP-43h-signaal gevonden in de regio waar het EGFP-TDP-43z-signaal laag was, wat wijst op de cytoplasmatische verplaatsing van opTDP-43h. Om de opTDP-43h- en EGFP-TDP-43z-signalen voor en na stimulatie van blauw licht te kwantificeren, werden enkele segmenten projectiebeelden voor elk kanaal van dezelfde z-serie beelden geproduceerd op 48. en 72 uur na de bevruchting.Van de vier mnr2b+cellen die werden onderzocht, vertoonde cel 1 met name een verzadigd EGFP-TDP-43z-signaal. Relatieve hoeveelheden opTDP-43h ten opzichte van EGFP-TDP-43z werden berekend door de RFP-waarde te delen door de GFP-waarde. Cellen 2 tot en met 4 vertoonden afnemende opTDP-43h-niveaus na verlichting met blauw licht.Het is belangrijk om de tijd dat de vissen in de agarose zijn ingebed te minimaliseren om ze gezond te houden. Door de intensiteit en duur van LED-verlichting aan te passen, regelen we de TDP-43-faseovergang op een tijdelijk gereguleerde manier, wat kan helpen bij het ontleden van de progressie van pathologische TDP-43-faseovergang in het motorneuron.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord (Video) | JoVE

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato (Video) | JoVE

Optogenetic Activering van zebravis Somatosensorische Neuronen met chef-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica (Video) | JoVE

Extracellulair Het identificeren van Motor Neuronen voor een Muscle Motor Pool in<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

zebravis<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Voorbereiding voor elektrofysiologische registraties van Spinal sensorische en motorische neuronen

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Retrograde neuroanatomische tracering van Phrenic motorische neuronen in muizen

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Bijhouden van Drosophila larvale gedrag in reactie op de stimulatie van de Optogenetic van olfactorische neuronen

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in functionele spinale en craniale motor neuronen met behulp van PiggyBac vectoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolatie en cultuur van Oculomotor, Trochlear en spinale motor neuronen van prenatale ISLMN: GFP transgene muizen

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Glucoseopname meten in Drosophila-modellen van TDP-43-proteïnopathie

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

In vivo Draadloze optogenetische controle van bekwaam motorisch gedrag

Fine motor skills are essential in everyday life and can be compromised in several nervous system disorders. The acquisition and performance of these ...