Name: optogenetic phase transition of tdp-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae
Uploaded: 2022-02-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae at JoVE.com

이 작품은 세리카 펀드 (KA), KAKENHI 그랜트 번호 JP19K06933 (KA) 및 JP20H05345 (KA)에 의해 지원되었다.

모든 어류 작업은 국립보건원 동물복지실(NIH, NIH)의 동물복지실(보증번호 A5561-01)을 제출하는 국립유전학원(일본)의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드(일본 24-2)에 따라 진행되었습니다. 미국).
1. mnr2b 프로모터로부터 광유전학 TDP-43 유전자의 발현을 위한 BAC의 건설
<ol><li>BAC 준비<ol>
<li>제브라피쉬 mnr2b 궤적(CH211-172N16, BACPAC 유전체학)을 함유한 제브?...

<ol>
	<li>Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+transitions+and+size+scaling+of+membrane-less+organelles.">Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles.</a> Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).</li><li>Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+in+biology.">Liquid-liquid phase separation in biology.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).</li><li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+rna+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development.">Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).</li><li>Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+biophysics+and+neurology:+aberrant+phase+transitions+in+neurodegenerative+disease.">Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).</li><li>Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+ribostasis:+RNA-protein+granules+in+degenerative+disorders.">Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders.</a> Cell. 154 (4), 727-736 (2013).</li><li>Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+genes+in+the+genomic+era+and+their+implications+for+FTD.">ALS genes in the genomic era and their implications for FTD.</a> Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).</li><li>Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+and+therapeutic+potential+of+liquid-liquid+phase+separation+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).</li><li>Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rethinking+ALS:+the+FUS+about+TDP-43.">Rethinking ALS: the FUS about TDP-43.</a> Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).</li><li>Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-phaseted+problems+of+TDP-43+in+selective+neuronal+vulnerability+in+ALS.">Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optodroplets.">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optogenetic+induction+of+stress+granules+is+cytotoxic+and+reveals+the+evolution+of+ALS-FTD+pathology.">Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology.</a> Elife. 8, 39578 (2019).</li><li>Mann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Binding+Antagonizes+Neurotoxic+Phase+Transitions+of+TDP-43.">RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43.</a> Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).</li><li>Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+modulation+of+TDP-43+oligomerization+accelerates+ALS-related+pathologies+in+the+spinal+motor+neurons.">Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).</li><li>Otte, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+TDP-43+nucleation+induces+persistent+insoluble+species+and+progressive+motor+dysfunction+in+vivo.">Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo.</a> Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).</li><li>Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mnx+genes+in+endocrine+and+exocrine+pancreas+formation.">Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation.</a> Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).</li><li>Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. 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L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish.">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li><li>Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+the+spinal+cord+motor+column+by+BAC+transgenesis+and+gene+trapping+in+zebrafish.">Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function.">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nature Communications. 5, 4925 (2014).</li><li>Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocadherin-mediated+cell+repulsion+controls+the+central+topography+and+efferent+projections+of+the+abducens+nucleus.">Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus.</a> Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).</li><li>Redchuk, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+regulation+of+endogenous+proteins.">Optogenetic regulation of endogenous proteins.</a> Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).</li></ol>

mnr2b-BAC-매개 발현은 제브라피시의 opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z의 발현을 척추 운동 뉴런에서 TDP-43 위상 전이의 라이브 이미징을 위한 독특한 기회를 제공한다. 제브라피시 애벌레의 신체 조직의 광학적 투명성은 opTDP-43h의 간단하고 비침습적 광유전학적 자극을 허용합니다. 시간이 지남에 따라 단일 척추 운동 뉴런 사이의 비교는 opTDP-43h의 빛 의존 올리고머화가 ALS 병리학을 연상시키는 세포질 클?...

리보뉴클레오단백질(RNP) 과립은 균질유체가 2개의 뚜렷한 액체 상1,2로 분해되는 현상인 액체 액체 상 분리(LLPS)를 통해 멤브레인 이없는 분할을 조립하여 핵 및 세포질에서 무수한 세포 활동을 제어합니다. RNP 과립 성분으로 일반적으로 작동하는 RNA 결합 단백질의 소화 불량 LLPS는 단백질 응집으로 이끌어 내는 이상한 상 전이를 촉진합니다. 이 과정은 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환에 연루되었습니다3,4,5. RNA 결합 단백질과 질병 병인의 비정상적인 LLPS 사이의 인과 관계의 정확한 평가는 LLPS가 효과적인 치료 대상으로 악용 될 수있는 여부와 방법을 결정하기위해 중요합니다. RNA 결합 단백질의 LLPS는 시험관 내 및 단세포 모형에서 공부하기 쉽지만 다세포 유기체, 특히 척추동물에서는 어렵습니다. 조직 환경 내의 개별 세포에서 이러한 LLPS를 분석하기 위한 중요한 요구 사항은 질병에 취약한 세포 유형의 LLPS의 이미징 및 조작을 위한 프로브를 안정적으로 표현하는 것입니다.
근위축성 측삭 경화증 (ALS)은 뇌와 척수의 운동 뉴런이 변성으로 인해 선택적으로 점진적으로 손실되는 궁극적으로 치명적인 신경 장애입니다. 현재까지 25개 이상의 유전자에 있는 돌연변이는 총 ALS 케이스의 5%-10%를 차지하는 유전성(또는 가족적인) 형태의 ALS와 연관되어 있으며, 이들 ALS 유발 유전자 중 일부는 hnRNPA1, TDP-43 및 FUS6,7과 같은 RNP로 구성된 RNA 결합 단백질을 인코딩합니다. 더욱이, 총 ALS 케이스의 90%-95%를 차지하는 ALS의 산발적인 양식은 퇴행성 운동 뉴런에 증착된 TDP-43의 세포질 집계를 특징으로 합니다. 이러한 ALS 관련 RNA 결합 단백질의 주요 특징은 본질적으로 무질서한 영역(IDRs) 또는 주문된 3차원 구조가 부족한 저복잡성 영역이며 LLPS7,8을 구동하는 많은 다른 단백질과 약한 단백질 단백질 상호 작용을 중재합니다. ALS 일으키는 돌연변이가 IDRs에서 수시로 생기는 다는 사실은 이 ALS 관련 단백질의 비정상적인 LLPS 및 위상 전이가 ALS 병인9,10의 기초가 될 수 있다는 생각으로 이끌어 냈습니다.
최근에는 광에 의한 단백질-단백질 상호작용을 조절할 수 있는 Cryptochrome 2기반 광유전학기인 OptoDroplet 방법이 IDRs11을 이용한 단백질의 위상 전이를 유도하기 위해 개발되었다. 이 기술은 TDP-43로 성공적으로 확장되었기 때문에 TDP-43의 병리학적 위상 전환과 그 관련 세포 독성12,13,14,15의 기전을 밝히기 시작했습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 ALS 취약 세포 모형, 즉, mnr2b/mnx2b 유전자를 위한 BAC를 사용하여 제브라피시의 척추 운동 뉴런에 광유전학 TDP-43을 전달하는 유전 적 방법을 간략하게 설명합니다16,17. 제브라피시 애벌레의 높은 투명도는 척추 운동 뉴런의 위상 전환을 유발하는 광유전학 TDP-43의 간단하고 비침습적인 빛 자극을 허용합니다. 우리는 또한 광 자극에 대한 광유전학 TDP-43의 반응을 특성화하기 위해 자유롭게 사용할 수있는 피지 / ImageJ 소프트웨어를 사용하여 제브라피쉬 척추 운동 뉴런및 이미지 분석의 라이브 이미징을위한 기본 워크플로우를 제시합니다. 이러한 방법은 ALS 취약 한 세포 환경에서 TDP-43 단계 전이의 조사를 허용 하 고 세포 및 행동 수준에서 그것의 병적인 결과 탐구 하는 데 도움이 되어야 한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axioimager Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>MEE</td>
			<td>CN-25C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED panel</td>
			<td>Nanoleaf Limited</td>
			<td>Nanoleaf AURORA smarter kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-2plus</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>AD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond BAC100</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>50181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPlanFL N 20&#215;/1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Plan-Neofluar 5x/0.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>HIOKI</td>
			<td>3664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical sensor</td>
			<td>HIOKI</td>
			<td>9742-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red solution 0.5%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>R050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well dish</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer probe BLUE-Wave</td>
			<td>StellerNet Inc.</td>
			<td>VIS-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2725R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish BAC clone CH211-172N16</td>
			<td>BACPAC Genomics</td>
			<td>CH211-172N16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic phase transition of tdp-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae

비정상적인 단백질 집계 및 선택적 뉴런 취약성은 신경 퇴행성 질환의 두 가지 주요 특징입니다. 이러한 특징 들 사이의 인과 관계는 취약한 세포 유형에서 질병 관련 단백질의 위상 전이를 제어함으로써 심문 될 수 있지만, 이러한 실험적 접근방식은 지금까지 제한되었습니다. 여기서, 근위축성 측삭 경화증(ALS)에서 퇴행성 모터 뉴런에서 발생하는 TDP-43의 세포질 응집 모델링을 위한 제브라피시 애벌레의 척추 운동 뉴런에서 RNA/DNA 결합 단백질 TDP-43의 위상 전이를 유도하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 제브라피시의 척추 운동 뉴런에 선택적으로 광유전학 TDP-43 변종을 전달하는 세균성 인공 염색체 (BAC)기지를 둔 유전 방법을 기술합니다. 제브라피시 애벌레의 높은 투명도는 억제되지 않은 물고기에 대한 발광 다이오드(LED)를 사용하여 간단한 외부 조명에 의해 척추 운동 뉴런에서 광유전학 TDP-43의 위상 전환을 허용합니다. 우리는 또한 광 조명에 광유전학 TDP-43의 반응을 특성화하기 위해 자유롭게 사용할 수있는 피지 / ImageJ 소프트웨어와 함께 제브라피쉬 척추 운동 뉴런및 이미지 분석의 라이브 이미징의 기본 워크플로우를 제시한다. 이 프로토콜은 ALS 취약 세포 환경에서 TDP-43 위상 전환 및 집계 형성의 특성화를 가능하게 하며, 이는 세포 및 행동 결과에 대한 조사를 용이하게 해야 합니다.

제브라피시 애벌레의 척추 운동 뉴런에 있는 광유전학 및 비 광유전학 TDP-43 단백질의 살아있는 화상 진찰 제브라피시의 척추 운동 뉴런에서 TDP-43 상 전이를 유도하기 위해, N-및 C-테르미니에서 mRFP1 및 CRY2olig22로 태그되는 인간 TDP-43h는 각각 opTDP-43h14(도 1A)로 구성및 지정되었다. opTDP-43h 유전...

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Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

우리는 제브라피시를 모델로 사용하여 척추 운동 뉴런의 빛에 의한 TAR DNA 결합 단백질(43)의 위상 전이를 유도하는 프로토콜을 설명합니다.

얼룩말 물고기 애벌레의 척추 모터 뉴런에서 TDP-43의 광유전학 적 단계 전환

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

따라서 이 프로토콜을 통해 TDP-43의 병리학적 위상 전환을 유도하고 생체 내 척추 운동 뉴런의 세포 적 결과를 해결할 수 있으며, 이는 운동 뉴런이 ALS에서 퇴화하는 이유를 이해하는 데 관련이 있습니다. 제브라피시 애벌레의 높은 투명성으로 인해 척수의 운동 뉴런이 직접 보입니다. 따라서 단일 척추 운동 뉴런에서 단계 전이를 겪고 있는 TDP-43의 동적 동작을 시각화할 수 있습니다.이 방법은 ALS의 새로운 동물 모델을 제공합니다. 우리는 이 ALS 모형에 있는 빛 유도한 TDP-43 상 전이 및 응집을 방지할 수 있는 어떤 방법든지 ALS 치료를 위한 잠재적인 후보가 될 수 있다는 것을 믿습니다. 본질적으로 무질서한 지구를 가진 그밖 ALS 관련 단백질은 이상한 단계 전이와 관련되었던 신경 독성을 탐구하기 위하여 표현될 수 있습니다.이 접근법에서 성공의 열쇠는 무독성 수준에서 척추 운동 뉴런에서 광유전학 TDP-43을 표현하는 것입니다. BAC 전생은 시간이 많이 걸리는 단계이지만 적절한 형질전환 물고기를 만들면 다음 단계는 비교적 쉽고 간단합니다. 먼저 태블릿이나 휴대폰에 설치된 관련 응용 프로그램을 사용하여 발광 다이오드 또는 LED 패널을 켭니다.다음으로 분광계 프로브를 6웰 접시의 빈 우물에 놓습니다. 그런 다음 응용 프로그램을 사용하여 LED 라이트를 456 nm에서 파장 피크로 조정합니다. 광학 전력 계의 광학 센서를 빈 우물에 놓고 LED 조명의 힘을 조절합니다.그런 다음 28 C.에서 인큐베이터에 LED 패널 설정으로 접시를 배치하여 광유전학 TDP-43을 표현하는 얼룩말 물고기 애벌레의 이미징을 위해 이중 트랜스제닉 물고기를 데코를 선명하게 하고 트라이케인 250 g/mL를 함유한 E3 버퍼로 마취합니다. 다음으로, 에틸 3-아미노벤조이트 메탄술포네이트250g/mL를 함유한 1% 낮은 용융 온도 아가로즈를 예열한 다음 유리 베이스 디쉬에 아가로즈 한 방울을 놓습니다. 유리 접시에 돔 모양의 아가로즈 드롭의 직경은 8 ~ 10mm해야합니다.다음으로 파스퇴르 파이펫을 사용하여 마취된 생선을 유리 기반 접시에 아가로즈에 추가합니다. 물고기와 함께 아가로즈에 추가된 E3 버퍼의 양을 최소화합니다. 그런 다음, 몇 번 파이펫으로 혼합.아가로즈의 고화 시 척수가 적절한 수평 위치에 있도록 주사기 바늘을 사용하여 측면에 물고기를 유지합니다. 아가로즈가 고화된 후, 돔 모양의 아가로즈 장착 물고기에 E3 버퍼 몇 방울을 추가합니다. 20배의 물 침수 목표 렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 척수의 연속 공초점 z 단면을 획득합니다.관심 지역의 물고기의 복부 쪽에 클로카를 포함하고 시간 지점에 걸쳐 척추 세그먼트를 식별하고 비교하는 참조로. 이미징이 완료되자마자 주사기 바늘을 사용하여 아가로즈를 조심스럽게 부수고 아가로즈에서 물고기를 제거하십시오. 아가로즈가 30분 미만이 포함되어 있지만 물고기의 생존가능성에 영향을 미치지 않지만, 물고기가 아가로즈에 내장되는 시간을 가능한 한 짧게 유지합니다.7.5mL의 E3 버퍼를 6웰 접시에 넣고 이미지된 이중 트랜스제닉 생선을 잘 넣습니다. 그런 다음 접시를 LED 패널에 놓고 접시와 LED 패널을 스페이서와 5mm 떨어져 놓고 파란색 LED 조명을 켭니다. 알루미늄 호일로 덮인 별도의 6웰 요리에 이중 트랜스제닉 생선을 보관하여 비조명되지 않은 컨트롤 피쉬를 만듭니다.원하는 조명 시간 후, 이전에 설명한 대로 조명된 물고기의 척수를 이미지했습니다. 단일 척추 운동 뉴런에서 opTDP-43h의 세포질 재배치는 48에서 획득한 z 시리즈 이미지를 분리하여 시각화되었다. 및 72시간 각 EGFP-TDP-43z 및 opTDP-43h 채널로 수정 후.EGFP-TDP-43z의 최대 강도 프로젝션 이미지에서, 둘 다에서 식별 할 수있는 단일 고립 된 척추 뉴런 48. 및 72시간 후 수정이 선택되었다. 모터 뉴런의 소마를 덮는 관심 영역은 48에서 EGFP 신호의 가장자리를 추적하여 설정되었다.및 72 시간 후 수정. 소마의 주요 축을 따라 정규화된 형광 강도가 플롯되었다. 그리고 48 시간 후 수정, 두 신호의 패턴은 크게 서로 겹쳤다.대조적으로, 72시간, OPTDP-43h 신호의 피크는 EGFP-TDP-43z 신호가 낮았던 지역에서 발견되었으며, 이는 opTDP-43h의 세포질 재배치를 나타낸다. 청색광 자극 전후의 opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z 신호를 정량화하기 위해 동일한 z 시리즈 이미지의 각 채널에 대한 일부 슬라이스 프로젝션 이미지가 48에서 생성되었다. 및 72 시간 후 수정.조사된 4개의 mnr2b+셀 중, 셀 1은 특히 포화 된 EGFP-TDP-43z 신호를 표시하였다. EGFP-TDP-43z에 대한 opTDP-43h의 상대적 양은 RFP 값을 GFP 값으로 나누어 계산되었다. 세포 2 ~ 4는 청색광 조명 후 opTDP-43h 수준이 감소하는 것을 나타냈다.물고기를 건강하게 유지하기 위해 아가로즈에 내장된 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. LED 조명의 강도와 지속 시간을 조정함으로써, 우리는 모터 뉴런에서 병리학 적 TDP-43 위상 전이의 진행을 해부 하는 데 도움이 될 수 있는 임시 규제 방식으로 TDP-43 위상 전이를 제어 합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

요리사 tdTomato를 사용하여 Zebrafish Somatosensory의 뉴런의 Optogenetic 활성화

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracellularly의 근육 모터 풀에 모터 뉴런을 확인<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

세미 그대로의 레이저 조명과 신경 활동의 Optogenetic 섭동<em&gt; 초파리</em모션&gt; 유충

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish의<em&gt; 시츄</em&gt; 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

마우스에 인할지 모터 신경의 퇴행 성 신경 해부학 추적

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

태아 기 이슬mn에서 Oculomotor, Trochlear 및 척추 모터 뉴런의 격리 및 문화 :GFP 형질전환 마우스

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

TDP-43 단백질 요법의 드로소필라 모델에서 포도당 섭취 측정

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

생체 내 숙련 된 운동 행동의 무선 광유전학 제어

Fine motor skills are essential in everyday life and can be compromised in several nervous system disorders. The acquisition and performance of these ...