Name: a simple microfluidic chip for long-term growth and imaging of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-04-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Nous remercions le centre d’imagerie CIFF, NCBS pour l’utilisation des microscopes confocaux soutenus par le DST - Centre for Nanotechnology (No. SR/55/NM-36-2005). Nous remercions le financement de la recherche de DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), disque rotatif soutenu par DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK et Gautam Menon), et HHMI-IECS grant number 55007425 (SPK). Les souches HB101, PS3239 et wdIs51 ont été fournies par le Caenorhabditis Genetics Center (CGC), financé par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). S.P.K. a fabriqué jsIs609 dans le laboratoire de Mike Nonet.

1. Fabrication d’un dispositif de croissance et d’imagerie
<ol><li>Fabrication de moules SU8<ol><li>Concevez les modèles 1 (couche d’écoulement) et 2 (couche de contrôle) à l’aide de formes rectangulaires dans un logiciel de traitement de texte (ou un logiciel de CAO de conception assistée par ordinateur) et imprimez les photomasques à l’aide d’un traceur laser d’une taille minimale de 8 μm sur un film à base de polyester (Figure 1).</li>
		<li>Coupez...

<ol>
	<li>Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Mutant+Identification+with+a+One-Step+Whole-Genome-Sequencing+and+SNP+Mapping+Strategy.">C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy.</a> PloS One. 5 (11), 15435 (2010).</li><li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo+neuronal+transport+in+genetic+model+organisms+using+microfluidic+devices.">Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices.</a> Traffic. 12 (4), 372-385 (2011).</li><li>Steele, L. M., Sedensky, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+Anesthetic+Mechanisms:+The+C.+elegans+Model.">Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model.</a> Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).</li><li>C&#225;ceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laterally+orienting+C.+elegans+using+geometry+at+microscale+for+high-throughput+visual+screens+in+neurodegeneration+and+neuronal+development+studies.">Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies.</a> PloS One. 7 (4), 35037 (2012).</li><li>Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+device+for+size+based+separation+of+C.+elegans+developmental+stages.">A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages.</a> Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).</li><li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+on-chip+rapid+microscopy,+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans.">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li><li>Desta, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+and+Trapping+of+a+Single+C.+elegans+Worm+in+a+Microfluidic+Chip+for+Automated+Microplate+Dispensing.">Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing.</a> SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).</li><li>Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+and+High-Throughput+In+Vivo+Drug+Screening+Platforms+Using+Microfluidics.">High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics.</a> Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).</li><li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model.">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7, 13023 (2016).</li><li>Fehlauer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Microfluidics+Device+for+Mechanical+Stimulation+and+High+Resolution+Imaging+of+C.+Elegant.">Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).</li><li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans.">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li><li>Cornaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microfluidic+platform+for+C.+elegans+embryo+arraying,+phenotyping,+and+long-term+live+imaging.">An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging.</a> Scientific Reports. 5, 10192 (2015).</li><li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ultra-thin+chips+for+immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+in+microfluidic+channels+during+irradiation+and+selection+of+buffer+solution+to+prevent+dehydration.">Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).</li><li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-on-a-chip:+microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C.+elegans.">Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Devices+for+Behavioral+Analysis,+Microscopy,+and+Neuronal+Imaging+in+Caenorhabditis+Elegans.">Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1327, 159-179 (2015).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).</li><li>Allen, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans.">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).</li><li>Guo, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies.">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).</li><li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Mitochondrial+Density+and+Positioning+along+a+Growing+Neuronal+Process+in+Individual+C.+elegans+Neuron+Using+a+Long-Term+Growth+and+Imaging+Microfluidic+Device.">Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device.</a> eNeuro. 8 (4), (2021).</li><li>Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+High-Resolution+Imaging+of+Developing+C.+elegans+Larvae+with+Microfluidics.">Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics.</a> Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).</li><li>Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+time-lapse+microscopy+of+C.+Elegans+post-embryonic+development.">Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development.</a> Nature Communications. 7, 12500 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biostable,+anti-fouling+zwitterionic+polyurethane-urea+based+on+PDMS+for+use+in+blood-contacting+medical+devices.">A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices.</a> Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).</li><li>Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+thin+films+as+biocompatible+coatings+for+microfluidic+devices:+cell+culture+and+flow+studies+with+glial+cells.">Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells.</a> Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).</li><li>Folch, A., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+micropatterns+on+biocompatible+materials.">Cellular micropatterns on biocompatible materials.</a> Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).</li><li>Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+PDMS+(polydimethylsiloxane)+bioreactor+for+large-scale+culture+of+hepatocytes.">Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes.</a> Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).</li><li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly(dimethylsiloxane)+bioreactors+during+cell+culture.">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).</li><li>Palchesko, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+and+cell-speci+fi+c+expression+pro+fi+ling+reveal+dynamic+branching+and+molecular+determinants+of+a+multi-dendritic+nociceptor+in+C.+elegans.">Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans.</a> Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Oren-Suissa, M., Hall, D. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+morphogenesis:+worms+get+an+EFF+in+dendritic+arborization.">Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization.</a> Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).</li><li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).</li><li>Sure, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNC-16/JIP3+and+UNC-76/FEZ1+limit+the+density+of+mitochondria+in+C.+elegans+neurons+by+maintaining+the+balance+of+anterograde+and+retrograde+mitochondrial+transport.">UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).</li><li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+distribution+of+mitochondria+in+touch+receptor+neurons+of+C.+elegans+influences+touch+response.">Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response.</a> bioRxiv. , (2020).</li></ol>

Dans cet article, un protocole pour la fabrication et l’utilisation d’un dispositif microfluidique simple pour la croissance de C. elegans avec un approvisionnement constant en nourriture et une imagerie à haute résolution d’un seul animal au cours de son développement a été décrit. Ce processus de fabrication est simple et peut être effectué dans un environnement non stérile. Un environnement sans poussière est essentiel pendant les étapes de fabrication. La présence de particules de poussièr...

Caenorhabditis elegans s’est avéré être un puissant organisme modèle pour étudier la biologie cellulaire, le vieillissement, la biologie du développement et la neurobiologie. Des avantages tels que son corps transparent, son cycle de vie court, son entretien facile, un nombre défini de cellules, son homologie avec plusieurs gènes humains et sa génétique bien étudiée ont permis à C. elegans de devenir un modèle populaire à la fois pour les découvertes en biologie fondamentale et la recherche appliquée 1,2. Comprendre les processus biologiques et développementaux des cellules à partir d’observations répétées à long terme d’animaux individuels peut s’avérer bénéfique. Classiquement, C. elegans est anesthésié sur des tampons de gélose et imagé au microscope. Les effets indésirables des anesthésiques sur la santé des animaux limitent l’utilisation d’animaux anesthésiés pour l’imagerie intermittente à long terme et répétée du même animal 3,4. Les progrès récents des technologies microfluidiques et leur adaptation au piégeage sans anesthésie de C. elegans présentant des risques négligeables pour la santé permettent d’obtenir une imagerie à haute résolution du même animal sur une courte et longue période.
Des puces microfluidiques ont été conçues pour le criblage à haut débit 6,7,8 de C. elegans'5, le piégeage et la distribution9, le criblage de médicaments 10,11, la stimulation neuronale avec imagerie à haute résolution 12 et l’imagerie haute résolution de l’animal 12,13,14. Des feuilles microfluidiques ultra-minces pour l’immobilisation sur lames ont également été développées15. Des études à long terme sur C. elegans ont été réalisées à l’aide d’images à faible résolution d’animaux en culture liquide pour observer la croissance, la dynamique du calcium, les effets des médicaments sur leur comportement16,17,18,19, leur longévité et leur vieillissement20. Des études à long terme utilisant la microscopie à haute résolution ont été menées pour évaluer le développement synaptique21, la régénération neuronale 22 et l’addition mitochondriale23. L’imagerie et le traçage à haute résolution à long terme du devenir et de la différenciation des cellules ont été réalisés dans des dispositifs multicanaux24,25. Plusieurs événements cellulaires et sous-cellulaires se produisent sur des échelles de temps de plusieurs heures et nécessitent de piéger le même individu à différents moments de leur développement pour caractériser toutes les étapes intermédiaires du processus de compréhension de la dynamique cellulaire in vivo. Pour imager des processus biologiques tels que l’organogenèse, le développement neuronal et la migration cellulaire, l’animal doit être immobilisé dans la même orientation à plusieurs moments. Nous avons déjà publié un protocole d’imagerie à haute résolution de C. elegans pendant plus de 36 heures afin de déterminer où les mitochondries sont ajoutées le long des neurones récepteurs tactiles (TRN)23.
Cet article fournit un protocole pour établir une méthodologie basée sur la microfluidique pour l’imagerie répétée à haute résolution. Ce dispositif, avec un seul canal d’écoulement, est le mieux adapté à l’imagerie répétée d’un seul animal par appareil. Pour améliorer le débit et imager plusieurs animaux à la fois, plusieurs appareils pourraient être connectés à la même ligne de pression, mais avec des connecteurs tridirectionnels séparés contrôlant un seul animal dans chaque appareil. La conception est utile pour les études qui nécessitent des images accélérées à haute résolution telles que les processus de développement post-embryonnaire, la migration cellulaire, le transport des organites, les études d’expression génique, etc. La technologie pourrait être limitative pour certaines applications telles que les études sur la durée de vie et le vieillissement qui nécessitent une croissance et une imagerie parallèles de nombreux animaux à un stade avancé. L’élastomère polydiméthylsiloxane (PDMS) a été utilisé pour la fabrication de ce dispositif en raison de sa biostabilité26, de sa biocompatibilité27,28, de sa perméabilité au gazde 29,30 et de son module élastique accordable 31. Ce dispositif à deux couches permet la croissance d’animaux avec un approvisionnement continu en nourriture dans un canal microfluidique et le piégeage de C. elegans individuels via compression membranaire PDMS à l’aide d’azote gazeux. Ce dispositif est une extension du dispositif précédemment publié avec l’avantage de cultiver et d’imager le même animal dans le microcanal sous un approvisionnement alimentaire continu3. Le réseau de membranes d’isolement supplémentaires et une membrane de piégeage de 2 mm de large permettent une immobilisation efficace des animaux en développement. L’appareil a été utilisé pour observer le développement neuronal, le développement vulvaire et l’arborisation dendritique dans les neurones PVD sensoriels. Les animaux grandissent sans effets néfastes sur la santé dans le dispositif et peuvent être immobilisés à plusieurs reprises pour faciliter l’imagerie des événements subcellulaires chez le même animal au cours de son développement.
L’ensemble du protocole est divisé en cinq parties. La partie 1 décrit la fabrication du dispositif pour la puce de croissance et d’imagerie. La partie 2 décrit comment mettre en place un système de pression pour la déviation de la membrane PDMS afin d’immobiliser et d’isoler les individus de C. elegans. La partie 3 décrit comment synchroniser C. elegans sur une plaque de milieu de croissance de nématodes (NGM) pour l’imagerie de dispositifs. La partie 4 décrit comment charger un seul animal dans le dispositif et faire grandir l’animal à l’intérieur du dispositif microfluidique pendant plusieurs jours. La partie 5 décrit comment immobiliser un animal individuel à plusieurs moments, capturer des images haute résolution en utilisant différents objectifs et analyser les images à l’aide de Fidji.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G needles</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Bangalore, India</td>
			<td>Gauge 18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WW-30600-02</td>
			<td>Masterflex fitting with luer lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>EMCCD C9100-13no</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circuit board film</td>
			<td>Fine Line Imaging, Colorado, USA</td>
			<td></td>
			<td>The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Convection Oven</td>
			<td>Meta-Lab Scientific Industries, India</td>
			<td>MSI-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Blue stat microscopic cover glass</td>
			<td></td>
			<td>22mm x 10Gms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hi media</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris uni-core puncher 1mm</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Z708801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Bangalore, India</td>
			<td>440191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>&#160;IKA</td>
			<td>RCT B S 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 5 LIVE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td></td>
			<td>0.5-10 &#181;L micropipette tips are used for food supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Photoresist-1</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU8-2025</td>
			<td>http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Photoresist-2</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU8-2050</td>
			<td>http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Local Supplier</td>
			<td>Commercial nitrogen gas</td>
			<td>Cylinder volume of 7 cubic meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (Curing solution)</td>
			<td>Dow Corning Corporation, MI, USA</td>
			<td>&#160;Sylgard curing solution</td>
			<td>curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Praveen Scientific Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, NY, USA</td>
			<td>&#160;PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor and blades</td>
			<td>Lister surgical Blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Elastomer (Base)</td>
			<td>Dow Corning Corporation, MI, USA</td>
			<td>Sylgard 184 base</td>
			<td>elastomer base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University Wafer, MA, USA</td>
			<td>[100] orientation, 4-inch diameter</td>
			<td>Small pieces (2 mm &#215; 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>SPS-Europe B.V., The Netherlands</td>
			<td>SPIN 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk microscope</td>
			<td>Perkin Elmer ultra-view VOX system</td>
			<td>CSU-X1-A3 N</td>
			<td>The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 developer</td>
			<td>Microchem, MA, USA</td>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Bangalore, India</td>
			<td>448931</td>
			<td>Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp</td>
			<td>Oriel Instruments, Bangalore, India</td>
			<td></td>
			<td>200 Watt and collimated UV light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple microfluidic chip for long-term growth and imaging of caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) s’est avéré être un système modèle précieux pour l’étude des processus biologiques du développement et cellulaires. La compréhension de ces processus biologiques nécessite souvent une imagerie à long terme et répétée du même animal. Les longs temps de récupération associés aux méthodes d’immobilisation conventionnelles effectuées sur des tampons de gélose ont des effets néfastes sur la santé animale, ce qui rend inapproprié l’imagerie répétée du même animal sur de longues périodes. Cet article décrit une conception de puce microfluidique, une méthode de fabrication, un protocole de culture sur puce de C. elegans et trois exemples d’imagerie à long terme pour étudier les processus de développement chez des animaux individuels. La puce, fabriquée avec du polydiméthylsiloxane et collée sur un verre de couverture, immobilise les animaux sur un substrat de verre à l’aide d’une membrane élastomère déviée à l’aide d’azote gazeux. L’immobilisation complète de C. elegans permet une imagerie accélérée robuste des événements cellulaires et subcellulaires sans anesthésie. Une géométrie de canal avec une grande section transversale permet à l’animal de se déplacer librement dans deux membranes d’isolement partiellement scellées permettant la croissance dans le canal avec un approvisionnement continu en nourriture. À l’aide de cette puce simple, l’imagerie de phénomènes de développement tels que la croissance du processus neuronal, le développement vulvaire et l’arborisation dendritique dans les neurones sensoriels PVD, à mesure que l’animal grandit à l’intérieur du canal, peut être effectuée. La puce de croissance et d’imagerie à long terme fonctionne avec une seule conduite de pression, pas de vannes externes, des consommables fluidiques peu coûteux et utilise des protocoles standard de manipulation des vers qui peuvent facilement être adaptés par d’autres laboratoires utilisant C. elegans.

Caractérisation de l’appareil : Le dispositif de croissance et d’imagerie se compose de deux couches PDMS liées ensemble (Figure 1) à l’aide d’une liaison plasma irréversible. La couche d’écoulement (modèle 1) de 10 mm de longueur et de 40 μm ou 80 μm de hauteur nous permet de cultiver l’animal en culture liquide (Figure 1A). La couche de piégeage (motif 2) a une membrane de 2 mm de large (Figure 1B</st...

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A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Le protocole décrit une conception simple de puces microfluidiques et une méthodologie de microfabrication utilisées pour cultiver C. elegans en présence d’un approvisionnement alimentaire continu jusqu’à 36 heures. Le dispositif de croissance et d’imagerie permet également une imagerie intermittente à haute résolution à long terme des processus cellulaires et sous-cellulaires pendant le développement pendant plusieurs jours.

Une puce microfluidique simple pour la croissance à long terme et l’imagerie de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Le principal avantage de cette technique est que l’animal peut grandir librement à l’intérieur de l’appareil et peut être piégé pour une imagerie haute résolution. L’appareil peut être réutilisé plusieurs fois. Lors de la fabrication de l’appareil, la propreté est le facteur le plus important pour pouvoir fabriquer des appareils sans poussière afin d’éviter les fuites pendant le fonctionnement de l’appareil.Pour commencer, concevez le modèle un pour la couche d’écoulement et le motif deux pour la couche de contrôle en utilisant des formes rectangulaires dans un logiciel de traitement de texte et imprimez les masques photo à l’aide d’un traceur laser avec une taille de caractéristique minimale de huit micromètres sur un film à base de polyester. Découpez les plaquettes de silicium en morceaux carrés de 2,5 centimètres de hauteur et de largeur. Nettoyez-les avec de l’hydroxyde de potassium à 20% pendant une minute et rincez les gaufrettes à l’eau désionisée.Utilisez une plaquette pour le flux et l’autre pour la couche de contrôle. Sécher les morceaux avec 14 gaz azotés comprimés P-S-I suivi d’une déshydratation sur une plaque chauffante à 120 degrés Celsius pendant quatre heures. Après refroidissement, prenez un morceau de silicium, placez-le sur le mandrin d’un codeur de spin et allumez le vide pour maintenir la plaquette en place.Mettez environ 20 microlitres d’hexaméthyldisilane sur le morceau de silicium et enduisez-le à l’aide du codeur de spin à 500 R-P-M pendant cinq secondes, suivi de 3000 R-P-M pendant 30 secondes. Pour obtenir une épaisseur de résine photosensible uniforme d’environ 40 micromètres spécifiques à la couche d’écoulement, enduisez la plaquette de silicium d’environ 1,5 millilitre de résine photosensible négative à l’aide d’un codeur de spin à 500 R-P-M pendant cinq secondes, suivi de 2000 R-P-M pendant 30 secondes. Répéter le revêtement de la pièce de silicium avec de l’hexaméthyldisilane et une photorésine négative pour la deuxième plaquette afin d’obtenir une épaisseur de résine photosensible uniforme d’environ 40 micromètres spécifique à la couche de contrôle.Alternativement, pour augmenter l’épaisseur de la couche d’écoulement à environ 80 micromètres pour les animaux plus âgés, enduisez les plaquettes de silicium avec environ 1,5 millilitre de résine photosensible négative deux, en utilisant le codeur de spin à 500 R-P-M pendant cinq secondes suivi de 2000 R-P-M pendant 30 secondes. Faites cuire les deux morceaux de silicone préalablement recouverts de résine photosensible sur une plaque chauffante à 65 degrés Celsius pendant une minute, puis 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après refroidissement, placez des morceaux de silicone cuits doux sur la platine d’exposition de l’illuminateur U-V avec la surface revêtue de résine photosensible face à la lampe U-V.Exposez les deux pièces séparément à U-V pendant 15 secondes à l’aide d’une lampe de 200 watts à travers un masque photo avec les motifs un et deux pour obtenir respectivement les couches de flux et de contrôle. Faites cuire les deux morceaux de silicone exposés comme décrit précédemment avec les couches enduites tournées vers le haut. Après avoir refroidi les pièces, développez les motifs en trempant les pièces de silicone dans la solution de révélateur de résine photosensible pendant 20 minutes.Une fois le motif visible, rincez les morceaux avec de l’alcool isopropylique pur et séchez-les doucement à l’azote gazeux. Gardez les morceaux de silicone dans un dessiccateur avec la surface revêtue vers le haut. Exposez les morceaux aux vapeurs de silane en versant 50 microlitres de T-C-P-F-O-S pur sur une lame de verre.Placez la lame à l’intérieur d’un dessiccateur et incuber pendant deux heures. Faire P-D-M-S dans un gobelet en plastique en mélangeant la base en élastomère avec l’agent durcissant et remuer constamment pendant trois minutes. Dégazez le mélange P-D-M-S dans un dessiccateur pendant 30 minutes pour éliminer toutes les bulles d’air.Placez les plaquettes de silicium de la couche de contrôle dans une boîte de Petri et versez une couche de mélange P-D-M-S de cinq millimètres d’épaisseur sur les morceaux de silicium. Après le processus de coulée P-D-M-S, répétez le dégazage du mélange P-D-M-S. Placez la plaquette de silicium avec couche d’écoulement face au camion de filature en appliquant une pression de vide de 200 à 500 millitorr.Versez environ un millilitre de P-D-M-S sur la tranche de silicium. Encodez-le à l’aide d’un enrobage pour obtenir une couche d’environ 80 micromètres d’épaisseur. Faites cuire les deux plaquettes de silicium avec le P-D-M-S enduit de spin et versez des couches P-D-M-S à 50 degrés Celsius dans un four à convection à air chaud pendant six heures.Après refroidissement, les morceaux coupent la couche P-D-M-S de cinq millimètres d’épaisseur de la pièce de silicium autour de la couche de contrôle à l’aide d’une lame tranchante et décollez-la du substrat de silicium. Poinçonner deux trous d’environ un millimètre de diamètre à l’aide d’une perforeuse Harris au réservoir du bloc P-D-M-S pour connecter le canal d’immobilisation et les entrées du canal d’isolement aux conduites de gaz pour les déviations de membrane P-D-M-S. Placez la pièce de silicium avec la couche P-D-M-S enduite de spin sur le motif un avec la surface revêtue P-D-M-S tournée vers le haut sur un plateau en plastique.Gardez le bloc P-D-M-S perforé avec le motif deux sur le plateau avec le côté moulé vers le haut. Gardez le plateau en plastique à l’intérieur d’un nettoyant plasma et exposez les deux surfaces P-D-M-S à 18 watts de plasma d’air pendant deux minutes en appliquant un faible vide. Retirez les deux blocs traités au plasma et liez-les doucement en pressant les surfaces traitées au plasma des motifs un et deux ensemble.Faites cuire les motifs collés à 50 degrés Celsius pendant deux heures dans un four à convection à air chaud. Après avoir sorti le dispositif collé du four, découpez-le dans une plaquette de silicium avec le motif un et le modèle deux et percez des trous dans les réservoirs d’entrée et de sortie de la couche d’écoulement à l’aide du perforateur Harris. Placez le bloc P-D-M-S collé avec la couche d’écoulement vers le haut sur un plateau en plastique et gardez un verre de couverture propre sur le même plateau.Exposez les blocs dans le verre de couverture à un plasma d’air de 18 watts pendant deux minutes. Ajustez la pression du vide pour voir une chambre violette. Placez le bloc P-D-M-S exposé au plasma sur le verre de couverture et faites cuire la structure collée dans un four à 50 degrés Celsius pendant deux heures.Rangez l’appareil dans une chambre propre pour toute expérience future. Prenez l’appareil, placez-le sur un stéréomicroscope et fixez les tubes. Connectez un tube microflex à une conduite d’azote gazeux comprimé et à un connecteur à trois voies à l’autre extrémité.Connectez respectivement les tubes un et deux des connecteurs à trois voies au piège dans les membranes isolantes. Connectez deux tubes microflexes aux deux orifices de sortie du robinet d’arrêt à trois voies. Connectez l’autre extrémité des deux tubes à une aiguille de calibre 18 de huit millimètres de long.Remplissez la couche d’écoulement avec un tampon M-9 à l’aide d’une micropipette à travers l’orifice d’entrée. Remplissez les deux tubes avec de l’eau désionisée par l’extrémité reliée à l’aiguille. Insérez les deux aiguilles dans les trous perforés reliant la membrane d’isolement et de piégeage.Ouvrez le régulateur d’azote gazeux à 14 P-S-I et tournez la vanne à trois voies du tube un pour pousser l’eau dans l’appareil à travers les canaux microfluidiques dans les couches de contrôle, à savoir le piège et les membranes d’isolement. Relâchez la pression à l’aide du robinet d’arrêt à trois voies, une fois que les canaux sont remplis d’eau et amorcés. Retirez les bulles en faisant circuler des fluides supplémentaires dans le canal d’écoulement.La figure montre des images de P-S-3-2-3-9, animal grandissant à l’intérieur de la puce microfluidique et immobilisé toutes les huit à 10 heures pour capturer des images de fluorescence. La variation du modèle d’expression représente un exemple de régulation génique temporelle où le même gène est exprimé dans différentes cellules à différents stades de développement. L’imagerie du génotype W-D-I-S-5-1 individuel de caenorhabditis elegans montre une architecture dendritique ramifiée de type menorah dans chaque neurone P-V-D comprenant des processus primaires, tertiaires secondaires et quaternaires aux stades de développement L-2, L-2, L-3 et L-4 respectivement.La figure ci-dessous compare les animaux de développement P-V-D et les animaux cultivés par dispositif, et ceux cultivés sur des plaques N-G-M. Le nombre de S-P et de Q-P à différents stades de développement du ver augmentait avec l’âge. Caenorhabditis elegans a été traité avec une goutte de lévamisole à trois millimolaires pour provoquer une paralysie suffisante nécessaire à l’imagerie à haute résolution.Les valeurs de S-P n’étaient pas significativement différentes lorsqu’elles étaient mesurées à partir d’animaux stades similaires cultivés sur des plaques N-G-M et imagées à l’aide de trois millimolaires de lévamisole sur une lame de gélose Agar. De plus, la distance entre les deux corps cellulaires P-V-C, l’un présent dans la queue et le second présent près de la vulve, augmente à mesure qu’ils s’éloignent chez les animaux élevés dans le dispositif et ceux cultivés sur des plaques N-G-M. La figure représente l’image haute résolution des neurones récepteurs tactiles d’animaux poussant à l’intérieur du dispositif microfluidique.Le montage représente l’ensemble du processus neuronal P-L-M-R à des moments successifs mettant en évidence les mitochondries et le processus neuronal. Le graphique représente la longueur totale du processus neuronal qui a été observée pour augmenter avec une pente de 10,4 micromètres par heure. Le dispositif microfabriqué utilise une fine membrane P-D-M-S déviée en présence d’azote gazeux à haute pression pour immobiliser et maintenir les C-elegans en place pour l’imagerie à haute résolution.Cette procédure peut permettre des études longitudinales des processus cellulaires et subcellulaires chez C-elegans qui nécessitent des observations intermittentes sur une longue période de temps.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Méthodes de détection par fluorescence pour les plateformes microfluidiques gouttelettes

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Bio-ingénierie

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

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Simple Dispositifs microfluidiques pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Et le poisson-zèbre

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