Name: optogenetic phase transition of tdp-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae
Uploaded: 2022-02-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numeri JP19K06933 (KA) e JP20H05345 (KA).

Tutto il lavoro sui pesci è stato condotto in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (numero di identificazione di approvazione 24-2) dell'Istituto nazionale di genetica (Giappone), che ha una garanzia del benessere degli animali in archivio (numero di garanzia A5561-01) presso l'Ufficio per il benessere degli animali da laboratorio del National Institutes of Health (NIH, STATI UNITI).
1. Co...

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	<li>Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+transitions+and+size+scaling+of+membrane-less+organelles.">Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles.</a> Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).</li><li>Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+in+biology.">Liquid-liquid phase separation in biology.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).</li><li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+rna+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development.">Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).</li><li>Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+biophysics+and+neurology:+aberrant+phase+transitions+in+neurodegenerative+disease.">Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).</li><li>Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+ribostasis:+RNA-protein+granules+in+degenerative+disorders.">Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders.</a> Cell. 154 (4), 727-736 (2013).</li><li>Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+genes+in+the+genomic+era+and+their+implications+for+FTD.">ALS genes in the genomic era and their implications for FTD.</a> Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).</li><li>Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+and+therapeutic+potential+of+liquid-liquid+phase+separation+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).</li><li>Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+disorder+in+proteins+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).</li><li>Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rethinking+ALS:+the+FUS+about+TDP-43.">Rethinking ALS: the FUS about TDP-43.</a> Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).</li><li>Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-phaseted+problems+of+TDP-43+in+selective+neuronal+vulnerability+in+ALS.">Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optodroplets.">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optogenetic+induction+of+stress+granules+is+cytotoxic+and+reveals+the+evolution+of+ALS-FTD+pathology.">Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology.</a> Elife. 8, 39578 (2019).</li><li>Mann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Binding+Antagonizes+Neurotoxic+Phase+Transitions+of+TDP-43.">RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43.</a> Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).</li><li>Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+modulation+of+TDP-43+oligomerization+accelerates+ALS-related+pathologies+in+the+spinal+motor+neurons.">Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).</li><li>Otte, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+TDP-43+nucleation+induces+persistent+insoluble+species+and+progressive+motor+dysfunction+in+vivo.">Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo.</a> Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).</li><li>Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mnx+genes+in+endocrine+and+exocrine+pancreas+formation.">Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation.</a> Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).</li><li>Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Mnx+proteins+specify+one+motoneuron+subtype+and+suppress+acquisition+of+interneuron+characteristics.">Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics.</a> Neural Development. 7, 35 (2012).</li><li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).</li><li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish.">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li><li>Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+the+spinal+cord+motor+column+by+BAC+transgenesis+and+gene+trapping+in+zebrafish.">Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function.">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nature Communications. 5, 4925 (2014).</li><li>Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocadherin-mediated+cell+repulsion+controls+the+central+topography+and+efferent+projections+of+the+abducens+nucleus.">Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus.</a> Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).</li><li>Redchuk, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+regulation+of+endogenous+proteins.">Optogenetic regulation of endogenous proteins.</a> Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).</li></ol>

L'espressione mediata da mnr2b-BAC di opTDP-43h e EGFP-TDP-43z nel pesce zebra offre un'opportunità unica per l'imaging dal vivo della transizione di fase TDP-43 nei motoneuroni spinali. La trasparenza ottica dei tessuti corporei delle larve di zebrafish consente la stimolazione optogenetica semplice e non invasiva di opTDP-43h. I confronti tra i singoli motoneuroni spinali nel tempo hanno dimostrato che l'oligomerizzazione dipendente dalla luce di opTDP-43h causa il suo clustering citoplasmatico, che ricorda l...

I granuli di ribonucleoproteine (RNP) controllano una miriade di attività cellulari nel nucleo e nel citoplasma assemblando partizioni senza membrana tramite separazione di fase liquido-liquido (LLPS), un fenomeno in cui un fluido omogeneo demixes in due fasi liquide distinte1,2. Il LLPS disregolato delle proteine leganti l'RNA che normalmente funzionano come componenti del granulo RNP promuove una transizione di fase anormale, portando all'aggregazione proteica. Questo processo è stato implicato nelle malattie dello sviluppo neurologico e neurodegenerative3,4,5. La valutazione precisa di una relazione causale tra LLPS aberrante di proteine leganti l'RNA e patogenesi della malattia è cruciale per determinare se e come LLPS può essere sfruttato come bersaglio terapeutico efficace. LLPS delle proteine leganti l'RNA è relativamente facile da studiare in vitro e in modelli unicellulari, ma è difficile negli organismi multicellulari, specialmente nei vertebrati. Un requisito critico per l'analisi di tale LLPS in singole cellule all'interno di un ambiente tissutale è quello di esprimere stabilmente una sonda per l'imaging e la manipolazione di LLPS in un tipo di cellula vulnerabile alla malattia di interesse.
La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è un disturbo neurologico in definitiva fatale in cui i motoneuroni del cervello e del midollo spinale vengono persi selettivamente e progressivamente a causa della degenerazione. Ad oggi, mutazioni in più di 25 geni sono state associate alla forma ereditaria (o familiare) della SLA, che rappresenta il 5%-10% dei casi totali di SLA, e alcuni di questi geni che causano la SLA codificano per proteine leganti l'RNA costituite da RNP, come hnRNPA1, TDP-43 e FUS6,7. Inoltre, la forma sporadica di SLA, che rappresenta il 90%-95% dei casi totali di SLA, è caratterizzata dall'aggregazione citoplasmatica di TDP-43 depositato in motoneuroni degeneranti. Una delle principali caratteristiche di queste proteine leganti l'RNA associate alla SLA sono le loro regioni intrinsecamente disordinate (IDR) o domini a bassa complessità che mancano di strutture tridimensionali ordinate e mediano deboli interazioni proteina-proteina con molte proteine diverse che guidano LLPS7,8. Il fatto che le mutazioni che causano la SLA si verifichino spesso negli esami approfonditi ha portato all'idea che la LLPS aberrante e la transizione di fase di queste proteine correlate alla SLA possano essere alla base della patogenesi della SLA9,10.
Recentemente, il metodo optoDroplet, una tecnica optogenetica basata su Cryptochrome 2 che consente la modulazione delle interazioni proteina-proteina da parte della luce, è stato sviluppato per indurre la transizione di fase delle proteine con IDR11. Poiché questa tecnica è stata estesa con successo a TDP-43, ha iniziato a scoprire i meccanismi alla base della transizione di fase patologica di TDP-43 e la sua citotossicità associata12,13,14,15. In questo protocollo, delineiamo un metodo genetico per fornire un TDP-43 optogenetico a tipi di cellule vulnerabili alla SLA, vale a dire, motoneuroni spinali nel pesce zebra utilizzando il BAC per il gene mnr2b / mnx2b che codifica per una proteina omeodominio per la specifica del motoneurone16,17. L'elevata traslucenza delle larve di zebrafish consente una stimolazione luminosa semplice e non invasiva del TDP-43 optogenetico che innesca la sua transizione di fase nei motoneuroni spinali. Presentiamo anche un flusso di lavoro di base per l'imaging dal vivo dei motoneuroni spinali zebrafish e l'analisi delle immagini utilizzando il software Fiji / ImageJ disponibile gratuitamente per caratterizzare le risposte del TDP-43 optogenetico alla stimolazione della luce. Questi metodi consentono un'indagine sulla transizione di fase del TDP-43 in un ambiente cellulare vulnerabile alla SLA e dovrebbero aiutare a esplorare le sue conseguenze patologiche a livello cellulare e comportamentale.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axioimager Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>MEE</td>
			<td>CN-25C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED panel</td>
			<td>Nanoleaf Limited</td>
			<td>Nanoleaf AURORA smarter kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-2plus</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>AD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond BAC100</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>50181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPlanFL N 20&#215;/1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Plan-Neofluar 5x/0.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>HIOKI</td>
			<td>3664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical sensor</td>
			<td>HIOKI</td>
			<td>9742-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red solution 0.5%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>R050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well dish</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer probe BLUE-Wave</td>
			<td>StellerNet Inc.</td>
			<td>VIS-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2725R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish BAC clone CH211-172N16</td>
			<td>BACPAC Genomics</td>
			<td>CH211-172N16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic phase transition of tdp-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae

L'aggregazione proteica anormale e la vulnerabilità neuronale selettiva sono due dei principali tratti distintivi delle malattie neurodegenerative. Le relazioni causali tra queste caratteristiche possono essere interrogate controllando la transizione di fase di una proteina associata alla malattia in un tipo di cellula vulnerabile, sebbene questo approccio sperimentale sia stato finora limitato. Qui, descriviamo un protocollo per indurre la transizione di fase della proteina legante l'RNA / DNA TDP-43 nei motoneuroni spinali delle larve di zebrafish per modellare l'aggregazione citoplasmatica di TDP-43 che si verifica nei motoneuroni degenerativi nella sclerosi laterale amiotrofica (SLA). Descriviamo un metodo genetico basato sul cromosoma artificiale batterico (BAC) per fornire una variante optogenetica TDP-43 in modo selettivo ai motoneuroni spinali del pesce zebra. L'elevata traslucenza delle larve di zebrafish consente la transizione di fase dell'optogenetico TDP-43 nei motoneuroni spinali mediante una semplice illuminazione esterna utilizzando un diodo a emissione luminosa (LED) contro pesci sfrenati. Presentiamo anche un flusso di lavoro di base di imaging dal vivo dei motoneuroni spinali zebrafish e analisi delle immagini con il software Fiji / ImageJ disponibile gratuitamente per caratterizzare le risposte optogenetiche TDP-43 all'illuminazione della luce. Questo protocollo consente la caratterizzazione della transizione di fase TDP-43 e della formazione di aggregati in un ambiente cellulare vulnerabile alla SLA, che dovrebbe facilitare un'indagine delle sue conseguenze cellulari e comportamentali.

Imaging dal vivo di proteine TDP-43 optogenetiche e non optogenetiche nei motoneuroni spinali mnr2b+ delle larve di zebrafish Per indurre la transizione di fase TDP-43 nei motoneuroni spinali nel pesce zebra, è stato costruito un TDP-43h umano che è taggato con mRFP1 e CRY2olig22 ai termini N- e C, rispettivamente, e designato come opTDP-43h14 (Figura 1A). Il frammento del gene op...

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Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Descriviamo un protocollo per indurre la transizione di fase della proteina 43 legante il DNA TAR (TDP-43) dalla luce nei motoneuroni spinali usando zebrafish come modello.

Transizione di fase optogenetica di TDP-43 nei motoneuroni spinali delle larve di zebrafish

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

Quindi questo protocollo ci consente di indurre transizioni di fase patologiche di TDP-43 e affrontare le loro conseguenze cellulari nei motoneuroni spinali in vivo, il che è rilevante per capire perché i motoneuroni degenerano nella SLA. A causa dell'elevata trasparenza delle larve di zebrafish, i motoneuroni nel midollo spinale sono direttamente visibili. Quindi si può visualizzare il comportamento dinamico di TDP-43 in fase di transizioni in singoli motoneuroni spinali.Questo metodo offre un nuovo modello animale di SLA. Riteniamo che qualsiasi metodo in grado di prevenire la transizione di fase e l'aggregazione di TDP-43 indotta dalla luce in questo modello di SLA possa essere un potenziale candidato per la terapia della SLA. Altre proteine correlate alla SLA con regioni intrinsecamente disordinate possono essere espresse per esplorare la neurotossicità associata alle transizioni di fase anormali.La chiave del successo in questo approccio è esprimere il TDP-43 optogenetico nei motoneuroni spinali a livello non tossico. La transgenesi BAC è un passo che richiede tempo, ma una volta creato un pesce transgenico adeguato, i seguenti passaggi sono relativamente più facili e diretti. Per iniziare, accendere il diodo a emissione luminosa o il pannello LED utilizzando l'applicazione associata installata su un tablet o un telefono.Quindi, posizionare la sonda dello spettrometro in un pozzo vuoto di un piatto a 6 pozzetti. Quindi, utilizzando l'applicazione, regolare la luce LED su una lunghezza d'onda con un picco di 456 nm. Posizionare il sensore ottico di un misuratore di potenza ottica nel pozzo vuoto e regolare la potenza della luce LED.Quindi posizionare il piatto con l'impostazione del pannello LED in un incubatore a 28 C.Per l'imaging delle larve di pesce zebra che esprimono TDP-43 optogenetico, decoerniare il pesce doppio transgenico e anestetizzarli in un tampone E3 contenente 250 g / mL di Tricane. Quindi, preriscaldare l'1% di agarosio a bassa temperatura di fusione contenente 250 g / mL di etil 3-aminobenzoato metanosolfonato a 42 C.Quindi mettere una goccia di agarosio sulla piastra di base di vetro. Il diametro della goccia di agarosio a forma di cupola sul piatto di vetro dovrebbe essere compreso tra 8 e 10 mm.Quindi, usando una pipetta Pasteur, aggiungere il pesce anestetizzato all'agarosio sul piatto a base di vetro. Ridurre al minimo la quantità di tampone E3 aggiunto all'agarosio insieme al pesce. Quindi, mescolare pipettando un paio di volte.Durante la solidificazione dell'agarosio, mantenere il pesce su un fianco usando un ago a siringa, in modo tale che il midollo spinale sia in una posizione orizzontale appropriata. Dopo che l'agarosio si è solidificato, aggiungi un paio di gocce di tampone E3 sul pesce montato sull'agarosio a forma di cupola. Utilizzando un microscopio confocale dotato di una lente obiettivo ad immersione in acqua 20 volte, acquisire sezioni z confocali seriali del midollo spinale.Includere la cloaca sul lato ventrale del pesce nelle regioni di interesse come riferimento per identificare e confrontare i segmenti spinali attraverso i punti temporali. Non appena l'imaging è completo, utilizzare un ago a siringa per rompere con cura l'agarosio e rimuovere il pesce dall'agarosio. Mantenere la quantità di tempo in cui il pesce è incorporato nell'agarosio il più breve possibile, anche se l'incorporamento di agarosio per meno di 30 minuti non influisce sulla vitalità del pesce.Aggiungere 7,5 ml di tampone E3 a un pozzetto di un piatto a 6 pozzetti e posizionare il pesce doppio transgenico ripreso in quel pozzo. Quindi, posizionare il piatto sul pannello LED, mantenendo il piatto e il pannello LED a 5 mm di distanza con un distanziatore e accendere la luce LED blu. Tenere alcuni pesci a doppio transgenico in un piatto separato a 6 pozzetti coperto con un foglio di alluminio per pesci di controllo non illuminati.Dopo il tempo di illuminazione desiderato, ha ripreso il midollo spinale del pesce illuminato come dimostrato in precedenza. Il trasferimento citoplasmatico dell'opTDP-43h in singoli motoneuroni spinali è stato visualizzato separando le immagini della serie z acquisite a 48 anni. e 72 ore dopo la fecondazione in ciascun canale EGFP-TDP-43z e opTDP-43h.Dalle immagini di proiezione di massima intensità di EGFP-TDP-43z, un singolo neurone spinale isolato identificabile a entrambi i 48. e sono state selezionate 72 ore dopo la fecondazione. Le regioni di interesse che coprono i somi dei motoneuroni sono state impostate tracciando il bordo del segnale EGFP a 48.e 72 ore dopo la fecondazione. L'intensità fluorescente normalizzata lungo l'asse maggiore del soma è stata tracciata. E a 48 ore dopo la fecondazione, i modelli di entrambi i segnali si sovrapponevano in gran parte l'un l'altro.Al contrario, a 72 ore, il picco per il segnale opTDP-43h è stato trovato nella regione in cui il segnale EGFP-TDP-43z era basso, indicando il trasferimento citoplasmatico di opTDP-43h. Per quantificare i segnali opTDP-43h e EGFP-TDP-43z prima e dopo la stimolazione della luce blu, sono state prodotte a 48 alcune immagini di proiezione slice per ciascun canale delle stesse immagini della serie z. e 72 ore dopo la fecondazione.Delle quattro celle mnr2b+ che sono state studiate, la cella 1, in particolare, ha mostrato un segnale EGFP-TDP-43z saturo. Le quantità relative di opTDP-43h a EGFP-TDP-43z sono state calcolate dividendo il valore RFP per il valore GFP. Le celle da 2 a 4 mostravano livelli di opTDP-43h decrescenti dopo l'illuminazione a luce blu.È importante ridurre al minimo il tempo in cui i pesci sono incorporati nell'agarosio per mantenerli sani. Regolando l'intensità e la durata dell'illuminazione a LED, controlliamo la transizione di fase TDP-43 in modo regolato temporaneamente, che può aiutare a sezionare la progressione della transizione di fase patologica TDP-43 nel motoneurone.

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Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica Video (Video) | JoVE

Extracellulare Identificazione neuroni motori per un pool di motore muscolare in<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion Video (Video) | JoVE

Optogenetic Perturbazione di attività neurale con illuminazione laser in semi-intatte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Analisi Neuroanatomical retrogrado dei motoneuroni frenico in topi

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolamento e coltura di Oculomotor, Trochlear, e MotoNeuroni Spinali da Prenatal Islmn:GFP Topi Transgenici

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Misurazione dell'assorbimento di glucosio in modelli di Drosophila di proteinopatia TDP-43

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

In vivo Controllo optogenetico wireless del comportamento motorio qualificato

Fine motor skills are essential in everyday life and can be compromised in several nervous system disorders. The acquisition and performance of these ...