Name: optogenetic phase transition of tdp-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae
Uploaded: 2022-02-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae at JoVE.com

Detta arbete stöddes av SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numbers JP19K06933 (KA) och JP20H05345 (KA).

Allt fiskearbete utfördes i enlighet med guiden för vård och användning av laboratoriedjur i den institutionella kommittén för djuromsorg och användning (godkännandenummer 24-2) vid National Institute of Genetics (Japan), som har en djurskyddsgaranti registrerad (försäkringsnummer A5561-01) vid Kontoret för laboratoriedjurvälfärd vid National Institutes of Health (NIH, USA).
1. Konstruktion av BAT för uttryck av optogenetisk TDP-43-gen från mnr2b-promotorn</stron...

<ol>
	<li>Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+transitions+and+size+scaling+of+membrane-less+organelles.">Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles.</a> Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).</li><li>Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+in+biology.">Liquid-liquid phase separation in biology.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).</li><li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+rna+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development.">Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).</li><li>Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+biophysics+and+neurology:+aberrant+phase+transitions+in+neurodegenerative+disease.">Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).</li><li>Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+ribostasis:+RNA-protein+granules+in+degenerative+disorders.">Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders.</a> Cell. 154 (4), 727-736 (2013).</li><li>Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+genes+in+the+genomic+era+and+their+implications+for+FTD.">ALS genes in the genomic era and their implications for FTD.</a> Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).</li><li>Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+and+therapeutic+potential+of+liquid-liquid+phase+separation+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).</li><li>Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+disorder+in+proteins+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).</li><li>Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rethinking+ALS:+the+FUS+about+TDP-43.">Rethinking ALS: the FUS about TDP-43.</a> Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).</li><li>Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-phaseted+problems+of+TDP-43+in+selective+neuronal+vulnerability+in+ALS.">Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optodroplets.">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optogenetic+induction+of+stress+granules+is+cytotoxic+and+reveals+the+evolution+of+ALS-FTD+pathology.">Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology.</a> Elife. 8, 39578 (2019).</li><li>Mann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Binding+Antagonizes+Neurotoxic+Phase+Transitions+of+TDP-43.">RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43.</a> Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).</li><li>Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+modulation+of+TDP-43+oligomerization+accelerates+ALS-related+pathologies+in+the+spinal+motor+neurons.">Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).</li><li>Otte, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+TDP-43+nucleation+induces+persistent+insoluble+species+and+progressive+motor+dysfunction+in+vivo.">Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo.</a> Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).</li><li>Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mnx+genes+in+endocrine+and+exocrine+pancreas+formation.">Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation.</a> Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).</li><li>Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Mnx+proteins+specify+one+motoneuron+subtype+and+suppress+acquisition+of+interneuron+characteristics.">Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics.</a> Neural Development. 7, 35 (2012).</li><li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).</li><li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish.">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li><li>Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+the+spinal+cord+motor+column+by+BAC+transgenesis+and+gene+trapping+in+zebrafish.">Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function.">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nature Communications. 5, 4925 (2014).</li><li>Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocadherin-mediated+cell+repulsion+controls+the+central+topography+and+efferent+projections+of+the+abducens+nucleus.">Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus.</a> Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).</li><li>Redchuk, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+regulation+of+endogenous+proteins.">Optogenetic regulation of endogenous proteins.</a> Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).</li></ol>

Mnr2b-BAC-medierat uttryck för opTDP-43h och EGFP-TDP-43z i zebrafisk ger en unik möjlighet till levande avbildning av TDP-43 fas övergång i spinal motor nervceller. Den optiska transparensen i kroppsvävnader av zebrafisk larver möjliggör enkel och icke-invasiv optogenetisk stimulering av opTDP-43h. Jämförelser mellan en spinal motor nervceller över tiden visade att den ljusberoende oligomerization av opTDP-43h orsakar dess cytoplasmic kluster, som påminner om ALS patologi.
<p class="jove_content"...

Ribonucleoprotein (RNP) granulat styr en myriad av cellulära aktiviteter i kärnan och cytoplasman genom att montera membranfria skiljeväggar via flytande-flytande fasseparation (LLPS), ett fenomen där en homogen vätska blandas till två distinkta vätskefaser1,2. Den dysreglerade LLPS av RNA-bindande proteiner som normalt fungerar som RNP granulatkomponenter främjar onormal fasövergång, vilket leder till proteinaggregering. Denna process har varit inblandad i neurodevelopmental och neurodegenerativa sjukdomar3,4,5. Den exakta utvärderingen av ett orsakssamband mellan avvikande LLPS av RNA-bindande proteiner och sjukdomspatogenes är avgörande för att avgöra om och hur LLPS kan utnyttjas som ett effektivt terapeutiskt mål. LLPS av RNA-bindande proteiner är relativt lätt att studera in vitro och i encelliga modeller men är svårt i multicellulära organismer, särskilt hos ryggradsdjur. Ett kritiskt krav för att analysera sådan LLPS i enskilda celler i en vävnadsmiljö är att stabilt uttrycka en sond för avbildning och manipulering av LLPS i en sjukdoms sårbar celltyp av intresse.
Amyotrofisk lateral skleros (ALS) är en ytterst dödlig neurologisk sjukdom där motoriska nervceller i hjärnan och ryggmärgen selektivt och gradvis förloras på grund av degeneration. Hittills har mutationer i mer än 25 gener associerats med ärftlig (eller familjär) form av ALS, som står för 5%-10% av de totala ALS-fallen, och några av dessa ALS-orsakande gener kodar RNA-bindande proteiner bestående av RNPs, såsom hnRNPA1, TDP-43 och FUS6,7. Dessutom kännetecknas den sporadiska formen av ALS, som står för 90-95% av de totala ALS-fallen, av den cytoplasmiska aggregeringen av TDP-43 deponeras i degenererande motoriska nervceller. En viktig egenskap hos dessa ALS-associerade RNA-bindande proteiner är deras inneboende oordnade regioner (IDR) eller områden med låg komplexitet som saknar ordnade tredimensionella strukturer och förmedlar svaga protein-proteininteraktioner med många olika proteiner som driver LLPS7,8. Det faktum att ALS-orsakande mutationer ofta förekommer i IDR har lett till tanken att avvikande LLPS och fasövergång av dessa ALS-relaterade proteiner kan ligga till grund för ALS patogenes9,10.
Nyligen utvecklades optoDroplet-metoden, en Cryptochrome 2-baserad optogenetisk teknik som möjliggör modulering av protein-proteininteraktioner med ljus, för att inducera fasövergång av proteiner med IDR11. Eftersom denna teknik har utvidgats framgångsrikt till TDP-43, har det börjat avslöja mekanismerna bakom patologisk fas övergång av TDP-43 och dess associerade cytotoxicitet12,13,14,15. I detta protokoll skisserar vi en genetisk metod för att leverera en optogenetisk TDP-43 till ALS-sårbara celltyper, nämligen spinal motor nervceller i zebrafisk med hjälp av BAC för mnr2b/mnx2b genen kodar ett homeodomain protein för motor neuron specifikation16,17. Zebrafisklarvernas höga genomskinlighet möjliggör enkel, icke-invasiv ljusstimulering av den optogenetiska TDP-43 som utlöser dess fasövergång i ryggradsmotoriska nervceller. Vi presenterar också ett grundläggande arbetsflöde för live imaging av zebrafisk spinal motor nervceller och bildanalys med hjälp av den fritt tillgängliga Fiji / ImageJ programvara för att karakterisera svaren av optogenetic TDP-43 till ljusstimulering. Dessa metoder möjliggör en undersökning av TDP-43 fas övergång i en ALS-sårbar cellulär miljö och bör bidra till att utforska dess patologiska konsekvenser på cellulära och beteendemässiga nivåer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axioimager Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>MEE</td>
			<td>CN-25C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED panel</td>
			<td>Nanoleaf Limited</td>
			<td>Nanoleaf AURORA smarter kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-2plus</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>AD110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond BAC100</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>50181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPlanFL N 20&#215;/1.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Plan-Neofluar 5x/0.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>HIOKI</td>
			<td>3664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical sensor</td>
			<td>HIOKI</td>
			<td>9742-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red solution 0.5%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>R050A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well dish</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer probe BLUE-Wave</td>
			<td>StellerNet Inc.</td>
			<td>VIS-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2725R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa Ex Taq</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish BAC clone CH211-172N16</td>
			<td>BACPAC Genomics</td>
			<td>CH211-172N16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic phase transition of tdp-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae

Onormal protein aggregering och selektiv neuronal sårbarhet är två stora kännetecken för neurodegenerativa sjukdomar. Orsakssamband mellan dessa funktioner kan ifrågasättas genom att kontrollera fasövergången av ett sjukdomsassocierat protein i en sårbar celltyp, även om detta experimentella tillvägagångssätt har begränsats hittills. Här beskriver vi ett protokoll för att inducera fasövergång av RNA/DNA-bindande protein TDP-43 i spinal motor nervceller av zebrafish larver för modellering cytoplasmic aggregering av TDP-43 förekommer i degenererande motor nervceller i amyotrofisk laterala skleros (ALS). Vi beskriver en bakteriell konstgjord kromosom (BAC)-baserade genetisk metod för att leverera en optogenetic TDP-43 variant selektivt till spinal motor nervceller av zebrafish. Zebrafisklarvernas höga genomskinlighet möjliggör fasövergången av den optogenetiska TDP-43 i ryggradsmotoriska nervceller genom en enkel extern belysning med hjälp av en ljusemitterande diod (LED) mot ohämmad fisk. Vi presenterar också ett grundläggande arbetsflöde för live imaging av zebrafisk spinal motor nervceller och bildanalys med fritt tillgängliga Fiji / ImageJ programvara för att karakterisera svar av optogenetic TDP-43 till ljus belysningen. Detta protokoll möjliggör karakterisering av TDP-43 fas övergång och aggregerad bildning i en ALS-sårbar cellulär miljö, vilket bör underlätta en undersökning av dess cellulära och beteendemässiga konsekvenser.

Levande avbildning av optogenetiska och icke-optogenetiska TDP-43-proteiner i mnr2b + spinalmotoriska nervceller av zebrafisk larver För att inducera TDP-43 fas övergång i spinal motor nervceller i zebrafisk, konstruerades en mänsklig TDP-43h som är märkt med mRFP1 och CRY2olig22 vid N- respektive C-termini, och betecknas som opTDP-43h14 (figur 1A). OpTDP-43h genfragment infö...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae at JoVE.com

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Vi beskriver ett protokoll för att inducera fas övergång av TAR DNA-bindande protein 43 (TDP-43) med ljus i spinal motor nervceller med zebrafisk som modell.

Optogenetisk fasövergång av TDP-43 i spinalmotoriska nervceller av zebrafisk larver

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

Så detta protokoll gör det möjligt för oss att inducera patologiska fasövergångar av TDP-43 och ta itu med deras cellulära konsekvens i ryggraden motoriska nervceller in vivo, vilket är relevant för att förstå varför motoriska nervceller degenererar i ALS. På grund av zebrafisklarvernas höga transparens är motorneuronerna i ryggmärgen direkt synliga. Så man kan visualisera det dynamiska beteendet hos TDP-43 som genomgår fasövergångar i en ryggradsmotoriska nervceller.Denna metod erbjuder en ny djurmodell av ALS. Vi tror att alla metoder som kan förhindra ljus inducerad TDP-43 fas övergång och aggregering i denna ALS-modell kan vara en potentiell kandidat för ALS terapi. Andra ALS-relaterade proteiner med inneboende oordnade regioner kan uttryckas för att utforska neurotoxicitet i samband med onormala fasövergångar.Nyckeln till framgång i detta tillvägagångssätt är att uttrycka optogenetic TDP-43 i spinal motor nervceller på giftfri nivå. BAC-transgenes är ett tidskrävande steg, men när du skapar en korrekt transgen fisk är följande steg relativt enklare och enklare. Till att börja med slår du på lysdioden, eller LED-panelen, med hjälp av den tillhörande applikationen installerad på en surfplatta eller telefon.Placera sedan spektrometersonden i en tom brunn i en 6-brunnsfat. Justera sedan LED-lampan med hjälp av applikationen till en våglängd som når en topp på 456 nm. Placera den optiska sensorn för en optisk effektmätare i den tomma brunnen och justera led-lampans effekt.Placera sedan skålen med LED-panelinställningen i en inkubator vid 28 C.För avbildning av zebrafisklarverna som uttrycker optogenetisk TDP-43, dechorionate den dubbeltransgena fisken och bedöva dem i E3-buffert som innehåller 250 g /ml Tricane. Därefter förvärm 1% låg smälttemperatur agaros som innehåller 250 g /ml etyl 3-aminobensoat metansulfonat vid 42 C.Lägg sedan en droppe agaros på glasbasskålen. Diametern på den kupolformade agarosdroppen på glasfatet ska vara 8 till 10 mm.Därefter, med hjälp av en Pasteur pipette, lägg till den sövda fisken till agarosen på den glasbaserade skålen. Minimera mängden E3-buffert som läggs till agaroset tillsammans med fisken. Blanda sedan genom pipettering några gånger.Under stelning av agarosen, håll fisken på sidan med en sprutnål, så att ryggmärgen är i ett lämpligt horisontellt läge. När agarosen har stelnat, tillsätt ett par droppar E3-buffert på den kupolformade agarosmonterade fisken. Använd ett konfokalt mikroskop utrustat med en 20 gånger vatten nedsänkning objektiv, förvärva seriell confocal z-sektioner av ryggmärgen.Inkludera cloaca på fiskens ventrala sida i de områden som är av intresse som en referens för att identifiera och jämföra ryggradssegmenten över tidspunkterna. Så snart avbildningen är klar, använd en sprutnål för att försiktigt knäcka agaroset och ta bort fisken från agaroset. Håll den tid fisken är inbäddad i agaroset så kort som möjligt, även om agarosinbäddning i mindre än 30 minuter inte påverkar fiskens livskraft.Tillsätt 7,5 ml E3-buffert till en brunn av en 6-väl skål och placera den avbildade dubbeltransgena fisken i den brunnen. Placera sedan skålen på LED-panelen, håll skålen och LED-panelen 5 mm ifrån varandra med en distans och slå på den blå LED-lampan. Förvara lite dubbeltransgen fisk i en separat 6-väl skål täckt med aluminiumfolie för unilluminated kontrollfisk.Efter önskad belysningstid avbildade ryggmärgen hos den upplysta fisken som visats tidigare. Cytoplasmic omlokalisering av opTDP-43h i en spinal motor nervceller visualiserades genom att separera z-serien bilder förvärvas vid 48. och 72 timmar efter befruktning i varje EGFP-TDP-43z och opTDP-43h kanal.Från max intensitet projektion bilder av EGFP-TDP-43z, en enda isolerad spinal neuron identifierbar vid båda 48. och 72 timmar efter befruktning valdes. Regioner av intresse som täcker somas av motoriska nervceller fastställdes genom att spåra kanten av EGFP-signalen vid 48.och 72 timmar efter befruktning. Den normaliserade fluorescerande intensiteten längs den stora axeln i soma plottades. Och vid 48 timmar efter befruktning överlappade mönstren för båda signalerna till stor del varandra.Däremot, vid 72 timmar, nåddes toppen för opTDP-43h signal i regionen där EGFP-TDP-43z signalen var låg, vilket indikerar cytoplasmic omlokalisering av opTDP-43h. För att kvantifiera opTDP-43h och EGFP-TDP-43z signaler före och efter blå ljus stimulering, några segment projektion bilder för varje kanal i samma z-serie bilder producerades vid 48. och 72 timmar efter befruktning.Av de fyra mnr2b+-celler som undersöktes visade cell 1, särskilt en mättad EGFP-TDP-43z signal. Relativa mängder opTDP-43h till EGFP-TDP-43z beräknades genom att dividera RFP-värdet med GFP-värdet. Cellerna 2 till 4 visade minskande opTDP-43h nivåer efter blå ljus belysning.Det är viktigt att minimera den tid fisken är inbäddad i agaroset för att hålla dem friska. Genom att justera intensiteten och varaktigheten av LED-belysning kontrollerar vi TDP-43-fasövergången på ett tillfälligt reglerat sätt, vilket kan hjälpa till att dissekera progressionen av patologisk TDP-43-fasövergång i motorisk neuron.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord Video (Video) | JoVE

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato Video (Video) | JoVE

Optogenetic Aktivering av zebrafisk somatosensoriska nervceller med kock-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica Video (Video) | JoVE

Extracellulärt Identifiera motoriska nervceller för en muskel Motor Pool i<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion Video (Video) | JoVE

Optogenetic störning av neural aktivitet med laserbelysning i Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

zebrafisk<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Förberedelse för elektrofysiologiska inspelningar från Spinal sensoriska och motoriska nervceller

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Retrograd neuroanatomiska spårning av Phrenic motoriska nervceller hos möss

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Spåra Drosophila Larval beteende som svar på Optogenetic stimulering av lukt nervceller

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolering och kultur av Oculomotor, trochlear, och spinal motoriska nervceller från prenatal ISLmn: GFP transgena möss

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Mätning av glukosupptag i Drosophila modeller av TDP-43 Proteinopati

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

In vivo Trådlös optogenetisk kontroll av skickligt motoriskt beteende

Fine motor skills are essential in everyday life and can be compromised in several nervous system disorders. The acquisition and performance of these ...