Name: a simple microfluidic chip for long-term growth and imaging of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-04-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Wir danken der CIFF-Bildgebungseinrichtung NCBS für die Verwendung der konfokalen Mikroskope, die vom DST - Centre for Nanotechnology (No. SR/55/NM-36-2005). Wir danken den Forschungsmitteln von DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), Spinning Disc unterstützt von DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK und Gautam Menon) und HHMI-IECS grant number 55007425 (SPK). Die Stämme HB101, PS3239 und wdIs51 wurden vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) bereitgestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. S.P.K. stellte jsIs609 in Mike Nonets Labor her.

1. Herstellung von Wachstums- und Bildgebungsgeräten
<ol><li>SU8 Formenbau<ol><li>Entwerfen Sie die Muster 1 (Fließschicht) und 2 (Kontrollschicht) unter Verwendung rechteckiger Formen in einer Textverarbeitungssoftware (oder einer computergestützten Design-CAD-Software) und drucken Sie die Fotomasken mit Hilfe eines Laserplotters mit einer Mindeststrukturgröße von 8 μm auf Polyesterfolie (Abbildung 1).</li>
		<li>Siliziumwafer in 2,5 cm × 2,5 cm große Stücke schn...

<ol>
	<li>Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Mutant+Identification+with+a+One-Step+Whole-Genome-Sequencing+and+SNP+Mapping+Strategy.">C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy.</a> PloS One. 5 (11), 15435 (2010).</li><li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+and+Trapping+of+a+Single+C.+elegans+Worm+in+a+Microfluidic+Chip+for+Automated+Microplate+Dispensing.">Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing.</a> SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).</li><li>Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+and+High-Throughput+In+Vivo+Drug+Screening+Platforms+Using+Microfluidics.">High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics.</a> Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).</li><li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model.">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7, 13023 (2016).</li><li>Fehlauer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Microfluidics+Device+for+Mechanical+Stimulation+and+High+Resolution+Imaging+of+C.+Elegant.">Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. 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Elegans post-embryonic development.</a> Nature Communications. 7, 12500 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biostable,+anti-fouling+zwitterionic+polyurethane-urea+based+on+PDMS+for+use+in+blood-contacting+medical+devices.">A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices.</a> Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).</li><li>Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. 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In dieser Arbeit wurde ein Protokoll für die Herstellung und Verwendung einer einfachen mikrofluidischen Vorrichtung für den Anbau von C. elegans mit konstanter Nahrungszufuhr und hochauflösender Bildgebung eines einzelnen Tieres während seiner Entwicklung beschrieben. Dieser Herstellungsprozess ist einfach und kann in einer nicht sterilen Umgebung durchgeführt werden. Eine staubfreie Umgebung ist während der Fertigungsschritte kritisch. Das Vorhandensein von Staubpartikeln würde zu einem unsachgemäßen ...

Caenorhabditis elegans hat sich als leistungsfähiger Modellorganismus erwiesen, um Zellbiologie, Alterung, Entwicklungsbiologie und Neurobiologie zu untersuchen. Vorteile wie sein transparenter Körper, kurzer Lebenszyklus, einfache Wartung, eine definierte Anzahl von Zellen, Homologie mit mehreren menschlichen Genen und gut untersuchte Genetik haben dazu geführt, dass C. elegans zu einem beliebten Modell sowohl für grundlegende biologische Entdeckungen als auch für angewandte Forschung gewordenist 1,2. Das Verständnis der biologischen und Entwicklungsprozesse von Zellen durch wiederholte Langzeitbeobachtungen einzelner Tiere kann sich als vorteilhaft erweisen. Herkömmlicherweise wird C. elegans auf Agarpads betäubt und unter dem Mikroskop abgebildet. Schädliche Auswirkungen von Anästhetika auf die Gesundheit von Tieren beschränken die Verwendung von betäubten Tieren für die langfristige und wiederholte intermittierende Bildgebung desselben Tieres 3,4. Jüngste Fortschritte in der mikrofluidischen Technologie und ihre Anpassung an das anästhesiefreie Fangen von C. elegans mit vernachlässigbaren Gesundheitsgefahren ermöglichen eine hochauflösende Bildgebung desselben Tieres über einen kurzen und langen Zeitraum.
Mikrofluidische Chips wurden für das Hochdurchsatz-Screening 6,7,8 von C. elegans5, das Fangen und Dosieren 9, das Arzneimittelscreening10,11, die Neuronenstimulation mit hochauflösender Bildgebung 12 und die hochauflösende Bildgebung des Tieres12,13,14 entwickelt. Ultradünne mikrofluidische Folien für die Immobilisierung auf Objektträgern wurden ebenfalls entwickelt15. Langzeitstudien von C. elegans wurden unter Verwendung von niedrig aufgelösten Bildern von Tieren durchgeführt, die in flüssiger Kultur wachsen, um Wachstum, Kalziumdynamik, Arzneimittelwirkungen auf ihr Verhalten16,17,18,19, ihre Langlebigkeit und Alterung20 zu beobachten. Langzeitstudien mit hochauflösender Mikroskopie wurden durchgeführt, um die synaptische Entwicklung21, die neuronale Regeneration 22 und die mitochondriale Addition23 zu bewerten. Langfristige hochauflösende Bildgebung und Verfolgung des Zellschicksals und der Zelldifferenzierung wurden in Mehrkanalgerätendurchgeführt 24,25. Mehrere zelluläre und subzelluläre Ereignisse treten über Zeitskalen von mehreren Stunden auf und erfordern das Einfangen desselben Individuums zu verschiedenen Zeitpunkten während ihrer Entwicklung, um alle Zwischenschritte im Prozess zu charakterisieren, um die zelluläre Dynamik in vivo zu verstehen. Um biologische Prozesse wie Organogenese, neuronale Entwicklung und Zellmigration abzubilden, muss das Tier zu mehreren Zeitpunkten in der gleichen Ausrichtung immobilisiert werden. Wir haben zuvor ein Protokoll für hochauflösende Bildgebung von C. elegans für mehr als 36 Stunden veröffentlicht, um zu bestimmen, wo Mitochondrien entlang der Berührungsrezeptorneuronen (TRNs) hinzugefügt werden23.
Dieses Papier enthält ein Protokoll zur Etablierung einer mikrofluidikbasierten Methodik für wiederholte hochauflösende Bildgebung. Dieses Gerät mit einem einzigen Strömungskanal eignet sich am besten für die wiederholte Abbildung eines einzelnen Tieres pro Gerät. Um den Durchsatz zu verbessern und viele Tiere gleichzeitig abzubilden, können mehrere Geräte an dieselbe Druckleitung angeschlossen werden, jedoch mit separaten Drei-Wege-Anschlüssen, die ein einzelnes Tier in jedem Gerät steuern. Das Design ist nützlich für Studien, die hochauflösende Zeitrafferbilder erfordern, wie postembryonale Entwicklungsprozesse, Zellmigration, Organellentransport, Genexpressionsstudien usw. Die Technologie könnte für einige Anwendungen wie Lebensdauer- und Alterungsstudien, die paralleles Wachstum und Bildgebung vieler Tiere im Spätstadium erfordern, einschränkend sein. Polydimethylsiloxan (PDMS) -Elastomer wurde aufgrund seiner Biostabilität26, Biokompatibilität 27,28, Gaspermeabilität 29,30 und des abstimmbaren Elastizitätsmoduls 31 zur Herstellung dieses Geräts verwendet. Diese zweischichtige Vorrichtung ermöglicht das Wachstum von Tieren mit kontinuierlicher Nahrungszufuhr in einem mikrofluidischen Kanal und das Einfangen einzelner C. elegans mittels PDMS-Membrankompression mit Stickstoffgas. Dieses Gerät ist eine Erweiterung des zuvor veröffentlichten Geräts mit dem Vorteil, das gleiche Tier im Mikrokanal unter einer kontinuierlichen Nahrungszufuhr zu züchten und abzubilden3. Das zusätzliche Isoliermembrannetz und eine 2 mm breite Fangmembran ermöglichen eine effiziente Immobilisierung von sich entwickelnden Tieren. Das Gerät wurde verwendet, um neuronale Entwicklung, Vulvaentwicklung und dendritische Arborisierung in sensorischen PVD-Neuronen zu beobachten. Die Tiere wachsen ohne gesundheitsschädliche Auswirkungen im Gerät und können wiederholt immobilisiert werden, um die Bildgebung subzellulärer Ereignisse im selben Tier während seiner Entwicklung zu erleichtern.
Das gesamte Protokoll gliedert sich in fünf Teile. Teil 1 beschreibt die Geräteherstellung für den Wachstums- und Bildgebungschip. Teil 2 beschreibt, wie ein Drucksystem für die PDMS-Membranauslenkung eingerichtet wird, um einzelne C. elegans zu immobilisieren und zu isolieren. Teil 3 beschreibt, wie C. elegans auf einer Nematoden-Wachstumsmedium-Platte (NGM) für die Gerätebildgebung synchronisiert wird. Teil 4 beschreibt, wie man ein einzelnes Tier in das Gerät lädt und das Tier mehrere Tage lang in das mikrofluidische Gerät züchtet. Teil 5 beschreibt, wie man ein einzelnes Tier zu mehreren Zeitpunkten immobilisiert, hochauflösende Bilder mit verschiedenen Zielen aufnimmt und die Bilder mit Fidschi analysiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G needles</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Bangalore, India</td>
			<td>Gauge 18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WW-30600-02</td>
			<td>Masterflex fitting with luer lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>EMCCD C9100-13no</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circuit board film</td>
			<td>Fine Line Imaging, Colorado, USA</td>
			<td></td>
			<td>The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Convection Oven</td>
			<td>Meta-Lab Scientific Industries, India</td>
			<td>MSI-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Blue stat microscopic cover glass</td>
			<td></td>
			<td>22mm x 10Gms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hi media</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris uni-core puncher 1mm</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Z708801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Bangalore, India</td>
			<td>440191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>&#160;IKA</td>
			<td>RCT B S 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 5 LIVE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td></td>
			<td>0.5-10 &#181;L micropipette tips are used for food supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Photoresist-1</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU8-2025</td>
			<td>http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Photoresist-2</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU8-2050</td>
			<td>http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Local Supplier</td>
			<td>Commercial nitrogen gas</td>
			<td>Cylinder volume of 7 cubic meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (Curing solution)</td>
			<td>Dow Corning Corporation, MI, USA</td>
			<td>&#160;Sylgard curing solution</td>
			<td>curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Praveen Scientific Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, NY, USA</td>
			<td>&#160;PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor and blades</td>
			<td>Lister surgical Blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Elastomer (Base)</td>
			<td>Dow Corning Corporation, MI, USA</td>
			<td>Sylgard 184 base</td>
			<td>elastomer base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University Wafer, MA, USA</td>
			<td>[100] orientation, 4-inch diameter</td>
			<td>Small pieces (2 mm &#215; 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>SPS-Europe B.V., The Netherlands</td>
			<td>SPIN 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk microscope</td>
			<td>Perkin Elmer ultra-view VOX system</td>
			<td>CSU-X1-A3 N</td>
			<td>The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 developer</td>
			<td>Microchem, MA, USA</td>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Bangalore, India</td>
			<td>448931</td>
			<td>Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp</td>
			<td>Oriel Instruments, Bangalore, India</td>
			<td></td>
			<td>200 Watt and collimated UV light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple microfluidic chip for long-term growth and imaging of caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) haben sich als wertvolles Modellsystem zur Untersuchung entwicklungs- und zellbiologischer Prozesse erwiesen. Um diese biologischen Prozesse zu verstehen, ist oft eine langfristige und wiederholte Bildgebung desselben Tieres erforderlich. Lange Erholungszeiten, die mit herkömmlichen Immobilisierungsmethoden auf Agarpads verbunden sind, haben schädliche Auswirkungen auf die Tiergesundheit, so dass es unangemessen ist, dasselbe Tier über lange Zeiträume hinweg wiederholt abzubilden. Dieser Artikel beschreibt ein mikrofluidisches Chipdesign, eine Herstellungsmethode, ein On-Chip-C . elegans-Kulturprotokoll und drei Beispiele für Langzeitbildgebung zur Untersuchung von Entwicklungsprozessen bei einzelnen Tieren. Der mit Polydimethylsiloxan hergestellte und auf einem Deckglas verklebte Chip immobilisiert Tiere auf einem Glassubstrat mit einer Elastomermembran, die mit Stickstoffgas abgelenkt wird. Die vollständige Immobilisierung von C. elegans ermöglicht eine robuste Zeitraffer-Bildgebung von zellulären und subzellulären Ereignissen in einer anästhesiefreien Weise. Eine Kanalgeometrie mit großem Querschnitt ermöglicht es dem Tier, sich innerhalb von zwei teilweise abgedichteten Isolationsmembranen frei zu bewegen, was ein Wachstum im Kanal mit kontinuierlicher Nahrungszufuhr ermöglicht. Mit diesem einfachen Chip kann die Bildgebung von Entwicklungsphänomenen wie neuronalem Prozesswachstum, Vulvaentwicklung und dendritischen Arborisation in den PVD-sensorischen Neuronen durchgeführt werden, wenn das Tier im Kanal wächst. Der Langzeitwachstums- und Bildgebungschip arbeitet mit einer einzigen Druckleitung, ohne externe Ventile, kostengünstigen fluidischen Verbrauchsmaterialien und verwendet Standard-Schneckenbehandlungsprotokolle, die von anderen Labors mit C. elegans leicht angepasst werden können.

Gerätecharakterisierung: Das Wachstums- und Bildgebungsgerät besteht aus zwei PDMS-Schichten, die mittels irreversibler Plasmabindung miteinander verbunden sind (Abbildung 1). Die Fließschicht (Muster 1), die 10 mm lang und 40 μm oder 80 μm hoch ist, ermöglicht es uns, das Tier in flüssiger Kultur zu züchten (Abbildung 1A). Die Fangschicht (Muster 2) hat eine 2 mm breite Membran (Abbildung 1B) zur Immobilis...

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A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Das Protokoll beschreibt ein einfaches mikrofluidisches Chipdesign und eine Mikrofabrikationsmethodik, die verwendet wird, um C. elegans in Gegenwart einer kontinuierlichen Nahrungszufuhr für bis zu 36 h zu züchten. Das Wachstums- und Bildgebungsgerät ermöglicht auch eine intermittierende langfristige hochauflösende Bildgebung von zellulären und subzellulären Prozessen während der Entwicklung für mehrere Tage.

Ein einfacher mikrofluidischer Chip für Langzeitwachstum und Bildgebung von Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Tier frei im Gerät wachsen kann und für hochauflösende Bildgebung gefangen werden kann. Das Gerät kann mehrfach wiederverwendet werden. Bei der Herstellung des Geräts ist die Sauberkeit der wichtigste Faktor, um staubfreie Geräte herstellen zu können, um Leckagen während des Gerätebetriebs zu vermeiden.Entwerfen Sie Muster eins für die Fließschicht und Muster zwei für die Kontrollschicht mit rechteckigen Formen in einer Textverarbeitungssoftware und drucken Sie die Fotomasken mit Hilfe eines Laserplotters mit einer minimalen Strukturgröße von acht Mikrometern auf Polyesterfolie. Schneiden Sie Siliziumwafer in quadratische Stücke von 2,5 Zentimetern Höhe und Breite. Reinigen Sie sie eine Minute lang mit 20% Kaliumhydroxid und spülen Sie die Wafer in entionisiertem Wasser ab.Verwenden Sie einen Wafer für den Fluss und den anderen für die Kontrollschicht. Trocknen Sie die Stücke mit 14 P-S-I komprimiertem Stickstoffgas und anschließender Dehydratisierung auf einer Heizplatte bei 120 Grad Celsius für vier Stunden. Nehmen Sie nach dem Abkühlen ein Siliziumstück, legen Sie es auf das Futter eines Spin-Coders und schalten Sie das Vakuum ein, um den Wafer an Ort und Stelle zu halten.Geben Sie etwa 20 Mikroliter Hexamethyldisilan auf das Silikonstück und beschichten Sie es mit dem Spin-Coder bei 500 R-P-M für fünf Sekunden und anschließend 3000 R-P-M für 30 Sekunden. Um eine gleichmäßige Fotolackdicke von etwa 40 Mikrometern spezifisch für die Fließschicht zu erhalten, beschichten Sie den Siliziumwafer mit etwa 1,5 Milliliter negativem Fotolack mit einem Spin-Coder bei 500 R-P-M für fünf Sekunden, gefolgt von 2000 R-P-M für 30 Sekunden. Wiederholen Sie die Beschichtung des Siliziumstücks mit Hexamethyldisilan und negativem Fotolack für den zweiten Wafer, um eine gleichmäßige Fotolackdicke von etwa 40 Mikrometern zu erhalten, die für die Kontrollschicht spezifisch ist.Alternativ können zur Erhöhung der Dicke der Fließschicht auf etwa 80 Mikrometer für ältere Tiere Siliziumwafer mit etwa 1,5 Milliliter negativem Fotolack zwei beschichtet werden, wobei der Spin-Coder bei 500 R-P-M für fünf Sekunden gefolgt von 2000 R-P-M für 30 Sekunden verwendet wird. Backen Sie die beiden zuvor fotolackbeschichteten Silikonstücke auf einer heißen Platte bei 65 Grad Celsius für eine Minute, gefolgt von 95 Grad Celsius für 10 Minuten. Legen Sie nach dem Abkühlen weich gebackene Silikonstücke auf die Belichtungsstufe der U-V-Beleuchtung, wobei die fotolackbeschichtete Oberfläche der U-V-Lampe zugewandt ist.Besetzen Sie die beiden Teile 15 Sekunden lang separat U-V mit einer 200-Watt-Lampe durch eine Fotomaske mit den Mustern eins und zwei, um Fluss- bzw. Kontrollschichten zu erhalten. Backen Sie die beiden freiliegenden Silikonstücke wie zuvor beschrieben mit beschichteten Schichten nach oben. Nach dem Abkühlen der Teile entwickeln Sie die Muster, indem Sie die Silikonstücke 20 Minuten lang in der Fotolack-Entwicklerlösung einweichen.Sobald das Muster sichtbar ist, spülen Sie die Stücke mit reinem Isopropylalkohol ab und föhnen Sie sie vorsichtig mit Stickstoffgas trocken. Bewahren Sie die Silikonstücke in einem Exsikkator mit der beschichteten Oberfläche nach oben auf. Setzen Sie die Teile Silandämpfen aus, indem Sie 50 Mikroliter reines T-C-P-F-O-S auf einen Glasobjektträger gießen.Legen Sie den Objektträger in einen Exsikkator und inkubieren Sie ihn zwei Stunden lang. Machen Sie P-D-M-S in einem Plastikbecher, indem Sie die Elastomerbasis mit dem Härter mischen und drei Minuten lang ständig umrühren. Entgasen Sie die P-D-M-S-Mischung in einem Exsikkator für 30 Minuten, um alle Luftblasen zu entfernen.Legen Sie die Kontrollschicht Siliziumwafer in eine Petrischale und gießen Sie eine fünf Millimeter dicke P-D-M-S-Mischschicht auf die Siliziumstücke. Nach dem P-D-M-S-Gießvorgang wiederholen Sie die Entgasung der P-D-M-S-Mischung. Legen Sie den Siliziumwafer mit der Fließschicht dem Spinnerwagen zugewandt und legen Sie einen Vakuumdruck von 200 bis 500 Millitorr auf.Gießen Sie etwa einen Milliliter P-D-M-S auf den Siliziumwafer. Kodieren Sie es mit einem Spin-Coater, um eine etwa 80 Mikrometer dicke Schicht zu erhalten. Die beiden Siliziumwafer mit dem spinbeschichteten P-D-M-S backen und P-D-M-S-Schichten bei 50 Grad Celsius in einem Heißluftkonvektionsofen sechs Stunden lang gießen.Nach dem Abkühlen schneiden die Stücke mit einer scharfen Klinge die fünf Millimeter dicke P-D-M-S-Schicht aus dem Silikonstück um die Kontrollschicht und ziehen sie vom Siliziumsubstrat ab. Stanzen Sie zwei Löcher mit einem Durchmesser von etwa einem Millimeter mit einem Harris-Locher am Reservoir des P-D-M-S-Blocks, um den Immobilisierungskanal und die Isolationskanaleinlässe mit den Gasleitungen für P-D-M-S-Membranauslenkungen zu verbinden. Legen Sie das Silikonstück mit der spinbeschichteten P-D-M-S-Schicht auf Muster eins, wobei die P-D-M-S-beschichtete Oberfläche nach oben auf eine Kunststoffschale zeigt.Halten Sie den gestanzten P-D-M-S-Block mit Muster zwei auf dem Tablett mit geformter Seite nach oben. Halten Sie die Kunststoffschale in einem Plasmareiniger und setzen Sie die beiden P-D-M-S-Oberflächen zwei Minuten lang 18 Watt Luftplasma aus, indem Sie niedriges Vakuum anwenden. Nehmen Sie die beiden plasmabehandelten Blöcke heraus und binden Sie die Blöcke vorsichtig, indem Sie die plasmabehandelten Oberflächen der Muster eins und zwei zusammendrücken.Backen Sie die gebundenen Muster bei 50 Grad Celsius für zwei Stunden in einem Heißluftkonvektionsofen. Nachdem Sie das geklebte Gerät aus dem Ofen genommen haben, schneiden Sie es aus Siliziumwafern mit Muster eins und Muster zwei und stanzen Sie mit dem Harris-Locher Löcher in die Einlass- und Auslassbehälter der Fließschicht. Legen Sie den geklebten P-D-M-S-Block mit der Fließschicht nach oben auf eine Kunststoffschale und bewahren Sie ein sauberes Deckglas auf derselben Schale auf.Setzen Sie die Blöcke im Deckglas zwei Minuten lang 18 Watt Luftplasma aus. Stellen Sie den Vakuumdruck ein, um eine violette Kammer zu sehen. Legen Sie den plasmaexponierten P-D-M-S-Block auf das Deckglas und backen Sie die gebundene Struktur in einem Ofen bei 50 Grad Celsius für zwei Stunden.Lagern Sie das Gerät in einer sauberen Kammer für zukünftige Experimente. Nehmen Sie das Gerät, legen Sie es auf ein Stereomikroskop und befestigen Sie die Schläuche. Schließen Sie einen Microflex-Schlauch an eine komprimierte Stickstoffgasleitung und einen Drei-Wege-Stecker am anderen Ende an.Verbinden Sie Rohre eins und zwei der Drei-Wege-Verbinder mit der Falle in Isoliermembranen. Verbinden Sie zwei Microflex-Schläuche mit den beiden Auslassanschlüssen des Dreiwegehahns. Verbinden Sie das andere Ende der beiden Röhrchen mit einer acht Millimeter langen 18-Gauge-Nadel.Füllen Sie die Fließschicht mit M-9-Puffer mit einer Mikropipette durch den Einlassanschluss. Füllen Sie beide Röhrchen mit entionisiertem Wasser durch das Ende, das mit der Nadel verbunden ist. Führen Sie die beiden Nadeln in die gestanzten Löcher ein, die die Isolier- und Fangmembran verbinden.Öffnen Sie den Stickstoffgasregler bei 14 P-S-I und drehen Sie das Dreiwegeventil von Rohr eins, um das Wasser durch die mikrofluidischen Kanäle in den Kontrollschichten, nämlich die Fallen- und Isolationsmembranen, in das Gerät zu drücken. Lassen Sie den Druck mit dem Dreiwegehahn ab, sobald die Kanäle mit Wasser gefüllt und grundiert sind. Entfernen Sie die Blasen, indem Sie zusätzliche Medien durch den Strömungskanal fließen lassen.Die Abbildung zeigt Bilder von P-S-3-2-3-9, einem Tier, das im mikrofluidischen Chip wächst und alle acht bis 10 Stunden immobilisiert wird, um Fluoreszenzbilder aufzunehmen. Die Variation des Expressionsmusters stellt ein Beispiel für die zeitliche Genregulation dar, bei der dasselbe Gen in verschiedenen Zellen in verschiedenen Entwicklungsstadien exprimiert wird. Die Bildgebung des individuellen W-D-I-S-5-1-Genotyps von Caenorhabditis elegans zeigt eine menoraartige verzweigte dendritische Architektur in jedem P-V-D-Neuron, die primäre, sekundäre tertiäre und quartäre Prozesse in den Entwicklungsstadien L-2, Late L-2, L-3 und L-4 umfasst.Die hierin enthaltene Abbildung vergleicht P-V-D-Entwicklung und in Geräten gezüchtete Tiere mit solchen, die auf N-G-M-Platten gezüchtet wurden. Die Anzahl von S-P und Q-P in verschiedenen Stadien der Wurmentwicklung nahm mit dem Alter zu. Caenorhabditis elegans wurde mit einem Tropfen von drei Millimolar Levamisol behandelt, um eine ausreichende Lähmung zu verursachen, die für hochauflösende Bildgebung erforderlich ist.Die S-P-Werte unterschieden sich nicht signifikant, wenn sie von ähnlichen inszenierten Tieren gemessen wurden, die auf N-G-M-Platten gezüchtet und mit drei Millimolar-Levamisol auf einem Agar-Objektträger abgebildet wurden. Darüber hinaus vergrößert sich der Abstand zwischen den beiden P-V-C-Zellkörpern, von denen einer im Schwanz und der zweite in der Nähe der Vulva vorhanden ist, wenn sie sich sowohl bei den im Gerät gewachsenen Tieren als auch bei denen, die auf N-G-M-Platten gezüchtet wurden, auseinander bewegen. Die Abbildung stellt das hochauflösende Bild von Berührungsrezeptor-Neuronen von Tieren dar, die im mikrofluidischen Gerät wachsen.Die Montage stellt den gesamten neuronalen P-L-M-R-Prozess zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten dar und hebt die Mitochondrien und den neuronalen Prozess hervor. Die Grafik stellt die gesamte neuronale Prozesslänge dar, die mit einer Steigung von 10,4 Mikrometern pro Stunde zunimmt. Das mikrogefertigte Gerät verwendet eine dünne P-D-M-S-Membran, die in Gegenwart von Hochdruck-Stickstoffgas abgelenkt wird, um C-Elegane für hochauflösende Bildgebung zu immobilisieren und an Ort und Stelle zu halten.Dieses Verfahren kann longitudinale Studien von zellulären und subzellulären Prozessen in C-elegans ermöglichen, die intermittierende Beobachtungen über einen langen Zeitraum erfordern.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Forschung

Biotechnik

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Einfache mikrofluidischen Systemen für<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging der<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Und Zebrafisch

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Mikrofluidischen Chip Herstellung und Verfahren zur Influenza Detect

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Langzeit-Intravitalimmunfluoreszenz-Imaging von Gewebematrix Bestandteile mit Epifluoreszenz und Zwei-Photonen-Mikroskopie

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

Eines mikrofluidischen Chips für ICPMS Probenaufgabe

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Die Multi-Organ Chip - Ein Mikrofluidik-Plattform für langfristige Multi-Gewebe Cokultur

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electro Studium der Lungenkrebszellen unter Verwendung eines Mehrkanal-Zwei elektrischen Feldes Mikrofluidik-Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

Langfristige Live Imaging-Gerät für verbesserte experimentelle Manipulation von Zebrafischlarven

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...