Name: optogenetic phase transition of tdp-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae
Uploaded: 2022-02-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numbers JP19K06933 (KA) et JP20H05345 (KA).

Tous les travaux sur les poissons ont été effectués conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (numéro d’identification d’approbation 24-2) de l’Institut national de génétique (Japon), qui a une assurance du bien-être animal dans ses dossiers (numéro d’assurance A5561-01) au Bureau du bien-être des animaux de laboratoire des National Institutes of Health (NIH, États-Unis).
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L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish.">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li><li>Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+the+spinal+cord+motor+column+by+BAC+transgenesis+and+gene+trapping+in+zebrafish.">Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function.">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nature Communications. 5, 4925 (2014).</li><li>Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocadherin-mediated+cell+repulsion+controls+the+central+topography+and+efferent+projections+of+the+abducens+nucleus.">Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus.</a> Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).</li><li>Redchuk, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+regulation+of+endogenous+proteins.">Optogenetic regulation of endogenous proteins.</a> Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).</li></ol>

L’expression médiée par mnr2b-BAC de l’opTDP-43h et de l’EGFP-TDP-43z chez le poisson-zèbre offre une occasion unique d’imagerie en direct de la transition de phase TDP-43 dans les motoneurones spinaux. La transparence optique des tissus corporels des larves de poisson zèbre permet la stimulation optogénétique simple et non invasive de l’opTDP-43h. Les comparaisons entre les motoneurones spinaux uniques au fil du temps ont démontré que l’oligomérisation dépendante de la lumière de l’opTD...

Les granules de ribonucléoprotéines (RNP) contrôlent une myriade d’activités cellulaires dans le noyau et le cytoplasme en assemblant des partitions sans membrane via la séparation de phase liquide-liquide (LLPS), un phénomène dans lequel un fluide homogène se décompose en deux phases liquides distinctes1,2. Le LLPS dérégulé des protéines de liaison à l’ARN qui fonctionnent normalement comme des composants de granules RNP favorise une transition de phase anormale, conduisant à l’agrégation des protéines. Ce processus a été impliqué dans les maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives3,4,5. L’évaluation précise d’une relation causale entre le LLPS aberrant des protéines de liaison à l’ARN et la pathogenèse de la maladie est cruciale pour déterminer si et comment le LLPS peut être exploité comme cible thérapeutique efficace. Le LLPS des protéines de liaison à l’ARN est relativement facile à étudier in vitro et dans des modèles unicellulaires, mais est difficile dans les organismes multicellulaires, en particulier chez les vertébrés. Une exigence critique pour l’analyse d’un tel LLPS dans des cellules individuelles dans un environnement tissulaire est d’exprimer de manière stable une sonde pour l’imagerie et la manipulation du LLPS dans un type de cellule vulnérable à la maladie.
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est un trouble neurologique finalement mortel dans lequel les motoneurones du cerveau et de la moelle épinière sont perdus sélectivement et progressivement en raison de la dégénérescence. À ce jour, des mutations dans plus de 25 gènes ont été associées à la forme héréditaire (ou familiale) de la SLA, qui représente 5 % à 10 % du total des cas de SLA, et certains de ces gènes causant la SLA codent pour des protéines de liaison à l’ARN constituées de RNI, telles que hnRNPA1, TDP-43 et FUS6,7. De plus, la forme sporadique de la SLA, qui représente 90% à 95% du total des cas de SLA, est caractérisée par l’agrégation cytoplasmique de TDP-43 déposée dans les motoneurones en dégénérescence. Une caractéristique majeure de ces protéines de liaison à l’ARN associées à la SLA est leurs régions intrinsèquement désordonnées (IDR) ou domaines de faible complexité qui manquent de structures tridimensionnelles ordonnées et interviennent dans de faibles interactions protéine-protéine avec de nombreuses protéines différentes qui conduisent LLPS7,8. Le fait que des mutations causant la SLA se produisent souvent dans les IDR a conduit à l’idée que le LLP aberrant et la transition de phase de ces protéines liées à la SLA peuvent sous-tendre la pathogenèse de la SLA9,10.
Récemment, la méthode optoDroplet, une technique optogénétique basée sur Cryptochrome 2 qui permet la modulation des interactions protéine-protéine par la lumière, a été développée pour induire la transition de phase des protéines avec IDRs11. Comme cette technique a été étendue avec succès au TDP-43, elle a commencé à découvrir les mécanismes sous-jacents à la transition de phase pathologique du TDP-43 et sa cytotoxicité associée12,13,14,15. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode génétique pour délivrer un TDP-43 optogénétique aux types de cellules vulnérables à la SLA, à savoir les motoneurones spinaux chez le poisson-zèbre en utilisant le BAC pour le gène mnr2b / mnx2b codant pour une protéine homéodomaine pour la spécification des motoneurones16,17. La translucidité élevée des larves de poisson zèbre permet une stimulation lumineuse simple et non invasive du TDP-43 optogénétique qui déclenche sa transition de phase dans les motoneurones spinaux. Nous présentons également un flux de travail de base pour l’imagerie en direct des motoneurones rachidiens du poisson-zèbre et l’analyse d’images à l’aide du logiciel Fidji/ImageJ disponible gratuitement pour caractériser les réponses du TDP-43 optogénétique à la stimulation lumineuse. Ces méthodes permettent d’étudier la transition de phase du TDP-43 dans un environnement cellulaire vulnérable à la SLA et devraient aider à explorer ses conséquences pathologiques aux niveaux cellulaire et comportemental.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axioimager Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>MEE</td>
			<td>CN-25C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED panel</td>
			<td>Nanoleaf Limited</td>
			<td>Nanoleaf AURORA smarter kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-2plus</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>AD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond BAC100</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>50181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPlanFL N 20&#215;/1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Plan-Neofluar 5x/0.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>HIOKI</td>
			<td>3664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical sensor</td>
			<td>HIOKI</td>
			<td>9742-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red solution 0.5%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>R050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well dish</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer probe BLUE-Wave</td>
			<td>StellerNet Inc.</td>
			<td>VIS-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2725R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish BAC clone CH211-172N16</td>
			<td>BACPAC Genomics</td>
			<td>CH211-172N16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic phase transition of tdp-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae

L’agrégation anormale des protéines et la vulnérabilité neuronale sélective sont deux caractéristiques majeures des maladies neurodégénératives. Les relations causales entre ces caractéristiques peuvent être interrogées en contrôlant la transition de phase d’une protéine associée à la maladie dans un type de cellule vulnérable, bien que cette approche expérimentale ait été limitée jusqu’à présent. Ici, nous décrivons un protocole pour induire la transition de phase de la protéine de liaison ARN/ADN TDP-43 dans les motoneurones spinaux des larves de poisson zèbre pour modéliser l’agrégation cytoplasmique de TDP-43 se produisant dans les motoneurones en dégénérescence dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Nous décrivons une méthode génétique basée sur le chromosome artificiel bactérien (BAC) pour administrer une variante optogénétique du TDP-43 de manière sélective aux motoneurones spinaux du poisson-zèbre. La translucidité élevée des larves de poisson zèbre permet la transition de phase du TDP-43 optogénétique dans les motoneurones spinaux par un simple éclairage externe à l’aide d’une diode électroluminescente (LED) contre les poissons non retenus. Nous présentons également un flux de travail de base d’imagerie en direct des motoneurones rachidiens du poisson-zèbre et d’analyse d’images avec le logiciel Fiji/ImageJ disponible gratuitement pour caractériser les réponses du TDP-43 optogénétique à l’éclairage lumineux. Ce protocole permet de caractériser la transition de phase du TDP-43 et la formation d’agrégats dans un environnement cellulaire vulnérable à la SLA, ce qui devrait faciliter l’étude de ses conséquences cellulaires et comportementales.

Imagerie en direct des protéines TDP-43 optogénétiques et non optogénétiques dans les motoneurones rachidiens mnr2b+ des larves de poisson zèbre Pour induire la transition de phase TDP-43 dans les motoneurones spinaux chez le poisson-zèbre, un TDP-43h humain marqué avec mRFP1 et CRY2olig22 aux N- et C-termini, respectivement, a été construit et désigné comme opTDP-43h14 (Figure ...

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Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Nous décrivons un protocole pour induire la transition de phase de la protéine 43 de liaison à l’ADN TAR (TDP-43) par la lumière dans les motoneurones de la colonne vertébrale en utilisant le poisson-zèbre comme modèle.

Transition de phase optogénétique du TDP-43 dans les motoneurones spinaux des larves de poisson zèbre

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

Ce protocole nous permet donc d’induire des transitions de phase pathologiques du TDP-43 et d’aborder leurs conséquences cellulaires dans les motoneurones spinaux in vivo, ce qui est pertinent pour comprendre pourquoi les motoneurones dégénèrent dans la SLA. En raison de la grande transparence des larves de poisson zèbre, les motoneurones de la moelle épinière sont directement visibles. Ainsi, on peut visualiser le comportement dynamique du TDP-43 subissant des transitions de phase dans les motoneurones spinaux simples.Cette méthode offre un nouveau modèle animal de la SLA. Nous croyons que toute méthode qui peut empêcher la transition de phase et l’agrégation du TDP-43 induites par la lumière dans ce modèle de SLA peut être un candidat potentiel pour le traitement de la SLA. D’autres protéines liées à la SLA avec des régions intrinsèquement désordonnées peuvent être exprimées pour explorer la neurotoxicité associée aux transitions de phase anormales.La clé du succès de cette approche est d’exprimer le TDP-43 optogénétique dans les motoneurones spinaux au niveau non toxique. La transgénèse BAC est une étape qui prend beaucoup de temps, mais une fois que vous créez un poisson transgénique approprié, les étapes suivantes sont relativement plus faciles et directes. Pour commencer, allumez la diode électroluminescente, ou panneau LED, à l’aide de l’application associée installée sur une tablette ou un téléphone.Ensuite, placez la sonde du spectromètre dans un puits vide d’une antenne parabolique de 6 puits. Ensuite, à l’aide de l’application, ajustez la lumière LED à une longueur d’onde culminant à 456 nm. Placez le capteur optique d’un capteur de puissance optique dans le puits vide et réglez la puissance de la lumière LED.Placez ensuite le plat avec le réglage du panneau LED dans un incubateur à 28 C.Pour l’imagerie des larves de poisson zèbre exprimant le TDP-43 optogénétique, déchorionatez les poissons à double transgénique et anesthésiez-les dans un tampon E3 contenant 250 g / mL de Tricane. Ensuite, préchauffer 1% d’agarose à basse température de fusion contenant 250 g / mL de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate à 42 C.Ensuite, mettez une goutte d’agarose sur le plat de base en verre. Le diamètre de la goutte d’agarose en forme de dôme sur le plat en verre doit être de 8 à 10 mm.Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur, ajoutez le poisson anesthésié à l’agarose sur le plat à base de verre. Minimisez la quantité de tampon E3 ajoutée à l’agarose avec le poisson. Ensuite, mélangez en pipetant plusieurs fois.Pendant la solidification de l’agarose, maintenez le poisson sur le côté à l’aide d’une aiguille de seringue, de sorte que la moelle épinière soit dans une position horizontale appropriée. Une fois l’agarose solidifiée, ajoutez quelques gouttes de tampon E3 sur le poisson monté sur l’agarose en forme de dôme. À l’aide d’un microscope confocal équipé d’une lentille d’objectif à immersion dans l’eau 20 fois, acquérir des sections Z confocales en série de la moelle épinière.Inclure le cloaque sur la face ventrale du poisson dans les régions d’intérêt comme référence pour identifier et comparer les segments de la colonne vertébrale à travers les points temporels. Dès que l’imagerie est terminée, utilisez une aiguille de seringue pour casser soigneusement l’agarose et retirer le poisson de l’agarose. Gardez la durée pendant laquelle le poisson est incrusté dans l’agarose aussi courte que possible, bien que l’incorporation de l’agarose pendant moins de 30 minutes n’affecte pas la viabilité du poisson.Ajoutez 7,5 mL de tampon E3 à un puits d’un plat à 6 puits et placez le poisson double transgénique imagé dans ce puits. Ensuite, placez le plat sur le panneau LED, en gardant le parabole et le panneau LED à 5 mm l’un de l’autre avec une entretoise, puis allumez la lumière LED bleue. Conservez du poisson à double transgénique dans un plat séparé de 6 puits recouvert de papier d’aluminium pour les poissons témoins non éclairés.Après le temps d’éclairage souhaité, imagez la moelle épinière du poisson illuminé comme démontré précédemment. La relocalisation cytoplasmique de l’opTDP-43h dans les motoneurones spinaux simples a été visualisée en séparant les images de la série z acquises à 48. et 72 heures après la fertilisation dans chaque canal EGFP-TDP-43z et opTDP-43h.À partir d’images de projection d’intensité maximale de l’EGFP-TDP-43z, un seul neurone spinal isolé identifiable aux deux 48. et 72 heures après la fécondation ont été sélectionnées. Les régions d’intérêt couvrant les somas des motoneurones ont été définies en traçant le bord du signal EGFP à 48.et 72 heures après la fécondation. L’intensité fluorescente normalisée le long de l’axe principal du soma a été tracée. Et 48 heures après la fécondation, les modèles des deux signaux se chevauchaient largement.En revanche, à 72 heures, le pic du signal opTDP-43h a été trouvé dans la région où le signal EGFP-TDP-43z était faible, indiquant la relocalisation cytoplasmique de l’opTDP-43h. Pour quantifier les signaux opTDP-43h et EGFP-TDP-43z avant et après la stimulation de la lumière bleue, des images de projection en tranches pour chaque canal des mêmes images de la série Z ont été produites à 48. et 72 heures après la fécondation.Sur les quatre cellules mnr2b+ étudiées, la cellule 1 présentait notamment un signal EGFP-TDP-43z saturé. Les quantités relatives d’opTDP-43h à EGFP-TDP-43z ont été calculées en divisant la valeur de la demande de propositions par la valeur de la BPF. Les cellules 2 à 4 affichaient des niveaux d’opTDP-43h décroissants après éclairage de lumière bleue.Il est important de minimiser le temps pendant lequel les poissons sont incrustés dans l’agarose pour les garder en bonne santé. En ajustant l’intensité et la durée de l’éclairage LED, nous contrôlons la transition de phase TDP-43 de manière régulée temporaire, ce qui peut aider à disséquer la progression de la transition de phase pathologique TDP-43 dans le motoneurone.

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L&#39;activation des neurones somatosensoriels optogenetic poisson zèbre en utilisant Chef-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica (Video) | JoVE

Identifier les motoneurones extracellulaire d&#39;un Motor Pool musculaire dans<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

poisson zèbre<em&gt; In Situ</em&gt; Préparation à la moelle épinière électrophysiologiques Les enregistrements de la colonne vertébrale et sensorielle motoneurones

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Traçage neuroanatomique rétrograde des motoneurones phréniques chez la souris

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Analyser le comportement larves de drosophile en réponse à une Stimulation des neurones olfactifs Optogenetic

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs) en neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels utilisant des vecteurs PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolement et culture des neurones oculomoteurs, trochlear et moteurs rachidiens de l'islmnprénatal :GFP Souris transgéniques

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Mesure de l’absorption du glucose dans les modèles de drosophile de la protéopathie TDP-43

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

In vivo Contrôle optogénétique sans fil du comportement moteur qualifié

Fine motor skills are essential in everyday life and can be compromised in several nervous system disorders. The acquisition and performance of these ...